曹璟，吳鵬，王斌，曹利維，郭蕊，江硯芳

國藥集團(tuán)上海血液制品有限公司，上海 200051

靜注人免疫球蛋白（pH 4）［human immunoglobulin（pH 4）for intravenous injection，IGIV，簡稱靜丙］是由不少于1 000 名獻(xiàn)血漿者捐獻(xiàn)的健康人血漿為原料制備的免疫球蛋白G 純化濃縮劑，臨床上廣泛應(yīng)用于各種原發(fā)性免疫球蛋白缺陷病及自身免疫性疾病的治療［1-3］，隨著COVID-19 全球大流行，靜丙也被用于COVID-19 的治療［4-7］，我國新冠診療方案中明確提及了其適應(yīng)證和推薦使用劑量［8］。

選擇性免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）缺乏癥患者在臨床使用IgA 殘留量高的靜丙時可能會引起不良反應(yīng)［9-12］。我國血液制品廠家主要采用低溫乙醇蛋白分離工藝進(jìn)行靜丙生產(chǎn)，在《中國藥典》三部（2020 版）正式實施前，大多數(shù)企業(yè)未采取專門措施控制IgA 殘留量，產(chǎn)品中IgA 檢測值一般為200 ～400 μg/mL［13-14］。近年來，國內(nèi)已有部分企業(yè)采用增加層析步驟來降低產(chǎn)品中IgA 殘留量［15-16］，本公司采用能夠去除IgA 的A 濾板和B 濾膜兩種過濾材質(zhì)分別對不同分離階段蛋白組分進(jìn)行過濾以降低產(chǎn)品中IgA 殘留量。本研究對兩種優(yōu)化工藝生產(chǎn)批次與正常工藝生產(chǎn)批次的靜丙關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行檢測，評價兩種優(yōu)化方法的工藝穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 樣品 靜注人免疫球蛋白（pH 4）為本公司采用低溫乙醇工藝制備，其中3 批次使用A 濾板過濾（批號：001 ～003），3 批次使用B 濾膜過濾（批號：004 ～006），42批次使用常規(guī)濾板過濾（批號：007 ～050）。

1.2 主要試劑及儀器 95%醫(yī)用乙醇購自吉林新天龍實業(yè)股份有限公司；助濾劑購自臨江益瑞石硅藻土有限公司；pH 計（梅特勒FE20K0）購自梅特勒-托利多公司；電導(dǎo)率儀（雷磁DDSJ-308F）購自江蘇迅迪儀器科技有限公司；紫外分光光度計（島津UV1800）購自日本島津制作所；高效液相色譜儀（Thermo Ultimate 3000）購自美國賽默飛公司；酶標(biāo)儀（德鐵HBS-1096B）購自南京德鐵實驗設(shè)備有限公司；A濾板（BECO PR Steril40）購自美國EATON公司；B濾膜（EmphazeTMAEX HP）購自美國3M公司。

1.3 工藝的優(yōu)化 靜丙優(yōu)化制備工藝為：血漿經(jīng)低溫乙醇蛋白組分分離、蛋白組分過濾（采用A 濾板或B濾膜）、超濾、病毒滅活、配制和除菌分裝等步驟。

1.4 成品檢定

1.4.1 物理檢定 按照《中國藥典》三部（2020 版）要求對優(yōu)化工藝及正常工藝制備的靜丙進(jìn)行外觀、可見異物、不溶性微粒檢查及熱穩(wěn)定性試驗［17］。外觀應(yīng)為無色或淡黃色澄清液體，可帶輕乳光，不應(yīng)出現(xiàn)渾濁；另3項依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。

1.4.2 化學(xué)檢定

1.4.2.1 蛋白質(zhì)含量 按照《中國藥典》三部（2020版）通則0731第一法進(jìn)行檢測［17］。

1.4.2.2 IgA殘留量 按照《中國藥典》三部（2020版）通則3428第一法進(jìn)行檢測［17］。

1.4.2.3 分子大小分布 按照《中國藥典》三部（2020版）通則3122進(jìn)行檢測［17］。

1.4.2.4 純度 按照《中國藥典》三部（2020版）通則0541第二法進(jìn)行檢測［17］。

1.4.2.5 抗體效價 抗-HBs、白喉抗體、激肽釋放酶原激活劑（prokallikrein activator，PKA）、抗補(bǔ)體活性（anti-complement activity，ACA）、抗-A 和抗-B 血凝素均按照《中國藥典》三部（2020版）要求進(jìn)行檢測［17］。

1.5 穩(wěn)定性檢測

1.5.1 加速穩(wěn)定性 將工藝優(yōu)化的各3 批次靜丙于23 ～27 ℃，相對濕度50%～70%條件下放置6 個月，分別于0、6月取樣，檢測各項質(zhì)量指標(biāo)。

1.5.2 長期穩(wěn)定性 將工藝優(yōu)化的各3 批次靜丙于2 ～8 ℃放置24個月，分別于0、12、24月取樣，檢測各項質(zhì)量指標(biāo)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 利用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗或方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成品檢定

2.1.1 物理檢定 采用A 濾板、B 濾膜生產(chǎn)的靜丙與正常工藝生產(chǎn)批次相比，成品物理檢查項目無明顯變化，均符合《中國藥典》三部（2020版）規(guī)定。

2.1.2 化學(xué)檢定 采用A 濾板和B 濾膜生產(chǎn)的靜丙與正常工藝生產(chǎn)批次相比，IgA 殘留量均顯著下降（t分別為3.992和11.215，P均＜0.05），其余檢定項目（蛋白質(zhì)含量、純度、分子大小分布、抗-HBS、白喉抗體、ACA）差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（A濾板：t分別為-0.205、-0.204、0.191、1.524、-0.269、-0.981，P均＞0.05；B濾膜：t分別為-1.703、-0.757、-2.364、1.029、-0.269、-1.755，P均＞0.05），均符合《中國藥典》三部（2020版）的規(guī)定。見表1。

表1 成品化學(xué)檢定結(jié)果的比較（±s）Tab.1 Comparison of chemical verification items of finished products（±s）

表1 成品化學(xué)檢定結(jié)果的比較（±s）Tab.1 Comparison of chemical verification items of finished products（±s）

檢測項目蛋白質(zhì)含量（g/L）純度（%）分子大小分布（%）抗-HBS（IU/g蛋白質(zhì)）白喉抗體（HAU/g蛋白質(zhì)）PKA（IU/mL）ACA（%）抗-A、抗-B血凝素IgA殘留量（μg/mL）檢測標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)不低于50應(yīng)不低于蛋白質(zhì)總量的95.0%IgG單體與二聚體含量之和應(yīng)不低于95.0%應(yīng)不低于6.0應(yīng)不低于3.0應(yīng)不高于35應(yīng)不高于50應(yīng)不高于1∶64≤400 A濾板生產(chǎn)批次（n=3）51.9±0.2 99.5±0.1 98.4±0.3 12.0±2.1 15.4±0.0＜10 34.0±5.0 1∶16、1∶8 194.8±45.3 B濾膜生產(chǎn)批次（n=3）52.3±0.1 99.6±0.2 98.7±0.3 15.5±6.5 15.4±0.0＜10 30.7±4.2 1∶16、1∶8 70.9±40.2正常生產(chǎn)批次（n=42）51.9±0.5 99.5±0.1 98.4±0.2 22.9±12.3 14.2±7.8＜10 30.7±5.8 1∶16、1∶8 264.5±28.2

2.2 穩(wěn)定性

2.2.1 加速穩(wěn)定性 與0個月相比，采用A濾板、B濾膜生產(chǎn)的靜丙于23 ～27 ℃，相對濕度50%～70%條件下放置6 個月，外觀、可見異物、熱穩(wěn)定性試驗結(jié)果均無變化；蛋白質(zhì)含量、純度、分子大小分布、抗-HBs、白喉抗體、ACA、IgA殘留量均無明顯變化（A濾板：t分別為-0.500、-1.000、2.690、0.039、-2.000、0.125、0.332，P均＞0.05；B 濾膜：t分別為0.316、0.000、2.306、0.052、1.732、0.092、-0.107，P均＞0.05），滿足《中國藥典》三部（2020版）的規(guī)定。見表2。

表2 加速穩(wěn)定性試驗結(jié)果（±s，n=3）Tab.2 Accelerated stability results（±s，n=3）

表2 加速穩(wěn)定性試驗結(jié)果（±s，n=3）Tab.2 Accelerated stability results（±s，n=3）

檢測項目蛋白質(zhì)含量（g/L）純度（%）分子大小分布（%）抗-HBS（IU/g蛋白質(zhì)）白喉抗體（HAU/g蛋白質(zhì)）PKA（IU/mL）ACA（%）抗-A、抗B血凝素IgA殘留量（μg/mL）檢測標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)不低于50應(yīng)不低于蛋白質(zhì)總量的95.0%IgG單體與二聚體含量之和應(yīng)不低于95.0%應(yīng)不低于6.0應(yīng)不低于3.0應(yīng)不高于35應(yīng)不高于50應(yīng)不高于1∶64≤400 A濾板生產(chǎn)批次0個月51.9±0.2 99.5±0.1 98.4±0.3 12.0±2.1 15.4±0.0＜10 34.0±5.0 1∶16、1∶8 194.8±45.3 6個月51.8±0.2 99.6±0.0 97.8±0.2 12.0±2.1 15.3±0.1＜10 33.7±3.5 1∶16、1∶8 183.8±43.0 B濾膜生產(chǎn)批次0個月52.3±0.1 99.6±0.2 98.7±0.3 15.5±6.5 15.4±0.0＜10 30.7±4.2 1∶16、1∶8 70.9±40.2 6個月52.3±0.2 99.6±0.1 97.8±0.6 15.3±6.2 15.2±0.2＜10 36.3±4.7 1∶16、1∶8 74.8±43.0

2.2.2 長期穩(wěn)定性 與0個月相比，采用A濾板、B濾膜生產(chǎn)的靜丙于2 ～8 ℃放置12、24個月，外觀、可見異物、熱穩(wěn)定性試驗結(jié)果均無變化；蛋白含量、純度、分子大小分布、抗-HBs、白喉抗體、ACA、IgA 殘留量均無明顯變化（A濾板12個月：t分別為0.000、0.500、1.470、-2.132、-19.000、2.665、1.006，P均＞0.05，24 個月：t分別為0.500、-1.890、1.866、-0.050、-10.000、-0.185、1.472，P均＞0.05；B濾膜12個月：t分別為1.732、0.632、1.839、0.462、-4.600、1.909、-0.191，P均＞0.05，24個月：t分別為0.866、-1.109、2.263、1.527、-10.000、0.334、0.520，P均＞0.05），滿足《中國藥典》三部（2020版）的規(guī)定。見表3。

表3 長期穩(wěn)定性結(jié)果（±s，n=3）Tab.3 Long-term stability results（±s，n=3）

表3 長期穩(wěn)定性結(jié)果（±s，n=3）Tab.3 Long-term stability results（±s，n=3）

檢測項目蛋白質(zhì)含量（g/L）純度（%）A濾板生產(chǎn)批次檢測標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)不低于50應(yīng)不低于蛋白質(zhì)總量的95.0%IgG單體與二聚體含量之和應(yīng)不低于95.0%應(yīng)不低于6.0應(yīng)不低于3.0 B濾膜生產(chǎn)批次0個月51.9±0.2 99.5±0.1 12個月51.9±0.1 99.5±0.0 24個月51.8±0.2 99.7±0.1 0個月52.3±0.1 99.6±0.1 12個月52.2±0.0 99.5±0.6 24個月52.2±0.2 99.7±0.1分子大小分布（%）98.4±0.3 98.0±0.3 98.0±0.2 98.7±0.3 98.3±0.3 98.1±0.3抗-HBS（IU/g蛋白質(zhì)）白喉抗體（HAU/g蛋白質(zhì)）PKA（IU/mL）ACA（%）抗-A、抗B血凝素IgA殘留量（μg/mL）12.0±2.1 15.4±0.0 21.1±7.0 16.0±0.1 12.1±2.8 16.1±0.1 15.5±6.5 15.4±0.0 13.5±4.3 16.2±0.3 9.7±1.2 16.1±0.1應(yīng)不高于35應(yīng)不高于50應(yīng)不高于1∶64≤400＜10 34.0±5.0 1∶16、1∶8 194.8±45.3＜10 25.7±4.5 1∶16、1∶8 159.3±41.0＜10 35.0±8.9 1∶16、1∶8 144.7±37.9＜10 36.7±4.2 1∶16、1∶8 70.9±40.2＜10 27.7±7.0 1∶16、1∶8 65.0±35.6＜10 35.3±5.5 1∶16、1∶8 54.7±36.3

3 討論

IgA 是人體內(nèi)具有免疫調(diào)節(jié)和抗感染能力的抗體，是靜丙含有的活性成分之一。但中國和日本人中選擇性IgA 抗體缺乏癥（selective IgA deficiency，SIgAD）約有0.2‰的發(fā)病率，即每萬人中約有2人為IgA 抗體缺乏癥患者［19-21］。臨床上SIgAD 患者首次使用含較高IgA 殘留量的靜丙后，體內(nèi)可產(chǎn)生抗IgA抗體，當(dāng)再次輸注時可能產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，甚至危及患者生命，因此，SIgAD 患者應(yīng)使用IgA 殘留量低的靜丙。對靜丙中IgA 殘留量，《歐洲藥典》9.0 的規(guī)定為：需由各企業(yè)在使用說明上標(biāo)注［18］；《中國藥典》三部（2020 版）則規(guī)定：應(yīng)為批準(zhǔn)的要求［17］。本公司在靜丙生產(chǎn)過程中降低IgA 殘留量后，對其外觀、可見異物、熱穩(wěn)定性試驗、蛋白質(zhì)含量、純度、分子大小分布、抗體效價（抗-HBs、白喉抗體、ACA、抗-A、抗-B 血凝素）、IgA 殘留量等成品質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行檢測，通過與未優(yōu)化的生產(chǎn)批次進(jìn)行對比，IgA 殘留量有較大幅度的下降，其余指標(biāo)無明顯差異，證明上述工藝優(yōu)化后產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)良好，兩種措施均可用于降低靜丙IgA殘留量。

穩(wěn)定性是貫穿整個藥品研發(fā)與上市后研究的重要內(nèi)容，可作為判斷產(chǎn)品工藝、制劑處方、包裝材料選擇合理性的指標(biāo)。本研究加速穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性試驗工藝優(yōu)化后的靜丙各項檢測結(jié)果均合格，符合《中國藥典》三部（2020 版）中相關(guān)規(guī)定，穩(wěn)定性良好，表明優(yōu)化工藝安全、有效、可行，能穩(wěn)定、可靠地制備出合格的靜丙，對其他IgA殘留量較高的血液制品也有一定的借鑒作用。