劉曉麗，閆干干，閆浩浩，劉志成，劉曉平，陳云雨

皖南醫(yī)學(xué)院藥物篩選與評(píng)價(jià)研究所，安徽蕪湖 241002

目前，由登革病毒（dengue virus，DENV）感染引發(fā)的登革出血熱（dengue haemorrhagic fever，DHF）疫情仍在全球傳播，每年約3 900 萬(wàn)新增感染病例，嚴(yán)重危害人類(lèi)的生命健康［1-2］。雖已有登革熱疫苗上市，但其無(wú)法針對(duì)所有血清型提供全面的免疫應(yīng)答保護(hù)，且再次感染異種血清型病毒會(huì)產(chǎn)生抗體依賴(lài)增強(qiáng)作用（antibody dependent enhancement，ADE），面對(duì)DENV感染尚缺乏安全有效的治療藥物［3］。

DENV 是由埃及伊蚊和白紋伊蚊等媒介昆蟲(chóng)傳播的單股正鏈RNA 病毒，主要包含4種血清型，其中DENV-2 型是中國(guó)及東南亞等地區(qū)的流行毒株［4-5］。DENV 主要通過(guò)包膜蛋白（envelope protein，E）與細(xì)胞表面受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)吞作用，進(jìn)而感染宿主細(xì)胞［6-7］。釋放到宿主細(xì)胞中的病毒基因組RNA 將利用宿主細(xì)胞的核糖體翻譯成一條多聚蛋白質(zhì)體（polyprotein），再利用宿主細(xì)胞信號(hào)肽酶與NS2BNS3蛋白酶水解產(chǎn)生RNA依賴(lài)的RNA聚合酶（RNAdependent RNA polymerase，RdRp，NS5）等7 種非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，調(diào)控病毒基因組RNA 復(fù)制、免疫逃逸及病毒顆粒的成熟與釋放［8-11］。

NS2B-NS3 蛋白酶是一種多功能絲氨酸蛋白酶，由具有水解功能的NS3 與輔助因子NS2B 通過(guò)一個(gè)親水區(qū)域結(jié)合而成。NS2B-NS3 蛋白酶的水解活性中心是由NS3 氨基酸端（1 ～185 aa）中的第51位組氨酸（His51）、第75 位天冬氨酸（Asp75）和第135 位絲氨酸（Ser135）組成的催化三聯(lián)體，其水解活性的發(fā)揮必須依賴(lài)輔助因子NS2B 羧基端（48 ～95 aa）β-鏈結(jié)構(gòu)的形成［4，10］。NS2B-NS3 蛋白酶在多種黃病毒中具有高度保守性，并參與病毒復(fù)制與免疫逃逸，使其成為廣譜抗黃病毒藥物研發(fā)的理想靶標(biāo)之一［12］。

本研究通過(guò)優(yōu)化DENV NS2B-NS3 蛋白酶在大腸埃希菌（E.coli）中的表達(dá)條件，制備高活性的NS2BNS3 蛋白酶，為NS2B-NS3 蛋白酶抑制劑高通量篩選模型的建立奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及載體E.coliRosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京TransGen公司；pET-28a載體購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 限制性?xún)?nèi)切酶NheⅠ和XhoⅠ購(gòu)自美國(guó)Merck公司；酵母粉和瓊脂粉購(gòu)自日本Oxide公司；脫脂奶粉購(gòu)自德國(guó)BioFroxx 公司；卡那霉素、免疫印跡膜和HisTrapTM親和層析柱購(gòu)自美國(guó)GE 公司；IPTG 購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；小鼠抗組氨酸標(biāo)簽單克隆抗體和HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；7-甲氧基香豆素-4-乙酸（7-methoxycoumarin-4-acetic acid，MCA）購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司；MCA 與Dnp（2，4-dinitropheno）標(biāo)記的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）試驗(yàn)底物（FRET substrate：MCA-RRRRSAGK-Dnp，λex/λem：320 nm/405 nm）購(gòu)自吉爾生化上海有限公司；BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自北京GenStar 公司；ECL Plus Ultra Sensitive Kit 購(gòu)自福州Phygene 公司；全黑半底96孔板購(gòu)自美國(guó)Corning 公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek 儀器有限公司。

1.3 NS2B-NS3重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)Gen-Bank 登錄的NS2B與NS3基因序列（QBP33567.1），設(shè)定G4SG4連接臂連接NS2B（48 ～95 aa）與NS3（1 ～185 aa）基因序列。按照文獻(xiàn)［13］的方法，使用在線工具h(yuǎn)ttp：//www.jcat.de/進(jìn)行NS2B-NS3基因序列的優(yōu)化。在優(yōu)化序列的5'和3'端添加酶切位點(diǎn)NheⅠ與XhoⅠ，將pET-28a 載體與NS2B-NS3基因連接，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-NS2B-NS3，見(jiàn)圖1。通過(guò)Gene Universal 公司進(jìn)行基因測(cè)序，并進(jìn)行雙酶切鑒定。

圖1 重組質(zhì)粒pET-28a-NS2B-NS3構(gòu)建示意圖Fig.1 Construction diagram of recombinant plasmid pET-28a-NS2B-NS3

1.4 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá) 按照文獻(xiàn)［13］方法，將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-NS2B-NS3轉(zhuǎn)化至E.coliRosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含50μg/mL卡那霉素的固體培養(yǎng)基上，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h；隨機(jī)挑取6 個(gè)重組子，接種于6 mL 含50 μg/mL 卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至A600值為0.6 ～0.8 時(shí)，按1∶1 000 的比例加入6 μL 1 mol/L IPTG，30 ℃誘導(dǎo)10 h。離心收集等量菌體，12%SDS-PAGE分析NS2B-NS3蛋白酶的表達(dá)。

1.5 NS2B-NS3蛋白酶原核表達(dá)條件的優(yōu)化

1.5.1 最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定 在6 mL 含50μg/mL卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中接種2‰工程菌，37 ℃培養(yǎng)8 h，加入1 mmol/L IPTG，30 ℃誘導(dǎo)NS2B-NS3蛋白酶表達(dá)，每2 h收集800μL菌液，持續(xù)取樣12 h，12% SDS-PAGE 分析NS2B-NS3 蛋白酶在各誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況。更改誘導(dǎo)溫度為25、20 ℃，重復(fù)上述操作。

1.5.2 最佳誘導(dǎo)溫度的確定 在50 mL含50μg/mL卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中接種2‰工程菌，37 ℃培養(yǎng)8 h，加入1 mmol/L IPTG，30 ℃振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，收集菌體并重懸，在冰浴條件下破碎菌體后分離并收集裂解上清液和沉淀，12% SDS-PAGE 分析NS2B-NS3 蛋白酶的可溶表達(dá)量。更改誘導(dǎo)條件為25 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h 和20 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h，重復(fù)上述操作。

1.5.3 最佳IPTG 誘導(dǎo)濃度的確定 分別在6個(gè)5 mL含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中接種2‰工程菌，37 ℃培養(yǎng)8 h 后，加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mmol/L IPTG，20 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h，收集等量菌體，12%SDS-PAGE 分析IPTG 誘導(dǎo)濃度對(duì)NS2B-NS3蛋白酶原核表達(dá)的影響。

1.6 NS2B-NS3蛋白酶的分離純化 在含50μg/mL卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中大量接種工程菌，37 ℃培養(yǎng)7 h，加入0.2 mmol/L IPTG，20 ℃振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h。誘導(dǎo)后的菌體通過(guò)超聲波破碎得到上清液，采用鹽析法，即用40%飽和硫酸銨溶液沉淀蛋白，用上樣緩沖液A液（25 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH 8.0）溶解沉淀制備蛋白粗提液。按照文獻(xiàn)［13］，采用親和層析法（使用HisTrapTM親和層析柱）分離純化NS2B-NS3蛋白酶。純化的NS2B-NS3蛋白酶經(jīng)濃縮和透析后，通過(guò)BCA法定量。

1.7 NS2B-NS3 蛋白酶的Western blot 鑒定 將純化后的NS2B-NS3蛋白酶（0.5、1、2μg）經(jīng)12%SDS-PAGE電泳分離后，通過(guò)半干法轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，用TBST（50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，0.1%Tween 20，pH 7.5）洗膜3次，每次10 min，加入封閉液（50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，0.1%Tween 20，5%脫脂奶粉，pH 7.5），于4 ℃封閉過(guò)夜；用TBST 洗膜3 次，加入小鼠抗His-tag 單克隆抗體（1∶2 000 稀釋?zhuān)?，室溫孵? h；TBST洗膜3次，加入HRP-羊抗小鼠IgG（1∶2 000稀釋?zhuān)?，室溫孵? h；TBST 洗膜3 次，加入HRP 底物化學(xué)發(fā)光液，在化學(xué)發(fā)光成像儀中顯影成像。

1.8 NS2B-NS3蛋白酶水解活性的測(cè)定

1.8.1 MCA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按照文獻(xiàn)［13-15］方法，用Tris緩沖液（10 mmol/L Tris，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）將2 mmol/L MCA 分別稀釋至0.625、1.25、2.5、5、10、20μmol/L，以Tris緩沖液作為空白對(duì)照。將上述溶液加入全黑半底96 孔板中，50μL/孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，多功能酶標(biāo)儀設(shè)為自動(dòng)增益模式，激發(fā)光/發(fā)射光為320 nm/405 nm，檢測(cè)相對(duì)熒光強(qiáng)度值（relative fluorescence unit，RFU），繪制MCA標(biāo)準(zhǔn)熒光曲線。

1.8.2 NS2B-NS3蛋白酶比活力計(jì)算 用Tris緩沖液將29μmol/L NS2B-NS3蛋白酶稀釋至0、0.5、1、2μmol/L，加入全黑半底96 孔板中，25 μL/孔，再加入25 μL 40μmol/L FRET 底物。多功能酶標(biāo)儀設(shè)置增益值為58，激發(fā)光/發(fā)射光為320 nm/405 nm，檢測(cè)間隔1 s，總時(shí)間3 min。通過(guò)MCA 標(biāo)準(zhǔn)熒光曲線計(jì)算NS2B-NS3 蛋白酶每秒水解FRET 底物生成產(chǎn)物MCA-RRRR 的量，再按下式計(jì)算其比活力?；盍挝唬║）定義：在室溫和pH 8.0 條件下，產(chǎn)生1 pmol MCA-RRRR所需NS2B-NS3蛋白酶每分鐘水解FRET底物的酶量。

NS2B-NS3 蛋白酶比活力（U/mg）=（60×V）/92.59×NS2B-NS3（mg）

式中V表示水解反應(yīng)的初速度。

1.8.3 NS2B-NS3蛋白酶的米氏常數(shù)（Km）與催化常數(shù)（kcat）的計(jì)算 用Tris 緩沖液稀釋2 mmol/L FRET 底物至5、10、20、40、60、80、90μmol/L，加入全黑半底96 孔板中，25μL/孔，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，再加入25μL 2μmol/L NS2B-NS3 蛋白酶，檢測(cè)其RFU 值。初速度以GraphPad Prism 8.0軟件擬合米氏方程（Michaelis-Menten equation），計(jì)算NS2B-NS3 蛋白酶的Km與kcat值。

2 結(jié)果

2.1 NS2B-NS3 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 經(jīng)基因測(cè)序證實(shí)，連接的基因序列與目的基因序列完全一致，見(jiàn)圖2。重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-NS2B-NS3經(jīng)NheⅠ和XhoⅠ雙酶切，可見(jiàn)723 bp 的特異片段，大小與目的基因片段一致，見(jiàn)圖3。表明重組原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖2 基因測(cè)序結(jié)果Fig.2 Result of gene sequencing

圖3 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.3 Restriction map of recombinant prokaryotic expression plasmid

2.2 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 12%SDS-PAGE 分析顯示，與未誘導(dǎo)菌液相比，誘導(dǎo)的6 個(gè)重組子在相對(duì)分子質(zhì)量約37 000 處均有明顯的NS2B-NS3 蛋白酶表達(dá)條帶，大小均與預(yù)期相符，見(jiàn)圖4。

圖4 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of expression products

2.3 NS2B-NS3蛋白酶原核表達(dá)條件的優(yōu)化

2.3.1 最佳誘導(dǎo)時(shí)間 12%SDS-PAGE 分析顯示，在30、25、20 ℃誘導(dǎo)溫度下，NS2B-NS3蛋白酶表達(dá)量達(dá)峰值的最佳誘導(dǎo)時(shí)間分別為6、8、10 h，見(jiàn)圖5。

圖5 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化Fig.5 Optimization of induction time

2.3.2 最佳誘導(dǎo)溫度 12%SDS-PAGE 分析顯示，各誘導(dǎo)溫度在其最佳誘導(dǎo)時(shí)間收集的菌體破碎后，誘導(dǎo)溫度越高，包涵體表達(dá)量越多，NS2B-NS3 蛋白酶可溶表達(dá)量越少。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為20 ℃時(shí)，NS2B-NS3蛋白酶的可溶表達(dá)量最大。見(jiàn)圖6。

圖6 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化Fig.6 Optimization of induction temperature

2.3.3 最佳IPTG 誘導(dǎo)濃度 12% SDS-PAGE 分析顯示，IPTG 誘導(dǎo)濃度對(duì)NS2B-NS3 蛋白酶表達(dá)量影響較小，可選擇0.2 mmol/L 作為其最佳誘導(dǎo)濃度，見(jiàn)圖7。

圖7 IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化Fig.7 Optimization of induction concentration of IPTG

2.4 純化產(chǎn)物的鑒定

2.4.1 SDS-PAGE分析 純化的NS2B-NS3蛋白酶在相對(duì)分子質(zhì)量約37 000 處可見(jiàn)目的蛋白條帶，純度大于90%，濃度為2 mg/mL，表達(dá)量達(dá)20 mg/L，見(jiàn)圖8。

圖8 純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.8 SDS-PAGE analysis of purified products

2.4.2 Western blot 分析 純化的NS2B-NS3 蛋白酶可與小鼠抗His-tag單克隆抗體特異性結(jié)合，見(jiàn)圖9。

圖9 純化產(chǎn)物的Western blot鑒定Fig.9 Western blot identification of purified products

2.5 NS2B-NS3 蛋白酶的水解活性 MCA 標(biāo)準(zhǔn)熒光曲線見(jiàn)圖10。經(jīng)計(jì)算，NS2B-NS3蛋白酶的比活力為16 111 U/mg，見(jiàn)圖11。NS2B-NS3蛋白酶水解FRET底物時(shí)，由于前30 s 內(nèi)的ΔRFU 值呈一級(jí)反應(yīng)，其斜率即為酶促反應(yīng)的初速度，擬合曲線見(jiàn)圖12。經(jīng)計(jì)算，NS2B-NS3 蛋白酶的Km值為16.46 μmol/L，Vmax為62.19 ΔRFU/s，kcat值為0.028/s，kcat/Km值為1 698 L/（mol·s），見(jiàn)圖13，表明純化的NS2B-NS3 蛋白酶具有良好的水解活性。

圖10 MCA標(biāo)準(zhǔn)熒光曲線Fig.10 MCA standard fluorescence curve

圖11 NS2B-NS3蛋白酶比活力測(cè)定Fig.11 Determination of specific activity of NS2B-NS3 protease

圖12 NS2B-NS3蛋白酶水解動(dòng)力學(xué)的初始速度分析Fig.12 Analysis of initial rate of hydrolysis kinetics of NS2BNS3 protease

圖13 NS2B-NS3蛋白酶的Km與kcat值Fig.13 Km and kcat of NS2B-NS3 protease

3 討論

目前，登革熱疫情仍在全球100 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛流行，感染與死亡病例與日俱增，已對(duì)人類(lèi)的生命健康造成了嚴(yán)重威脅［1，5，16］。批準(zhǔn)上市的DENV疫苗保護(hù)效力不足，尚不能有效阻斷DENV的傳播與流行［17］。因此，積極開(kāi)發(fā)治療登革熱感染的廣譜抗病毒藥物至關(guān)重要。NS2B-NS3 蛋白酶在病毒多聚蛋白質(zhì)體水解、病毒RNA 復(fù)制和免疫逃逸過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用，現(xiàn)已成為廣譜抗DENV 藥物研發(fā)的理想靶標(biāo)之一［12］。

大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)便、表達(dá)量高、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于重組蛋白的表達(dá)，已成為重組蛋白質(zhì)制備的重要技術(shù)策略之一［18-20］。本研究基于密碼子偏愛(ài)性原則，以G4SG4作為連接臂，構(gòu)建了NS2B-NS3融合表達(dá)載體，在大腸埃希菌中成功實(shí)現(xiàn)了NS2B-NS3蛋白酶的重組表達(dá)。通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度和IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化，確定了NS2BNS3 蛋白酶的最佳原核表達(dá)條件。采用低溫誘導(dǎo)策略，有效減少了包涵體的生成，促進(jìn)了NS2B-NS3蛋白酶的可溶表達(dá)與正確折疊。

親和層析技術(shù)是通過(guò)親和配基與目標(biāo)產(chǎn)物間的特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品一步純化得到目標(biāo)蛋白質(zhì)的技術(shù)，具有高效簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、抗體、核酸等的分離純化［21-22］。本研究在構(gòu)建的NS2BNS3蛋白酶羧基端融合了多聚組氨酸標(biāo)簽，通過(guò)His-TrapTM親和層析柱一步法實(shí)現(xiàn)了NS2B-NS3蛋白酶的快速純化。雖然NS2B-NS3蛋白酶表觀相對(duì)分子質(zhì)量為37 000，與其理論相對(duì)分子質(zhì)量（28 000）存在較大偏差，但這種現(xiàn)象與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［23］。這可能與目的蛋白質(zhì)中正電荷氨基酸團(tuán)簇分布以及多聚組氨酸標(biāo)簽中堿性氨基酸的作用造成了目的蛋白質(zhì)分子在SDS-PAGE中遷移變慢，從而導(dǎo)致偏差分布有關(guān)［24］。

FRET是供體與受體間發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移的過(guò)程，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏、分析快速等優(yōu)點(diǎn)［25］。在DENV 的生命周期中，NS2B-NS3 蛋白酶水解其多聚蛋白質(zhì)體生成RdRp等參與病毒復(fù)制與組裝的功能分子，水解活性的強(qiáng)弱是評(píng)價(jià)其酶活性的重要指標(biāo)之一［6，8］。根據(jù)NS2B-NS3 蛋白酶水解多聚蛋白質(zhì)體的天然切割位點(diǎn)，以熒光基團(tuán)MCA和淬滅基團(tuán)Dnp標(biāo)記的多肽作為其水解底物。當(dāng)FRET底物被NS2B-NS3蛋白酶水解后，MCA-RRRR 多肽片段失去淬滅效應(yīng)將產(chǎn)生增強(qiáng)型熒光。利用FRET實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了純化的NS2B-NS3蛋白酶對(duì)FRET底物具有良好的水解活性。

綜上所述，本研究基于密碼子優(yōu)化策略，利用大腸埃希菌原核表達(dá)技術(shù)，成功制備了高活性的DENV NS2B-NS3蛋白酶，為NS2B-NS3蛋白酶小分子抑制劑高通量篩選模型的建立奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。