劉昊澤，張善林，馬微，王雨焜，苑紅，蘭錚，霍達(dá)，閆思睿，張浩楠，扈瑞平，馬春麗

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古昆明卷煙有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010030；3.內(nèi)蒙古蓯蓉實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010030

關(guān)鍵字：螺旋藻；藻藍(lán)蛋白；乙醇；氧化應(yīng)激；抗氧化

氧化還原反應(yīng)是生物體細(xì)胞內(nèi)正常的生物化學(xué)反應(yīng)，該反應(yīng)過程中細(xì)胞內(nèi)線粒體和生物膜會(huì)產(chǎn)生一定量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）［1］。ROS 包括超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）和羥基自由基（HO）等，是由氧分子不完全還原的情況下產(chǎn)生的化合物［2］。機(jī)體在正常生理?xiàng)l件下，ROS 含量處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，此時(shí)的ROS 作為信號(hào)分子有利于機(jī)體正常運(yùn)轉(zhuǎn)且具有增強(qiáng)免疫防御的功能［3］。當(dāng)機(jī)體攝入過量乙醇時(shí)，細(xì)胞內(nèi)線粒體受損，使氧化呼吸鏈泄露電子，導(dǎo)致產(chǎn)生過量的ROS［4-5］，使機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激［6］。此時(shí)，過量的ROS 會(huì)造成脂質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致高脂血癥和肥胖，并攻擊生物膜中的脂質(zhì)，產(chǎn)生脂質(zhì)氧化應(yīng)激產(chǎn)物8-表氫氧異前列腺素（8-isoprostane）［7］，并會(huì)破壞蛋白質(zhì)分子，影響其功能和代謝［8］，產(chǎn)生氧化應(yīng)激產(chǎn)物蛋白質(zhì)羰基。有研究證明，蛋白質(zhì)羰基參與多種重大疾病的生理病理過程［9-10］。為防止氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體產(chǎn)生影響，幾乎所有機(jī)體均具有一套完整的保護(hù)體系來維持氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的平衡，包括機(jī)體的抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和非酶抗氧化物質(zhì)還原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）［11］。

鄂爾多斯市是鹽堿湖密集區(qū)之一，擁有螺旋藻產(chǎn)業(yè)園［12］，該地制備的藻藍(lán)蛋白具有極高的藥用和食用價(jià)值。但目前針對(duì)藻藍(lán)蛋白體內(nèi)抗氧化效果的研究較少，特別是缺少關(guān)于藻藍(lán)蛋白抗氧化劑量方面的充足數(shù)據(jù)。基于此，本研究通過構(gòu)建乙醇氧化應(yīng)激小鼠模型，觀察低劑量和高劑量螺旋藻藻藍(lán)蛋白對(duì)小鼠體內(nèi)氧化損傷相關(guān)指標(biāo)的影響，探討藻藍(lán)蛋白的抗氧化作用，以期為其功能產(chǎn)品的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試品 螺旋藻藻藍(lán)蛋白購自內(nèi)蒙古藻藍(lán)生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 主要試劑 蛋白質(zhì)羰基試劑盒、GSH-Px 試劑盒及GSH 試劑盒均購自南京建成生物制品研究所；8-isoprostane 試劑盒購自美國(guó)Cayman ChemicalCompany公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)KM 小鼠，48 只，雌性，8 月齡，體質(zhì)量23～27 g，購自斯貝福生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)為：SCXK（京）2019-0010。本實(shí)驗(yàn)均以科研為目的進(jìn)行小鼠的養(yǎng)殖和使用，且按照內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行（文件號(hào)為：YKD2021-02027）。

1.4 動(dòng)物分組及處理 將小鼠隨機(jī)分為空白、模型、低劑量、高劑量組，每組12 只。低、高劑量組小鼠經(jīng)灌胃分別給予藻藍(lán)蛋白0.15 和0.30 g/kg 體質(zhì)量（人體推薦量的10和20倍），1次/d，連續(xù)灌胃42 d，稱量小鼠體質(zhì)量；末次灌胃后禁食16 h（過夜），1 次性灌胃給予50%乙醇，12 mL/kg 體質(zhì)量，模型組小鼠僅進(jìn)行50%乙醇灌胃，空白組不灌胃。6 h 后經(jīng)摘眼球取血，分離血清，采用8-isoprostane 試劑盒檢測(cè)8-isoprostane水平。

1.5 小鼠肝組織中GSH-Px、GSH 及蛋白質(zhì)羰基含量的檢測(cè) 將各組小鼠經(jīng)頸椎脫臼法處死，無菌取肝臟組織，研磨，8 000×g離心15 min，取上清液，采用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)GSH-Px、GSH 水平以及蛋白質(zhì)羰基含量。

1.6 小鼠體內(nèi)GSH 含量與體質(zhì)量相關(guān)性的檢測(cè) 以各組小鼠肝組織中GSH 含量為橫坐標(biāo)，每只小鼠體質(zhì)量為縱坐標(biāo)，建立線性回歸曲線，獲得線性回歸方程，計(jì)算相關(guān)系數(shù)（R2）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藻藍(lán)蛋白對(duì)氧化應(yīng)激小鼠體質(zhì)量的影響 與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.585，P＞0.05）；與模型組比較，低、高劑量組小鼠體質(zhì)量下降了8.2%和15.3%，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為4.125和18.842，P分別為＜0.05和＜0.01）。見表1。表明藻藍(lán)蛋白可抑制小鼠因氧化應(yīng)激而導(dǎo)致的體質(zhì)量升高。

表1 各組小鼠抗氧化能力相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（x，n=3）Tab 1.Detection results of related indexes of antioxidative capacity of mice in each group（x，n=3）

2.2 藻藍(lán)蛋白對(duì)氧化應(yīng)激小鼠血清中8-isoprostane水平的影響 與空白組比較，模型組小鼠血清中8-isoprostane水平顯著升高（F=11.697，P＜0.05）。與模型組比較，低、高劑量組小鼠血清中8-isoprostane水平下降了51.1%和62.3%，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為10.695 和29.702，P均＜0.01）；與空白組比較，低、高劑量組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為0.141和1.119，P均＞0.05）。見表1。表明藻藍(lán)蛋白能夠降低乙醇誘導(dǎo)小鼠氧化應(yīng)激引起的8-isoprostane 水平升高，緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)，保護(hù)小鼠免受氧化損傷。

2.3 藻藍(lán)蛋白對(duì)氧化應(yīng)激小鼠肝組織中GSH-Px的影響與空白組比較，模型組小鼠GSH-Px 含量降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.978，P＞0.05）。與模型組比較，低、高劑量組GSH-Px 含量提高了26.3%和36.3%，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為42.654 和70.386，P均＜0.01）。見表1。表明藻藍(lán)蛋白能夠通過提高GSH-Px含量，清除體內(nèi)過氧化物。

2.4 藻藍(lán)蛋白對(duì)氧化應(yīng)激小鼠肝組織中蛋白質(zhì)羰基含量的影響 與空白組比較，模型組小鼠肝組織蛋白質(zhì)羰基含量顯著升高（F=13.582，P＜0.01）。與模型組比較，低、高劑量組小鼠肝組織蛋白質(zhì)羰基含量下降了39.6%和45.1%（F分別為33.516和40.512，P均＜0.01）；與空白組比較，低劑量組小鼠肝組織中蛋白質(zhì)羰基含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.682，P＞0.05），高劑量組則明顯降低（F=0.156，P＜0.05）。見表1。表明藻藍(lán)蛋白能夠降低乙醇誘導(dǎo)小鼠氧化應(yīng)激引起的蛋白質(zhì)羰基含量升高，緩解氧化應(yīng)激程度。

2.5 藻藍(lán)蛋白對(duì)氧化應(yīng)激小鼠肝組織中GSH含量的影響與空白組比較，模型組小鼠肝組織中GSH 含量明顯升高（F=17.213，P＜0.01）。與模型組比較，低、高劑量藻藍(lán)蛋白組小鼠肝組織中GSH 含量增高了3.2%和5.1%（F分別為76.082 和76.379，P均＜0.01）。見表1。表明藻藍(lán)蛋白能夠提高小鼠體內(nèi)GSH 水平，有助于清除體內(nèi)過氧化物。

2.6 小鼠肝組織中GSH含量與體質(zhì)量的相關(guān)性 小鼠肝組織中GSH含量與小鼠體質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)，線性回歸方程為：y=-46.65x+43.78，R2=0.013 49，P＞0.05，見圖1。表明提高GSH水平可降低小鼠體質(zhì)量。

圖1 小鼠肝組織中GSH含量對(duì)體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of GSH content in liver tissue on body mass of mice

3 討論

蛋白質(zhì)羰基為氧化應(yīng)激產(chǎn)物，是有害的、不可逆的氧化蛋白質(zhì)修飾產(chǎn)物之一，通常用于評(píng)估氧化應(yīng)激程度［13］；8-isoprostane 也是一種氧化應(yīng)激產(chǎn)物，通過自由基催化花生四烯酸發(fā)生過氧化反應(yīng)而生成，是發(fā)生氧化應(yīng)激的標(biāo)志物［14］。GSH-Px 是一種重要的抗氧化酶，該酶在體外和細(xì)胞培養(yǎng)中易被多種生理物質(zhì)滅活，包括一氧化氮和羰基化合物。據(jù)報(bào)道，在多種病理動(dòng)物模型發(fā)生氧化應(yīng)激的組織中，GSHPx活性均降低，且GSH-Px在氮氧化應(yīng)激和糖氧化應(yīng)激等多種條件下也會(huì)發(fā)生失活［15］。GSH 是一種主要的抗氧化物質(zhì)，可通過清除ROS 阻止相關(guān)疾病的發(fā)生［16］。

本研究結(jié)果表明，與空白組比較，模型組小鼠體內(nèi)蛋白質(zhì)羰基及8-isoprostane含量明顯升高（P＜0.05）；GSH-Px 含量降低，體質(zhì)量增加，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），表明小鼠氧化應(yīng)激模型構(gòu)建成功。模型組GSH 水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），表明氧化應(yīng)激可導(dǎo)致小鼠肝損傷，可能使小鼠肝細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活性水平升高，將更多的氧化型谷胱甘肽（glutathiol，GSSG）轉(zhuǎn)化為GSH［17-18］。與模型組比較，低、高劑量組小鼠體內(nèi)的GSH、GSH-Px含量顯著升高（P均＜0.01），蛋白質(zhì)羰基及8-isoprostane含量顯著降低（P均＜0.01），表明藻藍(lán)蛋白可提高小鼠的抗氧化酶和非酶抗氧化物質(zhì)水平，降低脂質(zhì)氧化應(yīng)激產(chǎn)物和蛋白質(zhì)氧化應(yīng)激產(chǎn)物水平，可有效抑制乙醇所致的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

氧化應(yīng)激對(duì)肥胖的發(fā)展有重要影響。從神經(jīng)細(xì)胞調(diào)控機(jī)體的角度來看，在正常生理?xiàng)l件下，機(jī)體通過調(diào)節(jié)下丘腦神經(jīng)元使體內(nèi)達(dá)到能量平衡［19］。發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，大量的ROS 破壞下丘腦神經(jīng)細(xì)胞及其信號(hào)通路，使脂肪細(xì)胞內(nèi)脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）活性升高，導(dǎo)致新生成甘油三酯不能降解而在脂肪細(xì)胞內(nèi)堆積，形成肥胖［20］，該結(jié)論提示可通過抗氧化途徑來抑制肥胖。從脂肪細(xì)胞的角度來看，抗氧化物質(zhì)可通過改變調(diào)節(jié)線粒體活性的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)濃度刺激白色脂肪細(xì)胞的褐變，使白色脂肪細(xì)胞更易轉(zhuǎn)變?yōu)橐种品逝诌M(jìn)程的淺褐色脂肪細(xì)胞［21］。有研究證明，在肥胖的產(chǎn)生和發(fā)展中，脂質(zhì)代謝紊亂和氧化應(yīng)激共同發(fā)揮重要作用［22］。人體的血脂可從食物中獲取，也可由肝臟合成而釋放入血［23］。一旦ROS 過多，形成氧化應(yīng)激，使肝細(xì)胞受損，會(huì)導(dǎo)致甘油三酯在肝組織內(nèi)積累從而造成血液中甘油三酯含量增加，形成高血脂癥。當(dāng)長(zhǎng)期處于高血脂狀態(tài)下，人體細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生更多的ROS，引起脂質(zhì)過氧化和脂質(zhì)代謝紊亂，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)；而機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)又會(huì)使前體脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感度降低［24］，加快脂肪細(xì)胞的形成及甘油三酯的堆積，導(dǎo)致肥胖［25］。有研究證明，當(dāng)給予抗氧化物質(zhì)使體內(nèi)GSH含量升高時(shí)，谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）含量會(huì)同時(shí)下降［26］，證明GSH 可通過抑制氧化應(yīng)激來修復(fù)受損的肝組織，從而間接抑制高血脂癥，達(dá)到抑制肥胖的作用。另有研究證明，大鼠脂肪中GSH 能夠清除脂肪細(xì)胞中過多的ROS，避免ROS 對(duì)脂肪細(xì)胞分化和生長(zhǎng)信號(hào)通路造成破壞，減少甘油三酯在脂肪內(nèi)的堆積，從而抑制肥胖［27］。一般情況下，肥胖程度在較大程度上與體質(zhì)量存在正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，小鼠血清GSH水平與小鼠體質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)，提示藻藍(lán)蛋白可能是通過升高體內(nèi)GSH水平來抑制小鼠體質(zhì)量增加，具有間接抑制肥胖的功效。

綜上所述，藻藍(lán)蛋白能夠通過提高機(jī)體自由基清除能力，降低蛋白質(zhì)羰基含量，提高小鼠的抗氧化能力，降低小鼠體質(zhì)量。本研究為藻藍(lán)蛋白在抗氧化及減肥領(lǐng)域的相關(guān)功能食品開發(fā)及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。