李曉彤，張晨宵，于廣福，沈書園，趙英會(huì)，邵祝軍，郭蓬勃

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）臨床與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所），山東濟(jì)南 250000；2.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京 102206

白喉棒狀桿菌（C.diphtheriae）在人群中通過飛沫傳播，是感染人類最常見的細(xì)菌之一。C.diphtheriae感染導(dǎo)致患者咽喉部黏膜充血腫脹甚至壞死，繼而形成一種不易脫落的灰白色假膜。C.diphtheriae毒素可引起患者全身中毒癥狀，如心肌炎和末梢神經(jīng)麻痹等，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。因此，C.diphtheriae感染是人類生命健康的重要威脅，預(yù)防C.diphtheriae感染是公共衛(wèi)生領(lǐng)域迫切需要解決的問題［1］。

疫苗接種是預(yù)防C.diphtheriae感染的重要方式，目前我國應(yīng)用的是吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗（diphtheria tetanus and acellular pertusis combined vaccine，DTaP）。白喉疫苗的基礎(chǔ)組分是白喉類毒素（diphtheria toxoid，DT）抗原［2］，《中國藥典》三部（2020 版）中DT 疫苗采用白喉?xiàng)U菌PW8 株（CMCC 38007）培養(yǎng)制備，毒素濃度不低于150 Lf/mL時(shí)收獲，甲醛脫毒。每1 mL 半成品含DT 30 ～50 Lf，佐劑氫氧化鋁不高于3.0 mg/mL，加0.05 ～0.1 g/L硫柳汞作為抑菌劑，補(bǔ)加氯化鈉至8.5 g/L。每次人用劑量0.5 mL，含DT效價(jià)應(yīng)不低于30 IU［3］。

疫苗佐劑是疫苗的重要組分，以多種方式增加免疫細(xì)胞向注射部位的募集，增強(qiáng)活化的抗原提呈細(xì)胞（antigen-presenting cell，APC）向引流淋巴結(jié)遷移、APC 對(duì)抗原的攝取和提呈以及機(jī)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答［4-6］。同時(shí)，疫苗佐劑還具有加速機(jī)體對(duì)疫苗的反應(yīng)、節(jié)省疫苗劑量等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用較廣泛的佐劑有生物佐劑，如短小棒狀桿菌、脂多糖和細(xì)胞因子；無機(jī)化合物佐劑，如氫氧化鋁；人工合成佐劑，如胞苷酸、尿苷酸及礦物油等［7］。目前DT 疫苗使用的佐劑為鋁佐劑。

鋁佐劑是經(jīng)典的疫苗佐劑，主要由氫氧化鋁、磷酸鋁及明礬佐劑幾種形式構(gòu)成，其中氫氧化鋁佐劑應(yīng)用最為廣泛［8］，適用于免疫原性較弱的裂解疫苗和亞單位疫苗等，可提高抗體滴度、延長APC 與T 細(xì)胞相互作用時(shí)間，繼而增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答。但也有研究表明，鋁佐劑存在熱穩(wěn)定性差［9］，有效驅(qū)動(dòng)Th1細(xì)胞反應(yīng)的能力有限等缺點(diǎn)，且疫苗注射后可能會(huì)出現(xiàn)與鋁佐劑相關(guān)的累及神經(jīng)系統(tǒng)的毒副反應(yīng)［10-12］。因此，開發(fā)無毒的替換鋁佐劑的新材料佐劑至關(guān)重要。

殼聚糖是一種來源于甲殼素的陽離子多糖，作為一種天然物質(zhì)，甲殼素存在于各種甲殼類動(dòng)物的外骨骼中，其原料易得，價(jià)格低廉。既往研究指出，殼聚糖衍生物無毒、無刺激性和免疫原性、組織相容性好、在體內(nèi)可降解吸收，生物學(xué)特性良好，具有促進(jìn)傷口愈合、抗念珠菌及病毒感染活性［13］。在臨床前模型實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用殼聚糖衍生物可增強(qiáng)鼻腔給藥的抗原黏膜免疫反應(yīng)［14］。在人類受試者中，多糖殼聚糖通過DNA 傳感器激活樹突狀細(xì)胞與Th1細(xì)胞及cGAS-STING 信號(hào)通路，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生，促進(jìn)Th1 細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)系統(tǒng)及黏膜免疫反應(yīng)發(fā)生［15］。同時(shí)，殼聚糖已被證實(shí)可作為小鼠鼻腔疫苗遞送的新載體［16］。但殼聚糖能否作為佐劑應(yīng)用于DT疫苗目前尚未可知。

本研究旨在制備以殼聚糖為佐劑的DT 疫苗，并與經(jīng)典鋁佐劑DT 疫苗的免疫效果（黏膜免疫及體液免疫）進(jìn)行對(duì)比，探討殼聚糖作為DT 疫苗新佐劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6 小鼠，雄性，6 周齡，體質(zhì)量25 g，動(dòng)物許可證：SCXK（京）2021-2006，購自北京微通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室內(nèi)溫度保持在21 ～25 ℃，濕度控制在（50 ± 5）%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程均按照山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)制定的動(dòng)物使用規(guī)定進(jìn)行（倫理號(hào)：W202112020344）。

1.2 主要試劑 DT（#151）購自美國Llist labs 公司；殼聚糖（#448869）和小鼠IgA ELISA 試劑盒（#RAB-0797-1KT）購自美國Sigma-Aldrich 公司；氫氧化鋁佐劑（#239186）購自美國MERCK 公司；白喉毒素抗原（#BA130VS）及白喉IgG 抗體檢測(cè)試劑盒（#ESR 130 G）購自維潤賽潤生物技術(shù)（深圳）有限公司。

1.3 殼聚糖溶液的制備 殼聚糖顆粒按3%比例溶于0.8%乙酸鹽水中，配制成殼聚糖酸溶液［17］。

1.4 殼聚糖佐劑及傳統(tǒng)鋁佐劑DT疫苗的制備 將DT吸附至殼聚糖上，制備新型佐劑疫苗；將氫氧化鋁佐劑與DT吸附混勻，制備以氫氧化鋁為佐劑的疫苗［18］。

1.5 動(dòng)物分組及免疫 將小鼠分為黏膜免疫組和體液免疫組，每組再隨機(jī)分為6 組：陰性對(duì)照組（PBS）、陽性對(duì)照組（DT）、鋁佐劑組、殼聚糖佐劑組（配成含殼聚糖0.5%的終溶液）、鋁佐劑疫苗組和殼聚糖佐劑疫苗組，每組5 只。黏膜免疫組和體液免疫組分別通過滴鼻和腹腔注射接種1 次，PBS 緩沖液500 μL/只，DT 10 μg/只，鋁佐劑500 μg/只，殼聚糖佐劑500μL/只。

1.6 疫苗安全性檢測(cè) 動(dòng)物按1.5 項(xiàng)處理后持續(xù)觀察小鼠狀態(tài)。

1.7 疫苗有效性檢測(cè) 分別于接種前（0 d）、接種后7、21、35 d 采集小鼠眼球血，分離血清，同時(shí)收集鼻洗液，采用ELISA法分別檢測(cè)血清IgG抗體水平和鼻洗液sIgA 抗體水平，按照試劑盒說明書操作。根據(jù)試劑盒說明書及世界衛(wèi)生組織判斷標(biāo)準(zhǔn)［2］，白喉IgG 抗體濃度＜0.01 IU/mL無保護(hù)力；0.01 ～＜0.1 IU/mL具有部分保護(hù)力；0.1 ～＜1.01 IU/mL 具有完全保護(hù)力；≥1.01 IU/mL具有長期保護(hù)力。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 26.0及GraphPad Prism 5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 疫苗的安全性 各組小鼠在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)均無死亡現(xiàn)象發(fā)生。與傳統(tǒng)鋁佐劑一致，殼聚糖佐劑及以其為佐劑制備的疫苗接種小鼠后，小鼠精神狀態(tài)良好，體質(zhì)量及大小便正常，未出現(xiàn)流淚等明顯的黏膜刺激癥狀。表明殼聚糖佐劑及以其為佐劑制備的疫苗對(duì)小鼠刺激小，安全性良好，殼聚糖可作為DT 疫苗佐劑使用。傳統(tǒng)鋁佐劑或殼聚糖佐劑滴鼻免疫小鼠后，小鼠存在體溫升高現(xiàn)象，這可能是由于小鼠固有免疫反應(yīng)所致。見表1。

表1 各組小鼠出現(xiàn)癥狀的只數(shù)（n=5）Tab.1 Number of mice with symptoms in each group（n=5）

2.2 疫苗的有效性

2.2.1 體液免疫效果 免疫后21及35 d，與PBS組比較，殼聚糖佐劑疫苗組小鼠血清白喉IgG抗體水平明顯增加［F分別為15 259.423和5 193.632 ＞F0.05（1，8），P均＜0.05］，且有效誘發(fā)小鼠產(chǎn)生了具有完全保護(hù)水平的抗體，與傳統(tǒng)鋁佐劑疫苗比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為51.950和2.609 ＜F0.05（1，8），P均＞0.05）；免疫后21 d，與DT 組比較，鋁佐劑疫苗和殼聚糖佐劑疫苗組誘導(dǎo)出更高水平的白喉IgG 抗體［F分別為161.520 和55.519 ＞F0.05（1，8），P均＜0.05］；免疫后35 d，與DT 組比較，殼聚糖佐劑疫苗組白喉IgG 抗體水平更高［F=17.745 ＞F0.05（1，8），P＜0.05］。見表2。表明殼聚糖佐劑疫苗能夠有效激發(fā)小鼠體液免疫，產(chǎn)生具有完全保護(hù)水平的白喉IgG抗體。

表2 各組小鼠白喉IgG抗體濃度（IU/mL，±s，n=5）Tab.2 Concentration of IgG antibody against diphtheria in mice of each group（IU/mL，±s，n=5）

表2 各組小鼠白喉IgG抗體濃度（IU/mL，±s，n=5）Tab.2 Concentration of IgG antibody against diphtheria in mice of each group（IU/mL，±s，n=5）

注：a表示與PBS組相比，P ＜0.05；b表示與鋁佐劑疫苗組相比，P ＜0.05；c表示與殼聚糖佐劑疫苗組相比，P ＜0.05。

組別PBS DT鋁佐劑殼聚糖佐劑鋁佐劑疫苗殼聚糖佐劑疫苗35 d 0.004 7±0.001 3 0.896 1±0.004 4c 0.004 6±0.0030 0.004 7±0.000 6 0.954 7±0.005 2 0.997 0±0.003 1a 0 d 0.004 3±0.000 2 0.004 2±0.000 3 0.004 2±0.001 0 0.004 4±0.001 0 0.004 2±0.000 8 0.004 5±0.000 6 7 d 0.005 0±0.000 6 0.006 3±0.001 1 0.004 8±0.000 5 0.004 6±0.000 3 0.008 5±0.001 2 0.007 8±0.000 5 21 d 0.004 7±0.005 0 0.745 0±0.003 2b，c 0.004 8±0.000 7 0.005 2±0.002 4 0.896 2±0.003 4 0.842 5±0.010 2a

2.2.2 黏膜免疫效果 整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，殼聚糖佐劑組小鼠sIgA 水平無明顯變化；鋁佐劑疫苗組sIgA 水平在免疫后21 d升高，但與PBS組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為19.998和0.742 ＜F0.05（1，8），P均＞0.05）；殼聚糖佐劑疫苗組sIgA 水平在免疫后21 d 明顯升高，35 d 下降，均顯著高于PBS 組（F分別為599.509和57.636 ＞F0.05（1，8），P均＜0.05），且21 d顯著高于鋁佐劑疫苗組（F= 127.926 ＞F0.05（1，8），P＜0.05）。見表3。表明鋁佐劑疫苗在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)無法有效誘導(dǎo)小鼠黏膜免疫反應(yīng)，而殼聚糖佐劑疫苗在免疫后21 d可有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生黏膜免疫反應(yīng)，雖然在35 d sIgA含量下降，但仍處于有效水平。

表3 白喉sIgA抗體水平（A450，±s，n=5）Tab.3 Level of sIgA antibody against diphtheria（A450，±s，n=5）

表3 白喉sIgA抗體水平（A450，±s，n=5）Tab.3 Level of sIgA antibody against diphtheria（A450，±s，n=5）

注：a 表示與PBS 組相比，P ＜0.05；b 表示與鋁佐劑疫苗組相比，P ＜0.05；c 表示與鋁佐劑疫苗組相比，P ＜0.05；d 表示與殼聚糖佐劑疫苗組相比，P ＜0.05。

35 d 0.017 9±0.002 4 0.040 3±0.003 1c，d 0.017 5±0.003 5 0.019 6±0.001 1 0.019 8±0.000 4 0.030 1±0.002 2a組別PBS DT鋁佐劑殼聚糖佐劑鋁佐劑疫苗殼聚糖佐劑疫苗0 d 0.016 4±0.000 8 0.015 8±0.001 1 0.015 5±0.002 7 0.016 1±0.000 5 0.015 5±0.000 4 0.017 3±0.002 2 7 d 0.018 5±0.000 6 0.023 6±0.001 7 0.016 2±0.000 5 0.021 2±0.005 1 0.020 1±0.004 7 0.019 8±0.000 4 21 d 0.018 4±0.000 6 0.049 5±0.002 2c，d 0.018 2±0.001 2 0.020 6±0.001 4 0.023 3±0.002 1 0.038 2±0.001 5a，b

3 討論

既往研究表明，疫苗的有效應(yīng)用需要合適的抗原傳遞系統(tǒng)，即疫苗的應(yīng)用存在佐劑依賴性或載體依賴性，因此，安全有效的疫苗佐劑是增強(qiáng)疫苗免疫應(yīng)答作用的關(guān)鍵［19］。研究表明，殼聚糖可有效促進(jìn)局部（特別是黏膜局部）免疫反應(yīng)，增強(qiáng)抗原傳遞系統(tǒng)功能，具有免疫佐劑效應(yīng)［14，20］。本研究首次將殼聚糖應(yīng)用于DT 疫苗，發(fā)現(xiàn)以殼聚糖為佐劑的DT 疫苗能夠有效激發(fā)小鼠的體液免疫，同時(shí)可誘導(dǎo)傳統(tǒng)鋁佐劑疫苗無法誘導(dǎo)的黏膜免疫。研究結(jié)果提示，殼聚糖具有替代鋁佐劑成為DT 疫苗佐劑的潛力，同時(shí)具有鼻滴疫苗制備潛力。

安全性是疫苗研發(fā)及應(yīng)用的首要前提，本研究首先對(duì)殼聚糖佐劑及以其為佐劑的DT 疫苗進(jìn)行安全性檢測(cè)，對(duì)各組實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行狀態(tài)觀察［21］，實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，各組小鼠無死亡現(xiàn)象發(fā)生。疫苗注射的不良反應(yīng)通常包括局部紅腫、疼痛及低熱疲倦等［22］，本研究通過對(duì)小鼠精神狀態(tài)、體溫及大小便觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)小鼠未出現(xiàn)疫苗注射不良反應(yīng)，且在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)未出現(xiàn)流淚等黏膜刺激癥狀。提示殼聚糖及以其為佐劑的疫苗應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，不良反應(yīng)及黏膜刺激性較小，安全性良好，殼聚糖可考慮作為疫苗佐劑成分使用。

明確殼聚糖及以其為佐劑的疫苗安全性后，進(jìn)一步對(duì)殼聚糖作為DT 疫苗佐劑的有效性進(jìn)行研究。C.diphtheriae屬于胞外菌，主要依靠其產(chǎn)生的白喉毒素發(fā)揮作用［23］。C.diphtheriae感染后，機(jī)體主要依靠體液免疫產(chǎn)生特異性抗體中和毒素發(fā)揮免疫保護(hù)作用。雖然IgM 是初次免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體，但在長久保護(hù)和中和毒素方面，IgG 抗體起著重要作用［18］。因此，本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)IgG 抗體對(duì)殼聚糖佐劑疫苗的體液免疫效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，殼聚糖佐劑疫苗免疫21 及35 d，小鼠血清白喉IgG 抗體水平明顯增加，殼聚糖佐劑疫苗有效誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生了具有完全保護(hù)水平的抗體，有效誘導(dǎo)了小鼠體液免疫，在保護(hù)性抗體產(chǎn)生上具備有效性，表明殼聚糖佐劑疫苗具有一定的免疫原性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，殼聚糖佐劑疫苗誘導(dǎo)小鼠體液免疫的能力與鋁佐劑疫苗相似，由于鋁佐劑存在神經(jīng)系統(tǒng)毒副反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的可能，殼聚糖佐劑可考慮作為鋁佐劑的替代，消除鋁佐劑引起的不良反應(yīng)。C.diphtheriae主要通過飛沫或氣溶膠經(jīng)呼吸道傳播，在鼻黏膜上皮細(xì)胞的黏附定植是其致病的第一步，因此，黏膜免疫系統(tǒng)及sIgA 在預(yù)防C.diphtheriae感染中發(fā)揮重要作用，有效誘導(dǎo)黏膜免疫可在一定程度上降低C.diphtheriae感染發(fā)生［24-25］。優(yōu)于鋁佐劑疫苗的是，殼聚糖佐劑疫苗在免疫21 d 誘導(dǎo)sIgA 產(chǎn)生增加，提示其可有效誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物黏膜免疫。因此，殼聚糖佐劑DT 疫苗具有鼻滴疫苗的潛力。

綜上所述，殼聚糖佐劑及以其為佐劑的DT 疫苗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中具有良好的安全性和有效性，殼聚糖可考慮作為鋁佐劑的替代，應(yīng)用于DT 疫苗。后續(xù)將對(duì)殼聚糖及其為佐劑的DT 疫苗對(duì)機(jī)體的保護(hù)性作用進(jìn)一步深入研究。