耿寧蔚，郭志云，呂澤昊，李 靖，李 寧

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271000）

隨著規(guī)?；B(yǎng)鴨場(chǎng)的迅速擴(kuò)張，鴨傳染病的發(fā)病率越來(lái)越高，這不僅損害了養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展，而且部分疾病還可能會(huì)對(duì)公共健康造成一定威脅[1]。鴨坦布蘇病毒（duck Tembusu virus,DTMUV）自2010 年暴發(fā)以來(lái)，該病已經(jīng)成為嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的重大疫病之一。DTMUV 感染產(chǎn)蛋鴨，導(dǎo)致卵巢出血，產(chǎn)蛋量急劇下降，它還會(huì)導(dǎo)致雛鴨發(fā)熱、生長(zhǎng)遲緩和神經(jīng)癥狀[2]。有報(bào)道顯示，養(yǎng)殖場(chǎng)工作人員可攜帶DTMUV 抗體，且該病毒可感染人神經(jīng)細(xì)胞，因此，深入研究該病的致病機(jī)制，不僅有利于保障養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展，還具有非常重要的公共衛(wèi)生意義[3]。

巨噬細(xì)胞是廣泛分布于全身血液和組織的免疫細(xì)胞，作為抵抗微生物感染的第一道防線之一，它們通過(guò)分泌大量的細(xì)胞因子來(lái)促進(jìn)和協(xié)調(diào)宿主免疫[4]。極化對(duì)巨噬細(xì)胞的生物功能至關(guān)重要，而巨噬細(xì)胞極化在炎癥發(fā)展中非常重要。在不同外界刺激下，巨噬細(xì)胞極化可分為兩種類型：經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞（M1）和交替激活的巨噬細(xì)胞（M2）。M1 型巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生大量促炎癥細(xì)胞因子，如TNFα、IL-6、CXCL-8 和IL-1β，在促炎癥、組織損傷、抗腫瘤和防腐方面起作用，主要參與Th1 型免疫反應(yīng)。M2 巨噬細(xì)胞主要參與Th2 型免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗炎、組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)作用[5]。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和病毒

雞骨髓巨噬細(xì)胞系HD11 由上海諾萊生物技術(shù)有限公司提供。DTMUV FX2010 株（登錄號(hào)：MH414568.1）在BHK-21 細(xì)胞上進(jìn)行增殖，并收集細(xì)胞上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 熒光定量PCR（qPCR）

用Trizol（TaKaRa，大連，中國(guó)）提取細(xì)胞樣本總RNA。使用HiScript? III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）kit（諾唯贊，南京，中國(guó)）將100 μg 的總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用表1 中的引物進(jìn)行qPCR 反應(yīng)。qPCR 的體系為20 μL，具體包括1 μL cDNA（25 ng），上下游引物（10 μM）各 0.4 μL，10 μL SYBR Green 和3.2 μL 無(wú)菌水。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s 一個(gè)循環(huán)，然后40 個(gè)循環(huán)95 ℃5 s 和60 ℃ 30 s。

表1 引物序列

1.3 亞硝酸鹽檢測(cè)

用Griess 方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的亞硝酸鹽（M1 巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一氧化氮的穩(wěn)定代謝物）的濃度。在本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞上清液中的一氧化氮濃度是用一氧化氮檢測(cè)試劑盒（Beyotime，上海，中國(guó)）測(cè)定。首先，取出Griess 試劑I 和II 讓其恢復(fù)到室溫。將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（1～100 μM）用含10%FBS 的RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋。然后將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)上清液以50 μL/孔加入96 孔板中。在有樣品的孔中以50 μL/孔加入Griess Reagent I，在每個(gè)孔中以50 μL/孔加入Griess Reagent II。依次加入96 孔板后，靜置10 min，用酶標(biāo)儀在540 nm 處測(cè)量吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中一氧化氮的濃度。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)

M1 型HD11 巨噬細(xì)胞的細(xì)胞表面分子用FITC 結(jié)合的抗雞MHC-II 抗體（abcam，英國(guó)）染色。用胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，然后用5%血清阻斷，使用抗體（1:500，批號(hào)ab24882）避光孵化，每一步前后樣品經(jīng)PBS 洗滌，最后用500 μL PBS 重新懸浮細(xì)胞，并立即用 LSR Fortessa 流式細(xì)胞儀（BD Biosciences，美國(guó)）進(jìn)行檢測(cè)。使用FlowJo 軟件（BD Biosciences，美國(guó)）對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

qPCR 數(shù)據(jù)使用2-ΔΔct方法進(jìn)行分析。從三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中獲得的數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（MEAN±SD）表示。使用GraphPad Prism 5.0（GraphPad Software, San Diego, CA）進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與作圖。兩組數(shù)據(jù)通過(guò)student’s t 檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析。*P<0.05 和**P<0.01 分別表示差異顯著和極顯著。

2 結(jié)果

2.1 qPCR 檢測(cè)DTMUV 感染后對(duì)HD11 巨噬細(xì)胞極化的影響

通過(guò)qPCR 檢測(cè)接毒和LPS 處理后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HD11 巨噬細(xì)胞極化的影響，發(fā)現(xiàn)DTMUV感染巨噬細(xì)胞后對(duì)M1 型巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志因子，包括CXCL-8、IL-1β、iNOS、CD86 等具有顯著誘導(dǎo)作用，并且上調(diào)倍數(shù)高達(dá)1 500 多倍，而對(duì)M2 型極化標(biāo)志因子，如IL-10、IL-4、CD206 等激活作用較弱。結(jié)果初步表明，DTMUV 感染誘導(dǎo)HD11 巨噬細(xì)胞發(fā)生M1 型極化（圖1）。

圖1 qPCR 檢測(cè)接毒后HD11 細(xì)胞M1 和M2 極化相關(guān)因子

2.2 M1 型巨噬細(xì)胞極化關(guān)鍵因子iNOS 的檢測(cè)

通過(guò)2.1 的結(jié)果分析表明，DTMUV 主要引起HD11 巨噬細(xì)胞發(fā)生M1 型極化，所以進(jìn)一步驗(yàn)證DTMUV 感染后對(duì)M1 型巨噬細(xì)胞極化關(guān)鍵因子iNOS 的影響。由于一氧化氮并不穩(wěn)定，其會(huì)代謝為亞硝酸鹽，所以對(duì)亞硝酸鹽的濃度進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，DTMUV 感染HD11 巨噬細(xì)胞后亞硝酸鹽濃度顯著升高（圖2）。

圖2 DTMUV 感染HD11 巨噬細(xì)胞后亞硝酸鹽濃度檢測(cè)

2.3 M1 型巨噬細(xì)胞關(guān)鍵因子MHC-Ⅱ的檢測(cè)

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)DTMUV 感染后對(duì)M1 型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)特征因子MHC-Ⅱ的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在DTMUV 感染后3 h 就顯著激活MHC-II 的表達(dá)，表明病毒能有效激活禽巨噬細(xì)胞的M1 型極化。

3 討論與結(jié)論

多項(xiàng)研究報(bào)道，禽巨噬細(xì)胞是DTMUV 感染的關(guān)鍵靶細(xì)胞，被感染的巨噬細(xì)胞對(duì)DTMUV 的復(fù)制、傳播和致病機(jī)制至關(guān)重要[6]。此外，巨噬細(xì)胞在病毒感染情況下會(huì)發(fā)揮不同功能作用，不僅有利于抵抗病毒，還有可能促進(jìn)病毒復(fù)制和傳播[7]。特別是病毒感染后激活M1 型巨噬細(xì)胞極化，可能引起細(xì)胞因子風(fēng)暴，對(duì)宿主造成炎癥損害[8]。首先通過(guò)熒光定量PCR 檢測(cè)了DTMUV 感染后對(duì)M1 和M2 巨噬細(xì)胞極化相關(guān)因子的影響，發(fā)現(xiàn)DTMUV 感染HD11 巨噬細(xì)胞后主要激活M1 型極化相關(guān)因子的表達(dá)。文獻(xiàn)報(bào)道，亞硝酸濃度檢測(cè)可以作為極化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[9]，通過(guò)亞硝酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)一步檢測(cè)了DTMUV 感染HD11巨噬細(xì)胞后亞硝酸鹽的含量，發(fā)現(xiàn)病毒感染顯著升高了亞硝酸鹽濃度，因亞硝酸鹽是一氧化氮的穩(wěn)定代謝物，因此亞硝酸鹽濃度的檢測(cè)作為M1型巨噬細(xì)胞檢測(cè)指標(biāo)，亞硝酸鹽濃度的升高表明，DTMUV 感染后顯著誘導(dǎo)M1 型巨噬細(xì)胞極化。MHC-Ⅱ是巨噬細(xì)胞極化后激活產(chǎn)生的細(xì)胞表面因子[10]，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MHC-Ⅱ的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DTMUV 感染HD11 細(xì)胞后從3 h 就顯著誘導(dǎo)MHC-Ⅱ的表達(dá)。

綜合上述結(jié)果分析表明，鴨坦布蘇病毒感染HD11 細(xì)胞后3 h 就可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生M1 型功能極化，并產(chǎn)生大量炎性因子，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)闡明極化分子機(jī)制鑒定基礎(chǔ)。