鄧亞勝 黃 慧 梁天薇 林 江

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,廣西南寧市 530000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種反復(fù)發(fā)作的結(jié)直腸慢性非特異性炎癥疾病[1],主要臨床癥狀為腹痛、腹瀉及黏液膿血便等,通過結(jié)腸鏡和組織病理學(xué)檢查可明確診斷[2]。目前,UC的發(fā)病機(jī)制尚未明確,大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與遺傳易感性、上皮屏障缺陷、免疫反應(yīng)失調(diào)、環(huán)境等因素有關(guān)[3-5]。UC病變范圍廣,病變部位常累及直腸、降結(jié)腸,甚至可以延伸至整個(gè)結(jié)腸,病情反復(fù),遷延難愈,可發(fā)生于任何年齡段,被WHO列為現(xiàn)代難治病之一[6]。

西醫(yī)治療UC的主要藥物有氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素類、免疫抑制劑、抗生素及生物制劑等[7-9],用藥后癥狀得以緩解,但長期服用可能會(huì)出現(xiàn)胃腸道反應(yīng)、過敏反應(yīng)、激素副作用、感染等副作用。部分患者可選擇手術(shù)治療,但手術(shù)指征多為增生或病變、病情遷延難愈、藥物控制不佳或不耐受等[8]。因此,亟須尋找可以治療UC的新方法以改善患者的癥狀,提高療效。中醫(yī)藥治療UC歷史悠久,且獲得較好的療效[10-11]。其中,連理湯是治療UC的常用方劑,全方由干姜、甘草(炙)、黃連、茯苓、白術(shù)、人參組成。祁正平[12]采用連理湯治療UC,其臨床總有效率高達(dá)95.24%,高于采用美沙拉嗪治療的對照組;趙靜等[13]發(fā)現(xiàn),與柳氮磺胺吡啶治療相比,連理湯治療UC的療效更顯著。因連理湯具有多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn),其治療UC的作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種以疾病、靶點(diǎn)、基因和藥物相互作用網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ),集計(jì)算機(jī)生物學(xué)、蛋白組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)于一體的分析方法。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接技術(shù)探討連理湯治療UC的作用機(jī)制,以期為連理湯治療UC作用機(jī)制的探索提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 連理湯性味-歸經(jīng)的檢索 通過查閱《中華人民共和國藥典(2020年版)》及《中藥學(xué)(新世紀(jì)第五版)》,獲取連理湯所含藥物的性味、歸經(jīng),并使用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建“性味-歸經(jīng)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 連理湯活性化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn)的篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP;https://tcmsp-e.com/)檢索連理湯的活性化學(xué)成分,并設(shè)置藥物相似性(drug-likeness,DL)≥0.18、口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%為活性化學(xué)成分的篩選標(biāo)準(zhǔn)。然后在該平臺(tái)上檢索活性化學(xué)成分對應(yīng)的作用靶點(diǎn),剔除尚無明確作用靶點(diǎn)的活性化學(xué)成分。在UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)中,將物種設(shè)置為人類,將作用靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因名,匯總后去重。

1.3 UC相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 以“Ulcerative Colitis”為關(guān)鍵詞,在TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)、OMIM?數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(https://www.pharmgkb.org/)、CTD數(shù)據(jù)庫(http://ctdbase.org/)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)、GeneCards?數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、DISEASES數(shù)據(jù)庫(https://diseases.jensenlab.org/)檢索UC相關(guān)靶點(diǎn),檢索時(shí)間為建庫至2021年10月23日?？紤]到CTD數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫、GeneCards?數(shù)據(jù)庫、DISEASES數(shù)據(jù)庫中的靶點(diǎn)過多,分別以推理分?jǐn)?shù)>15、Scoregda≥0.05、關(guān)聯(lián)分?jǐn)?shù)>5、Z值≥4為篩選標(biāo)準(zhǔn),對檢索到的靶點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步篩選。匯總上述8個(gè)數(shù)據(jù)庫檢索得到的靶點(diǎn),進(jìn)行格式調(diào)整、標(biāo)準(zhǔn)基因名轉(zhuǎn)換等處理后刪除重復(fù)的靶點(diǎn),獲得UC的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 “中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將1.2和1.3得到的靶點(diǎn)導(dǎo)入Draw Venn Diagram在線工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制韋恩圖,獲得交集靶點(diǎn),即為連理湯治療UC的相關(guān)靶點(diǎn)。把連理湯活性化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件中,利用Network Analyzer插件的Merge功能繪制“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)篩選出主要活性化學(xué)成分。

1.5 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的提取 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)中,將置信度設(shè)為>0.4,獲取蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),并保存為TSV格式文件。將該TSV文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件,利用Network Analyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析,并進(jìn)行可視化展示,選取度值排名前10的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。

1.6 功能富集分析與通路富集分析 為進(jìn)一步了解連理湯治療UC所涉及的生物過程、分子功能、細(xì)胞組分及信號通路,將交集靶點(diǎn)上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/),限定物種為人類,進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。根據(jù)Benjamini-Hochberg矯正法,按-lgP值由大到小對富集分析結(jié)果進(jìn)行排序,設(shè)定P<0.05為篩選條件,篩選出排名前20的信號通路及排名前10的生物過程、分子功能、細(xì)胞組分。

1.7 分子對接 將“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)篩選得到的主要活性化學(xué)成分作為配體蛋白,將PPI網(wǎng)絡(luò)篩選得到的核心靶點(diǎn)作為受體蛋白。首先在RCSB-PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)中獲取上述蛋白的“PDB”格式,并在TCMSP平臺(tái)下載活性化學(xué)成分的“MOL2”格式,利用AutoDock 1.5.6軟件對受體蛋白和配體蛋白進(jìn)行去水、加氫、計(jì)算電荷及尋找可旋轉(zhuǎn)化學(xué)鍵等處理,再根據(jù)受體蛋白和配體蛋白大小設(shè)置合適的對接盒子,并利用Lamarckian遺傳算法進(jìn)行分子對接,最后在Pymol軟件中進(jìn)行可視化分析。對接結(jié)合能越小,說明受體與配體對接的穩(wěn)定程度越高。

2 結(jié) 果

2.1 連理湯“性味-歸經(jīng)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 通過查閱《中華人民共和國藥典(2020年版)》及《中藥學(xué)(新世紀(jì)第五版)》,獲取干姜、甘草(炙)、黃連、茯苓、白術(shù)、人參的性味和歸經(jīng),構(gòu)建連理湯“性味-歸經(jīng)”網(wǎng)絡(luò),見圖1。由圖可知,本方性味辛、溫、熱升散,苦、寒降泄,甘、淡滲利;歸經(jīng)則上中下三焦兼顧。全方寒熱共用,苦辛并進(jìn),輔以補(bǔ)益。

圖1 連理湯“性味-歸經(jīng)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 連理湯活性化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn)的篩選結(jié)果 通過TCMSP初步獲取干姜、甘草(炙)、黃連、茯苓、白術(shù)、人參6味中藥的化學(xué)成分分別為148個(gè)、280個(gè)、48個(gè)、34個(gè)、55個(gè)、190個(gè),以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為條件篩選得到連理湯的活性化學(xué)成分155個(gè),其中干姜5個(gè)、甘草(炙)92個(gè)、黃連14個(gè)、茯苓15個(gè)、白術(shù)7個(gè)、人參22個(gè),剔除未找到相應(yīng)作用靶點(diǎn)的活性化學(xué)成分后,上述各組分的活性化學(xué)成分分別為5個(gè)、86個(gè)、11個(gè)、6個(gè)、4個(gè)、1個(gè),其中干姜、人參存在共有活性化學(xué)成分β-谷甾醇(MOL000358),干姜、甘草(炙)存在共有活性化學(xué)成分谷甾醇(MOL000359),黃連、甘草(炙)存在共有活性化學(xué)成分槲皮素(MOL000098),排除重復(fù)活性化學(xué)成分后,連理湯的活性化學(xué)成分共為110個(gè)。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫將110個(gè)活性化學(xué)成分對應(yīng)的2 146個(gè)靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因名,匯總后去重,最終得到229個(gè)作用靶點(diǎn)。

2.3 UC相關(guān)靶點(diǎn)的篩選結(jié)果 在TTD數(shù)據(jù)庫、DrugBank數(shù)據(jù)庫、OMIM?數(shù)據(jù)庫、PharmGKB數(shù)據(jù)庫中獲得UC相關(guān)靶點(diǎn)分別為39個(gè)、69個(gè)、7個(gè)、14個(gè)。在CTD數(shù)據(jù)庫中獲得UC相關(guān)靶點(diǎn)15 500個(gè),以推理分?jǐn)?shù)>15為條件篩選得到UC相關(guān)靶點(diǎn)987個(gè);在DisGeNET數(shù)據(jù)庫中獲得UC相關(guān)靶點(diǎn)1 458個(gè),以Scoregda≥0.05為條件篩選得到UC相關(guān)靶點(diǎn)349個(gè);在GeneCards?數(shù)據(jù)庫中獲得UC相關(guān)靶點(diǎn)4 800個(gè),以關(guān)聯(lián)分?jǐn)?shù)>5為條件篩選得到UC相關(guān)靶點(diǎn)549個(gè);在DISEASES數(shù)據(jù)庫中獲得UC相關(guān)靶點(diǎn)8 577個(gè),以Z值≥4為條件篩選得到UC相關(guān)靶點(diǎn)131個(gè)。將上述數(shù)據(jù)庫獲得的相關(guān)靶點(diǎn)去重合并,共獲得UC相關(guān)靶點(diǎn)1 538個(gè)。將1 538個(gè)UC相關(guān)靶點(diǎn)與229個(gè)連理湯活性化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)取交集,共獲得134個(gè)交集靶點(diǎn),即連理湯治療UC的相關(guān)靶點(diǎn)。見圖2。

圖2 連理湯活性化學(xué)成分作用靶點(diǎn)與UC相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖

2.4 “中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 采用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,此網(wǎng)絡(luò)圖包含455個(gè)節(jié)點(diǎn),2 167條邊,見圖3。使用Network Analyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析,依次提取大于2倍中位數(shù)及1倍中位數(shù)的度值,最終度值中位數(shù)為30,篩選出度值>30的主要活性化學(xué)成分有11個(gè),包括槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、異鼠李素等,見表1。

表1 11個(gè)主要活性化學(xué)成分信息表

圖3 “中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 連理湯治療UC相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)的篩選結(jié)果 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中,獲取連理湯治療UC相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖4A),該網(wǎng)絡(luò)圖由134個(gè)節(jié)點(diǎn)、2 804條邊組成,平均節(jié)點(diǎn)度為41.9,平均局部聚類系數(shù)為0.688。使用Network Analyzer插件對該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析,計(jì)算出拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)度值,以度值≥84為條件篩選出10個(gè)核心靶點(diǎn),分別為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(serine/threonine protein kinase 1,AKT1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、腫瘤抑癌蛋白p53(tumor suppressor protein p53,TP53)、IL-1B、原癌基因C-Jun(proto-oncogene C-Jun,JUN)、Caspase-3、前列腺素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2(prostaglandin endoperoxide synthase 2,PTGS2)、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)3,見圖4B。

圖4 連理湯治療UC相關(guān)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶點(diǎn)

2.6 KEGG通路富集分析結(jié)果 將交集靶點(diǎn)上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG通路富集分析,共得到116條信號通路(P<0.05),根據(jù)-lgP值由大到小進(jìn)行排序,排名前20的信號通路包括乙型肝炎、癌癥相關(guān)通路、TNF信號通路、弓形體病、缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K-AKT)信號通路、小細(xì)胞肺癌、Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)信號通路、p53信號通路、核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號通路、T細(xì)胞受體信號通路等,見表2和圖5。

圖5 連理湯治療UC的KEGG通路富集分析氣泡圖

2.7 GO功能富集分析 將交集靶點(diǎn)上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能富集分析,共獲得526條生物過程條目、46條細(xì)胞組分條目、84條分子功能條目(P<0.05)。根據(jù)-lgP值由大到小進(jìn)行排序,其中生物過程條目以藥物反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、凋亡過程、炎癥反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等為主;細(xì)胞組分條目以細(xì)胞核、胞質(zhì)溶膠、蛋白質(zhì)復(fù)合物、膜筏、核質(zhì)等為主;分子功能條目以酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子活性、類固醇激素受體活性、蛋白激酶結(jié)合等為主,見圖6。

圖6 連理湯治療UC的GO功能富集分析氣泡圖

2.8 分子對接 將“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中的主要活性化學(xué)成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接,同時(shí)記錄對接結(jié)合能,見表3和圖7。結(jié)果顯示,MAPK3與主要活性化學(xué)成分均沒有完成對接,而異鼠李素與PTGS2對接結(jié)合能為-10.4 kcal/mol,對接穩(wěn)定性最好,其次為山柰酚與STAT3的對接結(jié)合能,為-10.1 kcal/mol,部分分子對接的可視化模型見圖8。分子對接結(jié)合能<-5.0 kcal/mol提示結(jié)合活性強(qiáng),本研究中大部分主要活性化學(xué)成分與核心靶點(diǎn)對接的結(jié)合能均<-5 kcal/mol,說明連理湯中各中藥的主要活性化學(xué)成分與核心靶點(diǎn)對接較穩(wěn)定。

表3 分子對接結(jié)合能(kcal/mol)

圖7 分子對接結(jié)合能熱圖

圖8 部分分子對接的模型圖

3 討 論

在中醫(yī)學(xué)上UC被稱為“痢疾”“腸游”“滯下”“泄瀉”“腸風(fēng)”“腸癖”等,病位在大腸,涉及肝、脾、肺、腎等臟器,病程漫長。中醫(yī)認(rèn)為UC以素體脾氣虛弱為發(fā)病基礎(chǔ),以飲食不潔、情志失調(diào)、感受外邪等為主要發(fā)病誘因[14]?；颊咂馓撊?運(yùn)化傳導(dǎo)失司,釀生濕熱之邪,導(dǎo)致氣血搏結(jié),腸道絡(luò)脈受損,脂膜腐敗潰爛,腐敗之物化為膿血,故而引起本病。連理湯首載于《秘傳證治要訣及類方》,方由干姜、甘草(炙)、黃連、茯苓、白術(shù)、人參組成。方中干姜辛熱,溫中散寒,回陽通脈,為君藥。黃連苦寒,清熱燥濕,入胃、大腸經(jīng),清腸胃濕熱之邪,為臣藥;君臣相合,平調(diào)寒熱,辛開苦降,且干姜能防黃連苦寒傷陰之弊,黃連又可制干姜辛溫助熱之失。人參甘而微溫,補(bǔ)氣健脾;白術(shù)苦溫,健脾燥濕,助人參健脾而復(fù)升降;茯苓甘淡,利水滲濕,健脾,三藥共為佐藥。甘草(炙)甘溫,補(bǔ)中益氣,緩急止痛,兼和諸藥,為使藥。諸藥寒熱并用,升降共調(diào),共奏清熱燥濕、補(bǔ)氣健脾之效。臨床研究顯示,連理湯可以改善UC患者臨床癥狀,提高患者生活質(zhì)量[15-16]。但連理湯治療UC的機(jī)制尚未明確,故本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究連理湯治療UC的活性化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)及相關(guān)信號通路,為連理湯的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示,連理湯的主要活性化學(xué)成分為槲皮素、山柰酚、異鼠李素、柚皮素、芒柄花黃素、β-谷甾醇等。其中,山柰酚、槲皮素、異鼠李素、柚皮素均屬于黃酮類化合物,β-谷甾醇屬于甾醇類化合物,芒柄花黃素是一種異黃酮類植物雌激素。研究表明,槲皮素具有抗腫瘤、抗炎、抗微生物、抗氧化等作用,但其作用機(jī)制尚未明確。有學(xué)者認(rèn)為,槲皮素通過抑制環(huán)氧化酶2、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、NF-κB、激活蛋白1(activator protein 1,AP-1)和MAPK的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用[17-18]。同時(shí),槲皮素還能抑制TNF-α的產(chǎn)生,而TNF-α是一種多功能細(xì)胞因子,可調(diào)節(jié)活化白細(xì)胞的生長、增殖、分化和活力,同時(shí)還會(huì)誘發(fā)其他細(xì)胞因子、趨化因子等炎癥介質(zhì)的表達(dá)[19-20]。此外,槲皮素還通過干擾細(xì)胞周期[21]、抑制存活信號蛋白(蛋白激酶C-α)和激活死亡信號蛋白(蛋白激酶C-δ)[22]等發(fā)揮抗腫瘤作用。山柰酚主要通過抑制TLR4/NF-κB通路的激活來改善腸道屏障的完整性,并抑制腸道炎癥[23-24]。異鼠李素、柚皮素通過抑制NF-κB的激活,同時(shí)抑制巨噬細(xì)胞iNOS的表達(dá)和一氧化氮的產(chǎn)生,發(fā)揮抗炎作用[25-27]。研究顯示,β-谷甾醇可通過濃度依賴的方式降低結(jié)腸炎小鼠模型腸道組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)水平,從而促進(jìn)腸上皮細(xì)胞抗菌肽的表達(dá),同時(shí)抑制腸道致病菌的存活,避免腸道受到炎癥的影響[28]。此外,β-谷甾醇還可以通過抑制NF-κB通路中脂多糖與TLR4的結(jié)合來減輕高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠腸道炎癥[29]。芒柄花黃素可作用于多條致癌信號通路,包括PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路、酪氨酸蛋白激酶和信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子信號通路和胰島素生長因子1/胰島素生長因子1受體信號通路,從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移過程[30-33]。上述研究表明連理湯的多個(gè)藥物活性成分通過抗腫瘤、抗炎等機(jī)制,發(fā)揮治療UC的作用。

本研究通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),得出AKT1、TNF、IL-6、TP53、IL-1B、JUN、Caspase-3、PTGS2、STAT3、MAPK3是連理湯治療UC的核心靶點(diǎn)。其中,TNF有抗感染、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)細(xì)胞增殖分化等功能,對機(jī)體具有一定保護(hù)作用,而高水平TNF可引起局部炎癥反應(yīng)[34]。IL-6參與機(jī)體細(xì)胞免疫、體液免疫的調(diào)節(jié),在自身免疫、炎癥反應(yīng)等方面起重要作用[35]。PTGS2又稱為誘導(dǎo)型環(huán)氧合酶2,在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[36],是前列腺素生物合成中的關(guān)鍵酶,在細(xì)菌脂多糖、真菌病原體和炎癥細(xì)胞因子等刺激下,可促進(jìn)前列腺素的表達(dá)[37]。AKT1是AKT家族成員之一,可增強(qiáng)細(xì)胞自噬,從而降低炎癥因子的表達(dá)[38]。TP53是防止突變細(xì)胞擴(kuò)增的重要“守護(hù)者”,寬型TP53是一種腫瘤抑制基因,當(dāng)機(jī)體發(fā)生DNA損傷時(shí)可以延緩細(xì)胞周期的進(jìn)程[39]。IL-1B是編碼促炎因子IL-1β的基因,異常的免疫應(yīng)答可引起IL-1β的異常激活,導(dǎo)致腸黏膜損傷,其在UC的發(fā)展中起到關(guān)鍵作用[40]。作為原癌基因的JUN目前尚未有研究證實(shí)其與UC相關(guān),但其細(xì)胞同源物AP-1轉(zhuǎn)錄因子與癌癥和腫瘤轉(zhuǎn)化有關(guān),AP-1參與多種細(xì)胞活動(dòng),包括分化、增殖、存活和凋亡等[41]。AP-1轉(zhuǎn)錄因子已被證明可以激活或抑制iNOS表達(dá)[42],UC患者結(jié)腸黏膜中iNOS表達(dá)明顯增高,表明其與UC的發(fā)病關(guān)聯(lián)密切[43]。Caspase-3屬于Caspase蛋白家族成員之一,在細(xì)胞凋亡和致癌過程中起到關(guān)鍵作用[44],腸道黏膜上的Caspase-3異常表達(dá)會(huì)激發(fā)T淋巴細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的抵抗力,引起T淋巴細(xì)胞積累和慢性腸道炎癥的產(chǎn)生[45]。MAPK3是絲裂原活化蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要組成部分,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、分裂和凋亡[46],在UC的發(fā)病中起到重要作用,其激活被認(rèn)為是導(dǎo)致UC細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)釋放的主要原因之一,抑制MAPK信號通路是治療UC的重要手段[47]。STAT3是免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子,可以被以IL-6為代表的促炎因子激活,可通過免疫應(yīng)答、介導(dǎo)炎癥信號傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)黏膜屏障及促進(jìn)腸道纖維化等多方面參與UC的發(fā)展[48-49]。

本研究中GO功能富集分析結(jié)果顯示,連理湯治療UC的相關(guān)靶點(diǎn)主要涉及蛋白質(zhì)復(fù)合物、核質(zhì)、細(xì)胞外間隙、胞質(zhì)溶膠等細(xì)胞組分,以及酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子活性等分子功能,這些靶點(diǎn)可通過凋亡過程、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)等生物過程來發(fā)揮治療UC的作用。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,連理湯治療UC涉及的信號通路包括TNF信號通路、TLR信號通路、PI3K-AKT信號通路、NF-κB信號通路、p53信號通路、癌癥相關(guān)通路、HIF-1信號通路等。研究顯示,UC的發(fā)生是由于完整的腸黏膜免疫屏障遭到破壞所引起[50-51],而腸黏膜免疫屏障遭到破壞后,腸道免疫反應(yīng)被異常激活,TLR信號通路和NF-κB信號通路是參與腸道免疫反應(yīng)的核心通路[52]。TLR具有免疫防御和識別外來微生物的作用[53],當(dāng)TLR被激活后,可識別及結(jié)合病原體,促使髓樣分化因子88-IL1受體關(guān)聯(lián)激酶-TNF受體關(guān)聯(lián)因子6-轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶1信號復(fù)合體形成,從而激活NF-κB信號通路[54]。NF-κB是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,與UC的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切,NF-κB信號通路的激活不僅會(huì)加重炎癥反應(yīng),而且會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生與增殖,是加速UC病情進(jìn)展的重要因素[55-58]。AKT是一種原癌基因,具有調(diào)節(jié)不同細(xì)胞活動(dòng)的功能,包括細(xì)胞增殖、生長、存活、凋亡、代謝、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成,PI3K/AKT信號通路中的AKT活化后可激活NF-κB信號通路,從而參與UC的發(fā)生和發(fā)展過程[59]。此外,TNF信號通路[60-61]、p53信號通路[62]、HIF-1信號通路[63-64]等均與UC的發(fā)生密切相關(guān)。

綜上所述,連理湯主要通過異鼠李素、槲皮素、山柰酚等主要活性化學(xué)成分作用于AKT1、TNF、IL-6、TP53、IL-1B、JUN等靶點(diǎn),通過調(diào)節(jié)TNF信號通路、TLR信號通路、PI3K/AKT信號通路、NF-κB信號通路、p53信號通路、HIF-1信號通路等發(fā)揮抗炎、免疫調(diào)節(jié)、維持腸黏膜免疫屏障、調(diào)節(jié)腸道菌群等作用,從而達(dá)到治療UC的目的。