周惠玲 張卓成 陳建勇 梁惠強(qiáng) 曹令儀

耳聾是人類常見的感覺缺陷性疾病，位列各類殘疾之首，嚴(yán)重影響患者的日常溝通交流，降低其生活質(zhì)量。耳聾可發(fā)生于各年齡段，導(dǎo)致耳聾的原因主要有環(huán)境因素和遺傳因素，其中60%以上與遺傳因素有關(guān)［1］，而遺傳性耳聾是由基因或染色體異常等遺傳缺陷導(dǎo)致的，具有高度的遺傳異質(zhì)性［2］。根據(jù)臨床表型是否伴有耳外其他器官功能障礙和異常可分為綜合征性耳聾（syndromic hearing loss，SHI）和非綜合征性耳聾（non-syndromic hearing loss，NSHI），其中NSHI 占60%～70%［3］。根據(jù)遺傳方式不同耳聾可分為常染色體隱性遺傳（約占80%）、常染色體顯性遺傳（約占15%）、線粒體突變母系遺傳（約占1%）或X 連鎖遺傳（占2%～5%）［4］。

近年來(lái)，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步以及分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的飛速發(fā)展，人類已克隆了50 多個(gè)遺傳性耳聾基因，定位了100 多個(gè)NSHL 相關(guān)基因位點(diǎn)。但國(guó)內(nèi)耳聾基因的分子流行病學(xué)研究表明，我國(guó)大部分NSHI 由為數(shù)不多的幾個(gè)基因突變引起［5］，其中GJB2 和SLC26A4 基因是導(dǎo)致NSHI 常染色體隱性遺傳的主要致病基因，SLC26A4 基因突變僅次于GJB2 基因［6-9］。目前對(duì)耳聾的治療效果并不顯著，因此及時(shí)發(fā)現(xiàn)耳聾并且明確其病因，給予早期治療及科學(xué)指導(dǎo)，從而延緩病情進(jìn)展就顯得尤為重要［10］。本研究通過收集廣東省部分地區(qū)100 例NSHI 患者的臨床資料，并采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-熒光雜交發(fā)法檢測(cè)GJB2和SLC26A4 基因的14 個(gè)突變位點(diǎn)，分析該地區(qū)耳聾基因的流行情況，為遺傳性耳聾的防治工作提供理論依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2022年5月—2023年4月在本院耳鼻喉科就診的感音神經(jīng)性耳聾患者中，經(jīng)病史采集、體格檢查、聽力學(xué)及影像學(xué)檢查確診為NSHI的100 例患者作為研究對(duì)象。其中男性39 例，女性61 例；年齡8～87 歲，平均（50.19±19.45）歲。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ① 患者籍貫均為廣東地區(qū)，主要包括江門、中山、珠海等地；② 患者本人或監(jiān)護(hù)人均對(duì)本研究?jī)?nèi)容知情同意。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) SHI 或其他中樞性及外周性明確致病因素導(dǎo)致的耳聾患者。

1.1.3 倫理學(xué) 本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批（審批號(hào)：2023-102），所有檢測(cè)均獲得過受檢對(duì)象或家屬的知情同意。

1.2 儀器與試劑 本研究使用的核酸提取試劑盒為廣州美基生物科技有限公司提供的DNA 提取試劑盒（證書編號(hào)：粵穗械備20150062 號(hào)），擴(kuò)增儀器為ABI Proflex梯度PCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），使用Luminex MagPix 多功能懸浮點(diǎn)陣檢測(cè)儀（美國(guó)Luminex 公司）進(jìn)行檢測(cè)并分析結(jié)果。

1.3 聽力學(xué)診斷 采用電生理檢測(cè)方法，使用丹麥國(guó)際聽力公司提供的ECLISPE 聽覺腦干誘發(fā)電位測(cè)試儀對(duì)患者在隔音屏蔽室內(nèi)進(jìn)行測(cè)試。囑患者取舒適平臥位，閉目休息，保持平靜；給予短聲交替波刺激，刺激速率21.1 次/s，平均疊加次數(shù)為1 024 次，采用刺激強(qiáng)度為90 dBnHL 的記錄曲線，以兩次穩(wěn)定波形的疊加標(biāo)識(shí)Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波；以Ⅴ波反應(yīng)閾值作為2～4 kHz 聽力參考指標(biāo)，Ⅴ波反應(yīng)閾值＜30 dBnHL為正常聽力指標(biāo)。根據(jù)聽力損傷程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［11］，輕度聾：波V 反應(yīng)閾值為31～50 dBnHL；中度聾：51～70 dBnHL；重度聾：71～90 dBnHL；極重度聾：≥91 dBnHL。

1.4 影像學(xué)檢查 對(duì)疑似前庭水管病變的患者行64 排顳骨CT 平掃，診斷標(biāo)準(zhǔn)及分類按照Sennaroglu分類標(biāo)準(zhǔn)，分為單純前庭水管擴(kuò)大、大前庭導(dǎo)水管綜合征（large vestibular aqueduct syndrome，LVAS）、其他內(nèi)耳畸形及內(nèi)耳結(jié)構(gòu)正常［12］。

1.5 耳聾基因檢測(cè) 收集患者2 mL 外周血〔以乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetra-acetic acid，EDTA）抗凝〕，使用核酸提取試劑盒提取DNA。應(yīng)用PCR 儀對(duì)GJB2基因（包括508_511dup、299_300del、35delG、109 G＞A、176_191del、235delC位點(diǎn)）和SLC26A4基因（包括754T＞C、IVS7-2A＞G、1174A＞T、1229C＞T、1692dup、1975G＞C、2086C＞T、2168A＞G 位點(diǎn)）的14 個(gè)常見突變位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物與試劑盒微珠進(jìn)行雜交，使用多功能懸浮點(diǎn)陣檢測(cè)儀及配套軟件進(jìn)行檢測(cè)及信號(hào)收集，根據(jù)野生型探針/突變型探針信號(hào)（normal/mutation，N/M）的高低對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判讀。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 26.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較使用χ2檢驗(yàn)，如果n＜40，采用Fisher精確檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 聽力學(xué)檢查結(jié)果 49 例研究對(duì)象為輕度至極重度感音神經(jīng)性聾，雙側(cè)聽力下降28 例，單側(cè)聽力下降21 例。見表1。

表1 100 例NSHL 患者聽力學(xué)耳聾分類

2.2 耳聾基因檢測(cè)結(jié)果 100 例NSHL 患者中檢出34 例耳聾基因突變，突變檢出率為34.00%（34/100），其中單基因純合突變11 例，單基因雜合突變23 例，多基因復(fù)合突變2 例。雙側(cè)聽力下降組基因突變陽(yáng)性檢出率為51.78%（29/56），單側(cè)聽力下降組陽(yáng)性檢出率為11.36%（5/44），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝17.91，P＝0.00）。

本研究檢出GJB2 基因突變攜帶者34 例，檢出率為34.00%（34/100）。雙側(cè)聽力下降組陽(yáng)性檢出率為51.78%（29/56），單側(cè)聽力下降組陽(yáng)性檢出率為11.36%（5/44），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝17.91，P＝0.00）。其中單基因純合突變11 例，單基因雜合突變23 例。突變位點(diǎn)主要為c.109 G＞A，占比為91.17%（31/34），其次為c.235delC 突變，占比為8.82%（3/34），其中1 例為c.235delC 純合突變。檢出SLC26A4 基因突變攜帶者2 例，檢出率為2.00%（2/100），檢出c.IVS7-2A＞G 和c.1229C＞T 突變各1 例，均為雙側(cè)聽力下降組，且合并GJB2 突變，多基因復(fù)合突變率為2.00%。耳聾基因突變的檢出情況見表2。

表2 NSHL 患者基因突變位點(diǎn)的檢出情況

2.3 GJB2 基因c.109 G＞A 位點(diǎn)分析 GJB2 基因的c.109G＞A 位點(diǎn)突變?cè)诒狙芯恐械臋z出率較高，其中雜合突變21 例，純合突變10 例，患者受累耳數(shù)目與突變類型的關(guān)系無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.576）。見表3?；紓?cè)耳聽力障礙嚴(yán)重程度與突變類型的關(guān)系見表4。c.109G＞A 位點(diǎn)純合突變者以中、重度耳聾為主，雜合突變者以輕度耳聾為主。

表3 NSHL 患者受累耳數(shù)目與突變類型的關(guān)系

表4 NSHL 患者患側(cè)耳聽力障礙程度與突變類型的關(guān)系

GJB2 基因的c.109 G＞A （p.Val37Ile）位點(diǎn)突變是一種錯(cuò)義突變，導(dǎo)致其編碼的37 位氨基酸發(fā)生突變（纈氨酸變?yōu)楫惲涟彼幔?。檢索ClinVar 數(shù)據(jù)庫(kù)，致病性突變?cè)u(píng)分見圖1，將該點(diǎn)突變定義為致病性突變。使用SWISS-MODLE 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)突變位點(diǎn)模型，見圖2～3。

圖1 ClinVar 數(shù)據(jù)庫(kù)致病性突變?cè)u(píng)分

圖2 野生型GJB2 分子模型

圖3 GJB2 基因c.109 G ＞A（p.Val37Ile）位點(diǎn)分子模型

3 討論

遺傳性耳聾是臨床上常見的遺傳病，其發(fā)生由基因或染色體異常等遺傳缺陷導(dǎo)致，具有高度的遺傳異質(zhì)性，不同國(guó)家、地區(qū)和人群中耳聾基因的突變方式、突變頻率和突變位點(diǎn)均存在巨大差異，且不同人種和民族也有其自身特點(diǎn)。在我國(guó)的遺傳性耳聾患者中，約有35.5%與GJB2 或SLC26A4 基因突變有關(guān)［13］。本研究通過對(duì)廣東省部分地區(qū)NSHI患者的GJB2 及SLC26A4 基因突變位點(diǎn)進(jìn)行分析，了解該地區(qū)耳聾基因的突變熱點(diǎn)，從而為防聾治聾工作提供指導(dǎo)。

GJB2 基因突變是最常見的致聾原因，NSHI 患者攜帶率高達(dá)28%，常見的突變形式包括235delC、176-191dell、167delT、35delG 等位點(diǎn)［14］。GJB2 基因主要編碼縫隙連接蛋白26（connexin26，Cx26），該蛋白以六聚體形式結(jié)合，形成縫隙連接，是耳蝸內(nèi)鉀離子的運(yùn)輸通道，可維持耳蝸內(nèi)較高的水平電位，GJB2 基因突變可導(dǎo)致Cx26 蛋白出現(xiàn)功能缺陷，影響細(xì)胞間信號(hào)傳遞，減少鉀離子的再循環(huán)效率，導(dǎo)致患者聽力受損［15］。本研究中GJB2 基因的突變率為34.00%，高于全國(guó)GJB2 總致病突變率（12.88%）［16］，且明顯高于王蒙等［17］報(bào)道的廣東地區(qū)NSHI 患者的GJB2 基因突變攜帶率為9.47%，這可能是由于本研究檢測(cè)的突變位點(diǎn)數(shù)量較多，因此增加了檢出率。本研究可檢的GJB2 基因突變位點(diǎn)雖多，但100 例患者中只檢出c.235delC 和c.109G＞A 兩種突變，可能是納入研究的患者數(shù)量較少，導(dǎo)致突變檢出類型較少，且入組的患者年齡偏大，可能與遲發(fā)型耳聾相關(guān)。本研究中GJB2 基因c.235delC 位點(diǎn)的突變檢出率為3.00%，與王蒙等［17］報(bào)道一致。GJB2 基因突變所致的耳聾多發(fā)生于嬰幼兒時(shí)期，如本研究中年齡最小的患兒8 歲，為GJB2 基因c.235delC 位點(diǎn)純合突變攜帶者，較早出現(xiàn)嚴(yán)重的聽力損傷。一般不認(rèn)為GJB2 基因c.235delC 位點(diǎn)單雜合突變能致病，但本研究中有1 例35 歲患者攜帶c.235delC 位點(diǎn)單雜合突變，出現(xiàn)雙耳中度聽力下降，與李琦等［18］研究一致，c.235delC 位點(diǎn)單雜合突變攜帶者中年時(shí)即可出現(xiàn)中/高頻聽力損失。

GJB2 基因c.109 G＞A（p.Val37Ile）突變是一種錯(cuò)義突變，導(dǎo)致其編碼的氨基酸發(fā)生變化（纈氨酸變?yōu)楫惲涟彼幔?。該變異在我?guó)人群中有較高的檢出率（8%～12%），本研究中NSHI 患者的檢出率為34.00%（34/100），明顯高于人群攜帶率。過去認(rèn)為該突變是一種多態(tài)性改變，并不會(huì)直接導(dǎo)致遺傳性耳聾的發(fā)生［19］。但隨著研究深入，當(dāng)c.109 G＞A（p.Val37Ile）位點(diǎn)純合或單雜合變異與另一個(gè)單雜合致病突變同時(shí)存在時(shí)，可導(dǎo)致耳聾疾病發(fā)生［20］。Li等［21］研究表明，c.109 G＞A 位點(diǎn)純合或雜合突變可導(dǎo)致患者出生時(shí)輕度聽力下降，并隨著年齡的增長(zhǎng)進(jìn)行性加重，這可能是由于該位點(diǎn)突變?cè)黾恿擞刹涣辑h(huán)境因素導(dǎo)致的耳聾概率。查閱ClinVar 數(shù)據(jù)庫(kù)，將此突變定義為致病性突變，應(yīng)用SWISS-MODLE數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)突變位點(diǎn)模型，可以看出突變的氨基酸導(dǎo)致肽鏈空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，這可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的改變，從而引起一系列病變。本研究中NSHI患者的c.109 G＞A 位點(diǎn)突變攜帶率較高，表明該基因突變可能是出生后聽力下降的高危因素。

SLC26A4 基因是在我國(guó)第二高發(fā)的突變致聾基因，約有14.5%的耳聾患者攜帶該基因突變［22］。SLC26A4 基因有21 個(gè)外顯子，能夠編碼溶脂蛋白（Pendrin 蛋白），異常的Pendrin 蛋白失去正常離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能，導(dǎo)致耳蝸內(nèi)淋巴離子環(huán)境失衡，進(jìn)而導(dǎo)致耳聾。SLC26A4 基因突變可導(dǎo)致LVAS、NSHI 和先天性耳聾伴甲狀腺腫綜合征［23］。本研究SLC26A4基因突變率為2.00%，低于全國(guó)檢出水平，可能是由于廣東地區(qū)SLC26A4 基因突變攜帶率低或標(biāo)本量少導(dǎo)致的低檢出率。SLC26A4 基因檢出了在我國(guó)居民中較常見的突變熱點(diǎn)c.IVS7-2A＞G 和少見的c.1229C＞T 突變各1 例，均為雙側(cè)聽力下降組，且合并GJB2 突變，為雙基因雜合突變。翻查CT 報(bào)告，兩例攜帶者均無(wú)前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大，但臨床醫(yī)生應(yīng)叮囑患者避免頭部外傷，預(yù)防呼吸道感染，不進(jìn)行潛水活動(dòng)，避免乘坐飛機(jī)等，以免壓力變化導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展。

本研究使用的PCR-流式熒光檢測(cè)技術(shù)又稱液態(tài)懸浮點(diǎn)陣檢測(cè)技術(shù)，是一種新的適用于臨床的高通量、自動(dòng)化分析技術(shù)［24-25］。該方法的優(yōu)勢(shì)為在核酸擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，將產(chǎn)物與標(biāo)記微珠進(jìn)行雜交染色，提高檢測(cè)結(jié)果的敏感度和特異度；高通量可將多個(gè)基因突變整合到同一檢測(cè)系統(tǒng)中，一次性完成多個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)；實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單，大大縮短檢測(cè)時(shí)間。

4 結(jié)論

綜上所述，廣東省部分地區(qū)NSHI 患者主要的致病基因?yàn)镚JB2，主要的突變位點(diǎn)為c.109 G＞A，該地區(qū)耳聾基因與其他地區(qū)有明顯差異。在臨床工作中，應(yīng)早期開展耳聾基因檢測(cè)，明確病因，預(yù)測(cè)病情變化，協(xié)助耳聾預(yù)防及治療，同時(shí)應(yīng)指導(dǎo)并阻斷耳聾遺傳，預(yù)防下一代耳聾發(fā)生。而在耳聾基因檢測(cè)中，應(yīng)用PCR-流式熒光檢測(cè)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)高通量、便捷等優(yōu)點(diǎn)，作為現(xiàn)有檢測(cè)方法的一種補(bǔ)充，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突