林宜 張華琴 唐玥雯 萬鳳 湯絢麗 鄭潔 葉田

原發(fā)性局灶節(jié)段硬化性腎小球腎炎（Primary focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS）特征為腎小球局灶節(jié)段硬化和足細(xì)胞足突彌漫融合，其發(fā)病率逐年升高［1］。瞬時受體電位陽離子通道蛋白6（Transient receptor potential cation channel 6，TRPC6）表達(dá)于足細(xì)胞［2］，如其發(fā)生過表達(dá)，或基因突變后鈣離子內(nèi)流增加，可致足細(xì)胞損傷、大量蛋白尿、FSGS及腎衰竭［3］。中醫(yī)藥在治療慢性腎病中具有一定療效［4］，青藤堿為中藥青風(fēng)藤的主要單體生物堿，有免疫抑制、抗炎等作用［5］。迄今并無青藤堿干預(yù)FSGS的報道。近來有報道表明青藤堿可抑制多種細(xì)胞的鈣離子內(nèi)流而減低細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平［6-8］，從而發(fā)揮抗炎等多種生物學(xué)作用。故作者推測青藤堿也可能通過抑制TRPC6通道，干預(yù)FSGS，故探討青藤堿對TRPC6鈣離子通道影響，以闡述其干預(yù)阿霉素誘導(dǎo)的FSGS大鼠足細(xì)胞損傷的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）實驗大鼠：體質(zhì)量180～220 g健康雄性Wistar大鼠87只［上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，SCXK（滬）2022-0004］。（2）主要藥物、試劑：他克莫司膠囊0.5 mg×50粒（FK506）（中美華東，批號220761），鹽酸青藤堿（湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，批號YK-221005），10 mg注射用鹽酸多柔比星（阿霉素注射液）（深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號2206E2），NPHS2抗體、TRPC6抗體、GAPDH抗體（ProteinTech），Nephrin 抗體（Immunoway），肌酐、白蛋白、尿總蛋白試劑（貝克曼庫爾特股份有限公司）。

1.2 方法 （1）FSGS腎病大鼠模型建立［9］：Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，選取健康大鼠（24 h尿蛋白定量＜10 mg）。禁食/給水12 h，造模組行單側(cè)腎臟切除，第7天和28天，以5 mg/kg和3 mg/kg的劑量尾靜脈注射阿霉素。首次注射阿霉素7 d（即0周）留取24 h尿液，檢測24 h蛋白定量顯著增加，提示造模成功。（2）實驗分組和給藥方法：正常對照組12只，造模成功的FSGS大鼠分為5組：參照文獻(xiàn)取青藤堿劑量［10］，低劑量組［20 mg/（kg·d）］、中劑量組［40 mg/（kg·d）］、高劑量組［60 mg/（kg·d）］，F(xiàn)K506為鈣調(diào)蛋白抑制劑，可下調(diào)足細(xì)胞TRPC6減少尿蛋白［11］，故設(shè)立FK506組［1 mg/（kg·d）］為陽性對照組。以上每組各15只。造模后第8天開始灌胃給藥，模型組和對照組按等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。給藥第28天，處死大鼠。（3）標(biāo)本采集檢測：造模后0、4周將大鼠放置于代謝籠，留24 h尿；第28天腹主動脈采血行生化檢測，處死后取腎皮質(zhì)置凍存管。（4）腎臟病理檢測：取10%中性福爾馬林固定的腎皮質(zhì)行蘇木精-伊紅（HE）、過碘雪夫酸（PAS）染色；腎皮質(zhì)以3.75%戊二醛及2%鋨酸雙固定后，行免疫組化檢測。以萊卡病理圖像系統(tǒng)采集圖像，image pro plus6.0軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠24 h尿蛋白、生化指標(biāo) 0周模型組及各干預(yù)組24 h尿蛋白定量均顯著高于正常對照組（P＜0.01）。4周時模型組24 h尿蛋白顯著高于正常對照組，不同濃度青藤堿干預(yù)后均有下降，尤其是青藤堿中、高劑量組較為明顯（P＜0.05）；血白蛋白經(jīng)青藤堿干預(yù)后有所上升，亦以青藤堿中、高劑量組上升較明顯（P＜0.05）；FK506組療效與青藤堿高劑量組相似。與正常對照組比較，模型組血肌酐顯著上升（P＜0.05），經(jīng)不同劑量青藤堿干預(yù)后及FK506干預(yù)后，較模型組有所下降，但無顯著差異。見表1。

表1 各組24 h尿蛋白定量、血白蛋白和血肌酐水平（±s）

表1 各組24 h尿蛋白定量、血白蛋白和血肌酐水平（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別24 h尿蛋白定量（mg/d）（0周）24 h尿蛋白定量（mg/d）（4周）血白蛋白（g/L）（4周）血肌酐（μmol/L）（4周）正常對照組2.42±0.512.56±0.2830.05±0.8536.78±8.29模型組149.29±49.06*187.91±26.74*13.63±1.38*117.47±34.80*青藤堿低劑量組131.33±51.25*158.59±45.06*15.03±3.00*115.25±23.24*青藤堿中劑量組112.01±46.48*147.89±36.06*#16.32±2.08*#112.22±21.18*青藤堿高劑量組122.63±42.18*143.23±38.52*#18.28±2.49*#112.37±17.86*FK506組135.23±51.26*134.53±14.85*#19.40±1.84*#95.21±16.55*

2.2 腎組織病理形態(tài)學(xué)變化 （1）各組大鼠腎組織病理變化：PAS染色顯示，正常對照組大鼠腎小球血管袢開放良好，腎小管結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠部分腎小球局灶節(jié)段硬化，球囊粘連，系膜基質(zhì)增多，腎小管變形，腎小管上皮細(xì)胞脫落。青藤堿低劑量組病變也較明顯，部分腎小球血管袢發(fā)生節(jié)段硬化，球囊粘連。青藤堿高劑量組腎小球/小管病變較模型組顯著改善。FK506對照組有輕度的腎小球增大，但也較模型組顯著改善（圖1）。（2）腎組織Podocin、TRPC6免疫組化：模型組大鼠腎組織中Podocin的表達(dá)顯著減少（P＜0.05），青藤堿低、中、高劑量組Podocin的表達(dá)逐步增高，F(xiàn)K506組的Podocin表達(dá)也有所升高（圖2）。模型組TRPC6的表達(dá)較正常對照組顯著升高（P＜0.05），青藤堿低、中、高劑量組TRPC6表達(dá)逐步減少，F(xiàn)K506組的TRPC6表達(dá)也較模型組下降，與青藤堿高劑量組相仿（圖3）。（3）各組大鼠腎組織電子顯微鏡分析：與正常對照組比較，模型組腎小球基底膜呈節(jié)段增厚，足突彌漫融合。青藤堿低劑量組、青藤堿中劑量組仍有足突廣泛融合，青藤堿高劑量組及FK506組足突融合程度明顯降低（圖4）。

圖1 各組大鼠腎組織病理變化（PAS ×400）。A.正常對照組，B.模型組，C.青藤堿低劑量組，D. 青藤堿中劑量組，E.青藤堿高劑量組，F(xiàn). FK506組

圖2 各組大鼠腎組織Podocin表達(dá)（PAS×400）。A.正常對照組，B.模型組，C.青藤堿低劑量組，D.青藤堿中劑量組，E.青藤堿高劑量組，F(xiàn). FK506組，G.各組的Podocin的相對表達(dá)量。與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

圖3 各組大鼠腎組織TRPC6表達(dá)（PAS ×400）。A.正常對照組，B.模型組，C.青藤堿低劑量組，D. 青藤堿中劑量組，E.青藤堿高劑量組，F(xiàn). FK506組，G.各組的TRPC6的相對表達(dá)量。與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

圖4 各組大鼠腎組織電鏡形態(tài)學(xué)改變（×10,000）。A.正常對照組，B.模型組，C.青藤堿低劑量組，D.青藤堿中劑量組，E.青藤堿高劑量組，F(xiàn). FK506組

2.3 各組腎組織中Nephrin、 Podocin、TRPC6表達(dá)水平 與正常對照組比較，模型組大鼠Nephrin、Podocin表達(dá)顯著下降（P＜0.05）。經(jīng)不同濃度青藤堿干預(yù)后，Nephrin、Podocin的表達(dá)較模型組有所升高，其中青藤堿高劑量組Nephrin表達(dá)顯著升高（P＜0.05），青藤堿中、高劑量組的Podocin顯著升高（P＜0.05）。FK506組的Nephrin，Podocin表達(dá)較模型組有所升高。與正常對照組比較，模型組大鼠TRPC6表達(dá)顯著上升（P＜0.05），青藤堿低、中、高劑量組TRPC6表達(dá)逐步下降（P＜0.05），F(xiàn)K506組的TRPC6表達(dá)較模型組顯著下降（P＜0.05），青藤堿高劑量組接近FK506對TRPC6的下調(diào)作用（圖5）。

圖5 免疫印跡檢測各組Nephrin，Podocin，TRPC6。A.從左到右為正常對照組、模型組、青藤堿低劑量組、青藤堿中劑量組、青藤堿高劑量組、FK506組；B.Nephrin的表達(dá)分析；C. Podocin的表達(dá)分析； D.TRPC6的表達(dá)分析。與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

3 討論

FSGS病理特征為腎小球局灶節(jié)段硬化，足突彌漫融合。TRP通道是細(xì)胞膜上重要的非選擇性陽離子通道。其中TRPC6表達(dá)于足細(xì)胞［2］，與Nephrin、Podocin形成裂孔膜復(fù)合體，直接/間接地參與足細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)和穩(wěn)定骨架結(jié)構(gòu)等功能［3］。TRPC6鈣離子內(nèi)流增加升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子，可致足細(xì)胞分子表達(dá)異常，促使足細(xì)胞分離致FSGS。已知特發(fā)性FSGS患者足細(xì)胞TRPC6表達(dá)顯著增加［12］，將TRPC6基因轉(zhuǎn)染至小鼠腎，發(fā)現(xiàn)TRPC6主要位于足突，并致蛋白尿。新近發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞TRPC6介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致calpain-1激活，Talin-1下調(diào)，從而造成足細(xì)胞損傷致FSGS［13］。可見TRPC6的表達(dá)升高與FSGS相關(guān)。已知阿霉素腎病大鼠TRPC6表達(dá)增高［14］。

已知中藥成分可通過抑制TRPC6足細(xì)胞［15］，青藤堿可減少動物關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)中的炎細(xì)胞浸潤［5］，已有報道以青藤堿干預(yù)系膜增生性腎炎、IgA腎病、糖尿病腎病，可減少尿蛋白［16］。青藤堿還可通過上調(diào)Nephrin及Podocin減少Heymann大鼠的尿蛋白。還發(fā)現(xiàn)青藤堿可下調(diào)多種細(xì)胞鈣離子內(nèi)流［6-8］，如通過抑制Ca2+通道，激活內(nèi)皮細(xì)胞中NO和前列腺素（PG）I2合成而舒張血管［6］；降低巨噬細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，激活JAK2/STAT3通路抑制炎癥反應(yīng)等。

由此作者推測青藤堿也可能通過干預(yù)足細(xì)胞TRPC6干預(yù)FSGS。結(jié)果表明青藤堿能劑量依賴性減少阿霉素腎病大鼠的尿蛋白，升高血白蛋白。而高劑量青藤堿作用與鈣調(diào)蛋白抑制劑FK506相當(dāng)。青藤堿干預(yù)能劑量依賴性下調(diào)阿霉素腎病大鼠足細(xì)胞TRPC6表達(dá)，上調(diào)Nephrin、Podocin表達(dá)，提示青藤堿可能通過下調(diào)TRPC6表達(dá)，減少鈣離子內(nèi)流，進(jìn)而上調(diào)Nephrin，Podocin表達(dá)，而干預(yù)FSGS。其中青藤堿高劑量組接近FK506對TRPC6的下調(diào)作用［11］，提示高劑量青藤堿可能通過下調(diào)TRPC6達(dá)到近似FK506的保護(hù)足細(xì)胞而減少尿蛋白。

綜上所述，青藤堿可能通過下調(diào)TRPC6表達(dá)對足細(xì)胞損傷進(jìn)行修復(fù)，減少尿蛋白排泄，進(jìn)而減輕腎損傷。