鄭衛(wèi)方 柴曉銀 潘富珍 徐美慧 章喆 藍(lán)柳豪 黃彥欽 鄭樹

自2016年美國FDA批準(zhǔn)SEPT9甲基化檢測（epiproColon）以來，血漿游離DNA已用于早期結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）檢測［1］。一項(xiàng)針對＞50歲無癥狀人群的SEPT9甲基化檢測研究發(fā)現(xiàn)，SEPT9甲基化檢測對CRC特異性高（91.6%），但敏感性低（48.2%），對進(jìn)展期腺瘤的敏感性更低（11.2%）［2］。然而，另一項(xiàng)多中心研究報(bào)道SEPT9甲基化檢測CRC敏感性較高（73.3%），但特異性較低（81.5%）［3］。通過血液檢測進(jìn)行CRC篩查具有易獲取性和便利性，但尚未廣泛應(yīng)用于CRC人群篩查。美國最近發(fā)布的《2021年CRC篩查的預(yù)防服務(wù)工作隊(duì)建議聲明》未納入任何關(guān)于血液檢測的建議［4］。然而，有關(guān)sept9血液檢測和其他基于血漿cfDNA的檢測用于CRC篩查的案例不斷被報(bào)道［5］。探索基于cfDNA血液檢測用于人群篩查具有一定的意義。對基于cfDNA血液檢測原理的研究表明，血漿樣品中cfDNA濃度可能對成功檢測起著重要作用，尤其是對于那些以DNA甲基化標(biāo)記物為目標(biāo)檢測。提示血漿樣本中cfDNA濃度越高，樣本中存在游離腫瘤DNA（ct DNA）的幾率越高［6］。對于甲基化檢測，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化是不可避免的，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化會(huì)損傷大部分DNA。較高的cfDNA濃度意味著較少的轉(zhuǎn)換DNA損失，從而導(dǎo)致成功的甲基化檢測。但CRC篩查人群血漿cfDNA濃度的研究鮮有報(bào)道。本研究利用一個(gè)社區(qū)人群結(jié)直腸癌篩查采集的樣本，對人群血漿cfDNA濃度特征，血漿cfDNA定量對風(fēng)險(xiǎn)模型預(yù)測進(jìn)展期結(jié)直腸腫瘤的影響開展研究。

1 資料與方法

1.1 研究設(shè)計(jì) 本研究基于浙江省蘭溪市正在進(jìn)行的一項(xiàng)結(jié)直腸癌篩查項(xiàng)目，于2020年3月至2022年12月招募該地區(qū)居住居民40～74歲人群。簽署研究知情同意書后，每位參與者均需要進(jìn)行面對面的問卷調(diào)查和抽血。血液容器為4 mL EDTA抗凝管（BDvacutainer，美國）。從管中取出所有血漿存放于-80 ℃冰箱中備用。篩選程序和實(shí)驗(yàn)室檢測均獨(dú)立進(jìn)行，排除拒絕結(jié)腸鏡檢查、腸道準(zhǔn)備極差（波士頓評分＜6分）、家族性腺瘤性息肉綜合征者。本研究在《赫爾辛基宣言》的約束下，經(jīng)蘭溪市人民醫(yī)院機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)審查通過。

1.2 篩查程序 研究參與者首先進(jìn)行問卷調(diào)查和糞便免疫化學(xué)檢測（FIT）。問卷調(diào)查要求個(gè)體詳細(xì)回答當(dāng)前胃腸道癥狀。常見慢性病史、腫瘤家族史、吸煙/飲酒/運(yùn)動(dòng)習(xí)慣、結(jié)腸鏡檢查史、胃腸道疾病史。問卷結(jié)束后兩周完成糞便檢測，此后指導(dǎo)所有參與者接受結(jié)腸鏡檢查。結(jié)腸鏡檢查由蘭溪市人民醫(yī)院經(jīng)驗(yàn)豐富的內(nèi)鏡醫(yī)師完成。按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)鏡學(xué)分會(huì)指南記錄腸道準(zhǔn)備質(zhì)量、盲腸插管情況及腸鏡下病變情況。所有結(jié)腸鏡下的息肉和平坦型病變均需至少活檢進(jìn)行組織學(xué)檢查。若病灶被切除或引入外科學(xué)，腹腔鏡活檢診斷則由大樣本的病理診斷代替。進(jìn)展期腺瘤定義為直徑≥10 mm的腺瘤，或腺瘤伴高級別異型增生，或腺瘤絨毛狀形態(tài)大于顯微鏡視野25%。進(jìn)展期腫瘤被定義為CRC和進(jìn)展期腺瘤的組合。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 抽血后4 h內(nèi)，先將試管以1,000 g離心10 min，然后將血漿轉(zhuǎn)移至干凈的塑料管中，于-80 ℃冷凍。血漿樣本cfDNA的提取采用cf - NucXtractBlood Kit試劑盒，操作步驟參照文獻(xiàn)［7］。該試劑盒不使用載體RNA，可以更準(zhǔn)確地測定cfDNA的純度。在Qubit3.0儀器中用QubitdsDNA HS Assay Kit（Life Technology，USA，cat.123456）提取后立即測定DNA濃度。對于所有濃度較高（＞ 20 ng/mL血漿）的cfDNA樣本，采用Q-sep100進(jìn)行毛細(xì)管電泳，排除基因組DNA污染。其余cfDNA均經(jīng)Zymo Gold甲基化試劑盒（ZYMO，美國，cat）處理。取一半轉(zhuǎn)化后的DNA在30 μLPCR體系中進(jìn)行Methy Light檢測［8］。MethyLight靶向SEPT9和C9ORF50的啟動(dòng)子區(qū)域，以β-肌動(dòng)蛋白為參照。SEPT9所用PCR引物為上游引物5’-CGGAGCGTTCGTATTTTCGT-3，反向引物：5’-ACTTCCCAATCCCGAATCCG-3’為；C9ORF50上游引物5’-GCGTTCGACGTTTATTTCGG-3’，5’CGC GACTACCCAAACTAACC-3’為反向引物；beta-actin上游引物5’-TAGGGTTTGAGGATTTTTGGTTGT-3’，5’-CCCAACACCACACTCTACCT-3’為反向引物以目的基因的Ct值減去β-肌動(dòng)蛋 白的Ct值計(jì)算Ct值差值。如果cfDNA樣品的SEPT9或C9ORF50的Ct值差值低于7，則cfDNA樣品經(jīng)甲基化分析檢測為陽性，即在加標(biāo)樣品中實(shí)驗(yàn)確定的。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用STATA15.0和Graphpad prism 9軟件。簡單率用于報(bào)告研究人群的特征。率的置信區(qū)間（CI）采用Exact（克洛珀-Pearson）檢驗(yàn)。采用單側(cè)Fisher ' s Exact檢驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)比差異的顯著性。不同組間cfDNA濃度的差異采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型的構(gòu)建采用概率估計(jì)法，即利用Logistic回歸中的系數(shù)。生成風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型用受試者操作曲線。曲線下面積差異采用De Long法進(jìn)行檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究人群特征及篩查診斷結(jié)果 本研究共招募606例同意參與者，在篩查結(jié)束時(shí)，排除122例未能接受結(jié)腸鏡檢查和5例腸道準(zhǔn)備較差者，研究最終納入479例，人群平均年齡為（62.02±7.24）歲，男性略多于女性。經(jīng)結(jié)腸鏡檢查及病理診斷，確診（12.11%，95% CI：9.32～15.37）進(jìn)展期腫瘤58例。僅發(fā)現(xiàn)5例（1.04%，95% CI：0.34～2.42）CRC患者。研究人群特征及篩查診斷結(jié)果見表1。

2.2 人群特征亞群血漿cfDNA濃度 所有血漿樣本均成功提取cfDNA，人群血漿cfDNA濃度見圖1。所有個(gè)體的cfDNA平均濃度為（10.58±1.45）ng/mL plasma。但cfDNA濃度較高的樣本分布呈高度偏態(tài)分布。cfDNA濃度為25、50、75、90和個(gè)體95百分位數(shù)分別為5.20（95%CI：4.88～5.44）ng/mL血漿、7.08（95% CI：6.81～7.41）ng/mL血漿、9.54（95% CI：8.94～10.32）、13.08（95% CI：11.90～14.97）ng/mL血漿和18.60（95%CI：15.49～25.92）ng/mL血漿。cfDNA含量最高的10個(gè)個(gè)體的血漿cfDNA平均濃度為（139.97±57.90）ng/mL plasma。約為其余個(gè)體［（7.8165±4.416）ng/mL血漿］的18倍。濃度較高的cfDNA均未受到基因組DNA的嚴(yán)重污染。在cfDNA濃度最高的10名個(gè)體中，平均年齡為（62.6±6.42）歲，平均BMI為（23.11±3.24），其中男性6例，晚期腺瘤1例，高血壓3例，高血脂2例，糖尿病1例，腹痛1例，排便異常1例，吸煙者4例，日常積極鍛煉者4例。

圖1 人群特征亞群血漿cfDNA濃度

2.3 常見病人群亞群cfDNA濃度和有無cfDNA濃度的晚期結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型的受試者操作曲線下面積 圖2和圖3用均值及其95% CI描繪cfDNA濃度在不同組個(gè)體中的分布。cfDNA濃度在有、無該特征組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的僅見于主訴腹痛組和高脂血癥組。診斷為進(jìn)展期腫瘤和無進(jìn)展期腫瘤的個(gè)體組間cfDNA濃度無差異。此外，5例CRC患者的cfDNA濃度（均值=6.82 ng/mL血漿）均未升高。cfDNA濃度截?cái)嘀岛臀唇財(cái)嘀档募谆瘷z測結(jié)果對研究人群血漿cfDNA甲基化檢測結(jié)果為陽性的（11.90%，95% CI：9.14～15.14）個(gè)體有57例。在這些個(gè)體中，SEPT9檢測陽性的有50個(gè)，C9ORF50檢測陽性的有12個(gè)，兩個(gè)基因均為陽性的僅有5個(gè)。甲基化檢測對進(jìn)展期腫瘤的陽性預(yù)測值為19.3（95% CI：9.1～29.5）。5例CRC患者中有2例檢測陽性。見圖2。

圖2 常見病人群亞群cfDNA濃度

圖3 有無cfDNA濃度的晚期結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型的受試者操作曲線

2.4 有無cfDNA濃度切斷時(shí)甲基化檢測對晚期結(jié)直腸腫瘤的診斷效果 表2為cfDNA濃度截?cái)嘀岛臀唇財(cái)嘀禃r(shí)甲基化檢測對進(jìn)展期腫瘤的診斷性能。似乎預(yù)測進(jìn)展期腫瘤的甲基化檢測能力較低，不需要設(shè)定甲基化檢測的cfDNA濃度臨界值。有、無cfDNA濃度的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型性能利用logistic回歸中的多因素系數(shù)建立進(jìn)展期腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型。一個(gè)模型（納入模型）包括年齡、性別、BMI、FIT結(jié)果、CRC家族史、糖尿病、吸煙、息肉史、甲基化檢測結(jié)果、cfDNA濃度等。除cfDNA濃度外，其他模型（排除模型）均包含相同因素。生成這兩個(gè)模型預(yù)測進(jìn)展期腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的受試者工作曲線。納入模型和排除模型的曲線下面積分別為0.581（95%CI：0.49～0.672）和0.579（95% CI：0.488～0.670）。兩者的預(yù)測能力無顯著差異（P=0.4663）。見圖3。

表2 有無cfDNA濃度切斷時(shí)甲基化檢測對晚期結(jié)直腸腫瘤的診斷效果

3 討論

血漿cfDNA是結(jié)直腸癌術(shù)后監(jiān)測復(fù)發(fā)和早期診斷液體活檢的主要來源。抽血篩查CRC方便［9］。近年來，cfDNA在癌癥早期診斷領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展［10］。然而，在缺乏證據(jù)支持其在人群篩查中的應(yīng)用方面仍存在爭議。本研究重點(diǎn)是cfDNA濃度，以了解cfDNA定量是否有助于改進(jìn)基于cfDNA甲基化標(biāo)志物檢測篩查技術(shù)的篩查效果。提取479例個(gè)體血漿cfDNA，測定cfDNA濃度。分別建立有cfDNA濃度和無cfDNA濃度的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型。分析有、無cfDNA濃度截?cái)嘀档募谆瘷z測的診斷性能。然而，最終在看似正常的研究人群中發(fā)現(xiàn)了血漿cfDNA濃度的偏態(tài)分布。少數(shù)個(gè)體cfDNA濃度較高，無明顯臨床特征。風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型受試者工作曲線下面積（AUC）的比較，以及有、無cfDNA濃度甲基化檢測的診斷性能均無差異。提示cfDNA定量用于CRC人群篩查是不必要的。血漿cfDNA是從血漿樣品中提取的總DNA材料的統(tǒng)稱。將其應(yīng)用于癌癥檢測時(shí)，檢測的實(shí)際靶標(biāo)是無細(xì)胞腫瘤DNA（cell-free tumor DNA，ctDNA），ctDNA被認(rèn)為是cfDNA的一部分。由于血漿樣品中cfDNA和ctDNA之間的關(guān)聯(lián)難以界定，因此，在檢測前通常關(guān)注cfDNA濃度而非ctDNA濃度。JIN等［11］開發(fā)了用于結(jié)直腸癌術(shù)后監(jiān)測的多標(biāo)志物甲基化檢測。cfDNA濃度的最低要求為每樣本5 ng。ZHANG等［12］開發(fā)了四標(biāo)記甲基化檢測用于結(jié)直腸癌的早期檢測。所需的cfDNA濃度為每樣品10 ng。如果濃度較高的cfDNA樣本未受到基因組DNA的污染，那么可以認(rèn)為濃度越高，檢測成功的可能性越高。然而，本研究未能發(fā)現(xiàn)這一假設(shè)的任何支持。cfDNA濃度可能與轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌有關(guān)，但其對結(jié)直腸癌早期檢測的意義可能并不相同。癌癥患者、急性心臟病患者和劇烈運(yùn)動(dòng)后個(gè)體的血漿cfDNA濃度會(huì)顯著升高［6］。但人群血漿cfDNA濃度的研究鮮有報(bào)道。根據(jù)作者經(jīng)驗(yàn)，由于未知原因，血漿cfDNA濃度的增加可能是隨機(jī)產(chǎn)生的。這需要對cfDNA在人體內(nèi)的動(dòng)態(tài)進(jìn)行深入探索。進(jìn)展期腺瘤是除CRC外人群篩查的首要目標(biāo)。本研究中的篩查結(jié)果反映了社區(qū)人群中結(jié)直腸腫瘤性病變的自然分布。進(jìn)展期腺瘤占全部進(jìn)展期腫瘤的91.2%。多因素風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型對進(jìn)展期腫瘤的預(yù)測能力較弱（AUC=0.581）。在特異性為90%時(shí)，其僅能識別18.97%的進(jìn)展期腫瘤和一個(gè)CRC。在模型中加入cfDNA濃度對預(yù)測結(jié)果無影響。預(yù)測人群中的進(jìn)展期腺瘤是困難的。FIT和血液檢測對進(jìn)展期腺瘤的敏感性均較低［13］。FIT-DNA被報(bào)道具有更好的敏感性，但特異性顯著降低［14］。亞太地區(qū)結(jié)直腸評分中使用因子的遺傳風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型與作者的預(yù)測能力相似（AUC=0.60）［15］。加入BMI后，AUC增加至0.65。另一項(xiàng)來自韓國的研究觀察到一種新的進(jìn)展期腫瘤風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型的指數(shù)（AUC=0.726）更高［16］。

通過甲基化檢測進(jìn)一步驗(yàn)證cfDNA濃度對群體篩選的影響。SEPT9基因和C9ORF50基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行甲基化檢測。SEPT9是一個(gè)成熟和公開驗(yàn)證的標(biāo)記。C9ORF50由LANGE等于2012年首次報(bào)道［16］。在本研究之前對CRC組織DNA中的甲基化標(biāo)志物進(jìn)行篩選時(shí)，C9ORF50的表現(xiàn)優(yōu)異。有研究發(fā)現(xiàn)通過cfDNA和糞便DNA預(yù)測CRC具有巨大的潛力［17］。然而，作者發(fā)現(xiàn)通過血漿cfDNA聯(lián)合SEPT9和C9ORF50甲基化檢測對進(jìn)展期腫瘤的預(yù)測能力仍較差。5例CRC中2例被成功檢出，但漏診了大部分進(jìn)展期腺瘤。遺憾的是，cfDNA濃度仍不影響預(yù)測甲基化檢測的能力。

本研究存在一些不足。首先，研究人群規(guī)模不足以發(fā)現(xiàn)更多的CRC病例。本研究中5例結(jié)直腸癌患者的cfDNA濃度（平均血漿6.82 ng/mL）較低，表明人群篩查中不需要進(jìn)行cfDNA定量。更多的CRC患者必將使結(jié)果更可信。其次，本研究是基于正在進(jìn)行的CRC篩查項(xiàng)目進(jìn)行的。在該計(jì)劃中，CRC高風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體被要求完成結(jié)腸鏡檢查。導(dǎo)致在本研究中高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體的參與率高于低風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體。因此，在本研究中，進(jìn)展期腫瘤的檢出率略高于平均風(fēng)險(xiǎn)人群。這可能會(huì)使遺傳風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型的準(zhǔn)確性降低。第三，本研究中使用的甲基化檢測試劑盒是自主研發(fā)的，而不是FDA認(rèn)證的epi-proColon試劑盒。本研究中描述的甲基化檢測的診斷參數(shù)僅適用于自建試劑盒。其只用于檢測cfDNA濃度的影響，不用于評估甲基化檢測的性能。

最后，血漿cfDNA作為液體活檢的重要靶點(diǎn)，在許多疾病的無創(chuàng)診斷中仍備受關(guān)注。盡管本研究結(jié)果未能支持血漿cfDNA定量作為晚期結(jié)直腸腫瘤早期診斷的重要因素，作者仍將血漿cfDNA作為潛在有用的標(biāo)志物，但人體對血液中高濃度的cfDNA的耐受性還有待進(jìn)一步研究。當(dāng)知曉血漿cfDNA在血液中的動(dòng)態(tài)時(shí)，可能有助于理解如何使用它。