陳素梅 朱魯程 許雅思 張仕蓉 馬勝林

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，居癌癥相關(guān)死亡的首位，嚴(yán)重威脅人們的生命和財(cái)產(chǎn)安全［1］。目前，放射治療（放療）仍是肺癌最重要的治療手段之一，但由于放射治療的相關(guān)毒性及耐藥等多種因素，放療的療效仍有較大的局限性，因此，增強(qiáng)放療的敏感性，改善放療抵抗，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。近年來(lái)，傳統(tǒng)中藥細(xì)梗香草的抗腫瘤作用受到人們的廣泛關(guān)注［2-4］。本研究小組對(duì)細(xì)梗香草的抗腫瘤作用及其分子機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)研究。既往的研究成果表明：細(xì)梗香草總皂苷（LC）對(duì)肺癌細(xì)胞具有抑制增殖、促進(jìn)凋亡的作用，這些抗腫瘤作用可能與誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）爆發(fā)，激活線粒體凋亡通路相關(guān)［4］。同時(shí)還對(duì)細(xì)梗香草的抗腫瘤潛能進(jìn)行了體內(nèi)研究，發(fā)現(xiàn)LC能夠顯著抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)，且對(duì)肝腎功能無(wú)明顯毒副作用［4］。然而，目前有關(guān)LC是否具有放療增敏的潛能尚不清楚。本研究擬通過(guò)研究LC聯(lián)合放療對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、凋亡等影響，明確LC的放療增敏作用，并對(duì)其可能涉及的分子機(jī)制進(jìn)行初步探索，為L(zhǎng)C與放療在肺癌細(xì)胞中的聯(lián)合應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要細(xì)胞株、試劑和儀器 肺癌細(xì)胞株H460、PC-9、H1299由本研究所（杭州市第一人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心）保存，LC：由浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與儀器學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)系田景奎教授友情提供；Annexin-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物公司，DNA-pKcs抗體購(gòu)自Millipore公司、Ku80、RAD50購(gòu)自Santa Cruz，GAPDH、β-actin購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（MTS）Promega，lipfectamine 2000 transfection reagent購(gòu)自Invitrogen（gibco）公司，流式細(xì)胞儀由FACSan becton Dickson制造，酶標(biāo)儀由Bio-Rad公司制造。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期肺癌細(xì)胞（H460、PC-9、H1299），3,000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，加入不同濃度的LC（0.5、1、2、4、6、8、16及32 μg/mL），共培養(yǎng)12 h、24 h或48 h，MTS法檢測(cè)細(xì)胞存活率，存活率（%）=（As-Ab）/（Ac-Ab）×100%，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。（2）克隆形成實(shí)驗(yàn)［放射增敏比（SER）和聯(lián)合指數(shù)（CI）］：根據(jù)MTS結(jié)果選取H460和PC-9兩種細(xì)胞后續(xù)實(shí)驗(yàn)，不同濃度的LC預(yù)處理48 h后，分別予不同劑量放療（0、1、2、4、6 Gy），將照射好的細(xì)胞以500/孔的細(xì)胞密度接種在六孔板中，于37 ℃含5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～14 d，以肉眼能見(jiàn)克隆，且克隆未融合為佳，固定、染色，計(jì)數(shù)，細(xì)胞數(shù)目＞50個(gè)計(jì)作為1個(gè)克隆，根據(jù)單擊多靶模型作出劑量-細(xì)胞存活率曲線并計(jì)算放射增敏比（SER）和LD50。根據(jù)LC和放療的LD50，選取持續(xù)劑量的LC和放射線聯(lián)合作用于H460和PC-9細(xì)胞，根據(jù)克隆形成數(shù)，制作CI曲線，具體見(jiàn)CHOU等［5-6］的研究。（3）流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：H460和PC-9兩種細(xì)胞以5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，待細(xì)胞完全貼壁后，加入細(xì)梗香草（1 μg/mL）預(yù)處理48 h，以2 Gy劑量的放療24 h后，收集（1～5）×105個(gè)細(xì)胞，Annexin V-FITC/PI試劑盒FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。（4）蛋白印跡法和小干擾RNA方法檢測(cè)細(xì)梗香草放療增敏的分子機(jī)制：蛋白印跡法：RIPA裂解提取總蛋白，BCA測(cè)定蛋白濃度，蛋白變性，電泳，孵育一抗、二抗，掃描，并采用ImageJ分析軟件處理圖像。根據(jù)蛋白印跡法結(jié)果選取核心蛋白分子DNA-PKcs，si-DNA-PKcs下調(diào)肺癌細(xì)胞蛋白表達(dá)，再行克隆形成實(shí)驗(yàn)。siRNA的合成：由Qiagen公司設(shè)計(jì)靶向DNA-PKcs基因的siRNA序列，作用于DNA-PKcs的催化活性區(qū)（11637～11655）。正義鏈：5’GATCCCGGGCGCTAATCGTACTGAATTCAAGAGAIT CAGTACGATTAGCGCCCTTITAAA-3’；反義鏈：3’GGC CCGCGArrAGCAIGACRRAAGITrCTCTAAGTCATGCTAA TCGCGGGAAAA AACCTTTTCCA-5’，采用化學(xué)合成的方法合成siRNA；轉(zhuǎn)染并檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率：具體過(guò)程詳見(jiàn)Lip2000的說(shuō)明書(shū)，Western blot檢測(cè)DNA-PKcs 蛋白表達(dá)水平；克隆形成實(shí)驗(yàn)分組情況：A.空白對(duì)照組：未經(jīng)任何處理；B.陰性對(duì)照組：采用亂碼siRNA轉(zhuǎn)染；C.si-DNA-PKcs；D.實(shí)驗(yàn)組：培養(yǎng)液中含15 nmol/L 靶向DNA-PKcs的siRNA，然后再予細(xì)梗香草和放療，克隆形成實(shí)驗(yàn)方法同前計(jì)算出集落形成率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n或%表示，多組間比較采用one-way方差分析，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LC抑制肺癌細(xì)胞株增殖和增強(qiáng)放療敏感性 為檢測(cè)LC對(duì)人肺癌H460、PC-9和H1299細(xì)胞增殖的影響，采用不同濃度的LC作用肺癌細(xì)胞，分別共培養(yǎng)12 h、24 h、48 h，MTS結(jié)果顯示：LC對(duì)三株細(xì)胞均具有增殖抑制的作用，且抑制作用隨濃度增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而加強(qiáng)，即呈劑量和時(shí)間依賴性（圖1A）。根據(jù)MTS藥物毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取0.5 μg/mL、1 μg/mL進(jìn)行本部分研究。圖1B示H460、PC-9和H1299細(xì)胞中LC濃度為1 μg/mL時(shí)放射增敏指數(shù)分別為（1.67±0.22）、（2.07±0.34）和（2.05±0.29），SER值均＞1.0，故LC對(duì)人肺癌細(xì)胞具有放射增敏作用。

圖1 LC抑制肺癌細(xì)胞株增殖和增強(qiáng)放療敏感性曲線圖。A. LC抑制三株肺癌細(xì)胞增殖曲線圖；B. LC聯(lián)合放療在三株肺癌細(xì)胞中的SER值曲線圖

2.2 LC與放療聯(lián)合具有協(xié)同增敏作用 CI是檢測(cè)兩種治療相互作用的常用指標(biāo)，其中CI＜1.0、CI=1.0和CI＞1.0分別代表二者有協(xié)同作用、相加作用和拮抗作用。本研究通過(guò)檢測(cè)不同濃度的LC（1、2、4、6 μg/mL）和不同劑量的放射治療（1、2、4、6 Gy）對(duì)H460、PC-9細(xì)胞集落形成率的影響，獲得二者的半數(shù)致死量（LD50），根據(jù)LD50，選取持續(xù)劑量的LC和放療聯(lián)合作用于H460和PC-9細(xì)胞，制作CI曲線，從圖2B可以看出，在H460細(xì)胞中，LC濃度＜（4.84±0.13）μg/mL和放療劑量＜（4.99±0.05）Gy時(shí)，CI＜1；在PC-9細(xì)胞中，LC濃度＞（0.128±0.012）μg/mL和放療劑量＞（0.168±0.03）Gy時(shí)，CI＜1，二者聯(lián)合有協(xié)同作用。圖2C為不同抑制率時(shí)兩株細(xì)胞的CI和衰減指數(shù)（DRI）數(shù)值。因此，本部分從單個(gè)細(xì)胞的增殖能力進(jìn)一步證實(shí)LC在肺癌細(xì)胞中具有顯著的放療增敏作用。

圖2 LC聯(lián)合放療在肺癌細(xì)胞中的聯(lián)合指數(shù)圖。A. LC和放療對(duì)H460和PC-9細(xì)胞克隆形成率的影響；B. LC聯(lián)合放療在兩株細(xì)胞中的CI曲線；C. 不同抑制率時(shí)兩株細(xì)胞的CI和衰減指數(shù)（DRI）具體數(shù)值

2.3 FCM檢測(cè)LC聯(lián)合放療對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡的影響 如圖3A、B所示，H460經(jīng)不同處理后各組細(xì)胞凋亡率分別為3.05%±0.92%，8.2%±0.99%、15.2%±2.97%、30.45%±1.93%，聯(lián)合組凋亡率顯著高于單純放療組（P＜0.05）。在PC-9細(xì)胞中對(duì)照組、LC組、放療組、聯(lián)合組凋亡率分別為1.10%±1.13%、8.55%±8.2%、14.55%±15.2%、30.55%±30.45%，聯(lián)合組也顯著優(yōu)于單純放療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此，細(xì)梗香草增強(qiáng)放療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效應(yīng)。

圖3 LC增強(qiáng)放療誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞的凋亡。A. LC增強(qiáng)放療對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷作用的流式細(xì)胞術(shù)圖；B. FCM檢測(cè)結(jié)果的具體凋亡率

2.4 LC抑制DNA損傷修復(fù)機(jī)制 為探索LC的放療增敏分子機(jī)制，本研究對(duì)DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。如圖4A所示W(wǎng)estern blot結(jié)果：LC可以顯著降低DNA-PKcs、Rad50、Ku80和Ku70的蛋白表達(dá)水平，這些均是NHEJ信號(hào)通路中的重要因子。本研究還利用小干擾RNA技術(shù)下調(diào)NHEJ信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子DNA-PKcs表達(dá)，如圖4B所示肺癌細(xì)胞（H460和PC-9）中Si-DNAPKcs組DNAPKcs表達(dá)水平較質(zhì)粒對(duì)照組顯著降低。下調(diào)Si-DNAPKcs蛋白后，再予檢測(cè)細(xì)梗香草及放療對(duì)肺癌細(xì)胞克隆形成的影響，圖4C所示si-control處理H460細(xì)胞后，LC可顯著增強(qiáng)放療抑制的細(xì)胞克隆形成率，而下調(diào)Si-DNA-PKc蛋白后，LC對(duì)放療無(wú)明顯的增敏作用。同樣，如圖4D所示在PC-9細(xì)胞獲得類似的結(jié)果。因此，可以推測(cè)LC通過(guò)調(diào)控NHEJ通路中的DNA-PKc蛋白發(fā)揮放療增敏作用。

圖4 LC通過(guò)調(diào)控NHEJ通路中的DNA-PKc蛋白發(fā)揮放療增敏作用。A. LC調(diào)控DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)的Western blot條帶；B. 小干擾RNA技術(shù)下調(diào)DNA-pKcs蛋白表達(dá)效率；C. 下調(diào)H460細(xì)胞DNA-pKcs蛋白表達(dá)后，LC對(duì)放療增敏作用；D. 下調(diào)PC-9細(xì)胞DNA-pKcs蛋白表達(dá)后，LC對(duì)放療增敏作用

3 討論

本研究結(jié)果表明：傳統(tǒng)中藥LC顯著增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌放療敏感性。眾所周知，腫瘤細(xì)胞對(duì)各種原因引起的損傷均有一套完整的修復(fù)系統(tǒng)，通過(guò)啟動(dòng)直接修復(fù)、堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、堿基錯(cuò)配修復(fù)、同源重組修復(fù)和非同源的末端連接六條通路來(lái)修復(fù)不同形式的損傷。其中同源重組修復(fù)和非同源的末端連接通路專門修復(fù)DNA雙鏈斷裂（DSB）。DSB是放射線引起的一種細(xì)胞致死性損傷，細(xì)胞發(fā)生DSB后，會(huì)產(chǎn)生一系列復(fù)雜反應(yīng)，從而出現(xiàn)DSB修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯或細(xì)胞凋亡，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)受到影響，均可能改變腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性［7］。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中DSB的修復(fù)方式主要包括同源重組修復(fù)（HDR）、經(jīng)典非同源末端連接（NHEJ）、單鏈退火修復(fù)（SSA）和非經(jīng)典非同源末端連接（ALT-NHEJ），各自通過(guò)募集不同的蛋白來(lái)完成修復(fù)，其中非同源末端連接是最主要的方法，其對(duì)維持基因組的完整性和正確性非常重要［8］。本研究的機(jī)制部分表明：細(xì)梗香草通過(guò)抑制NHEJ修復(fù)能力，而抑制放療引起的DNA損傷修復(fù)，進(jìn)而發(fā)揮放療增敏作用。

非同源末端連接不依賴于同源DNA序列（通常為姐妹染色體）為模板，能直接連接受損DNA的兩個(gè)末端，在此過(guò)程中Ku70/80異質(zhì)二聚體，DNA依賴性蛋白激酶（DNA-PKcs），核酸酶Artemis（ATM），DNA修復(fù)蛋白XRCC4，DNA連接酶IV和XLF等核心因子共同完成這一復(fù)雜的修復(fù)過(guò)程［9-10］。DNA依賴性蛋白激酶（DNA dependent protein kinase，DNA-PKcs）是一個(gè)由3個(gè)亞基組成的絲/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇-3激酶相關(guān)激酶家族（PI3K），是非同源末端連接DNA損傷修復(fù)過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白激酶，并決定著該通路的整個(gè)進(jìn)程。另外，Rad50、Ku80和Ku70都是NHEJ過(guò)程中的核心因子［11］。作者的Western blot結(jié)果也證實(shí)LC可以顯著降低DNA-PKcs蛋白表達(dá)水平，以及細(xì)梗香草通過(guò)降低Rad50、Ku80和Ku70等NHEJ過(guò)程中的核心因子的表達(dá)水平進(jìn)一步干擾修復(fù)。

因此，從本研究的研究結(jié)果作者推測(cè)：LC可能通過(guò)抑制非小細(xì)胞肺癌DNA分子NHEJ修復(fù)能力增強(qiáng)放射治療的敏感性，但動(dòng)物體內(nèi)是否具有類似的生物學(xué)功能，尚需對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行體內(nèi)研究，本研究團(tuán)隊(duì)將對(duì)此進(jìn)行探索，為細(xì)梗香草的放療增敏作用提供更多的證據(jù)。致謝：

感謝美國(guó)杜克大學(xué)陳旭峰老師對(duì)本研究的技術(shù)支持和英文修正。