張鵬濤 張蕾 張遠(yuǎn) 馬路平 丁成 王進(jìn)濤 鐘良軍

慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）是一種慢性感染性疾病，會引起牙周組織慢性進(jìn)行性破壞［1］，最終導(dǎo)致牙齒松動、缺失。牙周治療的目的是消除齦上和齦下菌斑，終止牙周病變［2］，最理想的牙周治療效果能使牙骨質(zhì)、牙槽骨、牙周懸韌帶獲得再生［3］。2004年，SEO等［4］學(xué)者首次從人牙周膜細(xì)胞中分離純化出STRO-1陽性的細(xì)胞，并且發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞具有多方向誘導(dǎo)分化能力，將其命名為牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs），從此為牙周組織再生提供了新的種子細(xì)胞和理論依據(jù)。維甲酸（retinoic acid，RA）是一種調(diào)控胚胎發(fā)育和骨形成的重要信號分子［5］，研究發(fā)現(xiàn)RA具有誘導(dǎo)多種間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化的能力［6-9］。小型豬在口腔頜面部發(fā)育生物學(xué)、解剖學(xué)和生理學(xué)上與人類相似，因此被認(rèn)為是比較理想的研究口頜系統(tǒng)疾病的大動物模型，已被廣泛應(yīng)用于涎腺、牙齒、牙周以及頜骨疾病研究與再生治療探索中［9-10］。目前不同濃度RA對PDLSCs成骨誘導(dǎo)的差異研究尚少，本實(shí)驗(yàn)擬對小型豬PDLSCs體外分離、培養(yǎng)、鑒定，并使用不同濃度的RA對其進(jìn)行成骨方向誘導(dǎo)，觀察各濃度RA誘導(dǎo)后小型豬PDLSCs的堿性磷酸酶活性、相關(guān)成骨基因表達(dá)的差異，以期為臨床修復(fù)骨缺損提供新思路，為動物實(shí)驗(yàn)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象 健康雄性4～6個月齡貴州小型香豬4只，體質(zhì)量15～20 kg。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 低糖DMEM，胎牛血清（HyClone公司，美國），細(xì)胞培養(yǎng)用青霉素、鏈霉素，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio公司，中國），L-α-磷酸抗壞血酸，茜素紅染色劑，β-甘油磷酸鈉，全反式維甲酸（Sigma公司，美國），小鼠抗人STRO-1單克隆抗體（R＆D，美國），山羊抗小鼠IGM-FITC熒光二抗（Santa Cruz公司，美國），小鼠抗人波形蛋白Vimentin、小鼠抗人角蛋白PCK、免疫組化試劑盒（博士德公司，中國），DAB顯色試劑盒（中杉金橋，中國），ALP活性檢測試劑盒（建成，中國）。引物（上海生物工程有限公司合成，中國）、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（Takara，大連寶生物工程有限公司，中國）。

1.3 小型豬PDLSCs原代培養(yǎng) 3%戊巴比妥鈉30 mg/kg，鹽酸氯胺酮15～20 mg/kg聯(lián)合麻醉小型豬，碘伏消毒術(shù)區(qū)，鋪巾，拔除小型豬前牙4顆，使用含1,000 U/mL雙抗無菌PBS沖洗離體牙3次，手術(shù)刀片刮取根中1/3牙周膜組織，將牙周膜組織修剪為1 mm2大小組織塊，均勻鋪在25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶底，小心加入1 mL DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，200 mmol/L谷氨酰胺，100 μmol/L L-α-磷酸抗壞血酸），置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日補(bǔ)液至5 mL，換液1次/3 d，待細(xì)胞變形游出，貼壁，增殖至80%左右時(shí)，胰蛋白酶消化傳代。

1.4 小型豬PDLSCs有限稀釋法分離純化 收集原代培養(yǎng)擴(kuò)增的小型豬PDLCs對數(shù)期培養(yǎng)上清液1,500 r/min離心10 min，與新配置培養(yǎng)基以1∶1比例混合，制備適應(yīng)性培養(yǎng)基。取對數(shù)期第一代PDLCs，調(diào)整細(xì)胞濃度為10～15個/mL，接種于96 孔板，常規(guī)培養(yǎng)4 h后鏡檢，標(biāo)記單個細(xì)胞孔，繼續(xù)培養(yǎng)，換液1次/5 d，培養(yǎng)14 d至有細(xì)胞克隆形成（≥50個細(xì)胞為克隆形成判定標(biāo)準(zhǔn)）胰蛋白酶-EDTA消化傳代，擴(kuò)增培養(yǎng)，純化后的PDLSCs擴(kuò)增冷凍備用。

1.5 小型豬PDLSCs鑒定 取純化后第三代對數(shù)期PDLSCs，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS蕩洗3 次，3%雙氧水處理15 min，PBS蕩洗3次，山羊血清工作液封閉30 min，傾去。滴加稀釋濃度為10 μg/mL的小鼠抗人STRO-1一抗，濕盒4 ℃孵育過夜。37℃復(fù)溫1 h，PBS蕩洗3次，加FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗，37 ℃孵育1 h，PBS蕩洗3次，熒光顯微鏡鏡檢。對照組以PBS代替一抗，其余操作步驟不變。免疫細(xì)胞化學(xué)法行波形蛋白（Vimentin）、角蛋白（pan cytokeratn，PCK）免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色液顯色，鏡檢觀察染色結(jié)果。對照組以PBS代替一抗，其余操作步驟不變。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組 參照Chadipiralla等學(xué)者研究方法［11］根據(jù)RA終濃度不同將實(shí)驗(yàn)組分為RA 0.5 μm組、1 μm組、2 μm組。對照組不添加任何誘導(dǎo)劑。

1.7 RA誘導(dǎo)小型豬PDLSCs成骨分化 取對數(shù)期第三代PDLSCs接種于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合達(dá)70%左右棄去培養(yǎng)液，更換成骨誘導(dǎo)液（低糖DMEM，10%胎牛血清，1 μmol/L維甲酸，100 μmol/L抗壞血酸，200 mmol/L谷氨酰胺，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉），細(xì)胞分三組分別加入誘導(dǎo)劑RA 0.5 μm、1 μm、2 μm，每3 d更換成骨誘導(dǎo)液。對照組細(xì)胞做常規(guī)培養(yǎng)。

1.8 小型豬PDLSCs成骨誘導(dǎo)鑒定 （1）堿性磷酸酶（Akaline Phosphatase，ALP）染色：PDLSCs成骨誘導(dǎo)至第14天，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，加入固定液覆蓋培養(yǎng)皿皿底，室溫下固定3 min，吸去固定液，PBS沖洗2次，加入底物應(yīng)用液，37 ℃孵育15 min，蒸餾水洗凈，蘇木素復(fù)染襯核3 min，鏡檢。（2）茜素紅染色：PDLSCs誘導(dǎo)至第21天，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗兩次，4%多聚甲醛固定1 h，茜素紅染液處理10 min，蒸餾水沖洗，鏡檢。

1.9 ALP活性檢測 取對數(shù)期第三代小型豬PDLSCs，以每孔2,000個細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)48 h后更換成骨誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)組依據(jù)各誘導(dǎo)劑終濃度不同進(jìn)行分組（RA 0.5 μm組、1 μm組、2 μm組），對照組不添加成骨誘導(dǎo)液，每組設(shè)置5個復(fù)孔（n=5），換液1次/3 d，于誘導(dǎo)第14天檢測各組細(xì)胞ALP活性，提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，BCA法定量分析各孔待測樣本蛋白質(zhì)含量。

1.10 Real-Time PCR定量分析ALP、骨鈣素（Osteocalcin，OCN）、骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）、I型膠原（Type I collagen，Col I）基因表達(dá) 取對數(shù)期第三代PDLSCs接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，成骨誘導(dǎo)至第21天時(shí)提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA儲存?zhèn)溆?，每組實(shí)驗(yàn)樣本含量為5（n=5）。以GAPDH為內(nèi)參基因，豬GAPDH、ALP、OCN引物序列參考WANG等［12］的報(bào)道，豬OPN、Col I引物委托上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)，各基因引物序列如下：

表1 各基因引物序列

Real-Time PCR體系按順序加入SYBR PreMix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，無菌去離子水補(bǔ)足至總體系20 μL；陰控以無菌去離子水代替cDNA模板，其他成分不變；GAPDH為內(nèi)參基因。Real-Time PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 30 sec，95 ℃5 sec，60 ℃ 20 sec，循環(huán)45 次，繪制溶解曲線，65 ℃～95 ℃ 1 min，分別檢測ALP、OCN、OPN、Col I基因表達(dá)水平。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包。ALP活性測試，成骨相關(guān)基因表達(dá)對比分析，數(shù)據(jù)為多組間樣本均數(shù)比較，使用單因素方差分析進(jìn)行處理。兩組間樣本均數(shù)比較，方差齊使用t檢驗(yàn)，如方差不齊則使用t’檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 小型豬PDLSCs原代培養(yǎng)及有限稀釋法分離純化 組織塊法培養(yǎng)7 d左右可見細(xì)胞從組織塊中變形“爬出”，細(xì)胞形態(tài)為短梭形、多角形或星形，胞漿豐富，細(xì)胞核居中，見圖1。繼續(xù)培養(yǎng)，原代細(xì)胞呈旋渦狀生長，增殖速度緩慢。有限稀釋法篩選細(xì)胞可見單個孔細(xì)胞在24 h后開始增殖，約10 d左右出現(xiàn)克隆形成，細(xì)胞呈集落樣生長，形態(tài)與原代培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞相類似，見圖2。

圖1 小型豬牙周膜細(xì)胞P0原代培養(yǎng)7 d（×50）

圖2 純化后小型豬牙周膜干細(xì)胞P3細(xì)胞 3 d（×50）

2.2 小型豬PDLSCs鑒定 純化后小型豬PDLSCs行STRO-1免疫熒光染色，倒置熒光顯微鏡下觀察可見細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，表現(xiàn)為細(xì)胞膜表達(dá)，見圖3。陰性對照組未見熒光染色。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測Vimentin，鏡下可見細(xì)胞被染為棕褐色，為陽性表達(dá)，見圖4，對照組陰性表達(dá)。PCK為陰性表達(dá)，見圖5。

圖3 小型豬PDLSCs STRO-1免疫熒光染色（×100）

圖4 小型豬PDLSC Vimentin免疫細(xì)胞化學(xué)染色（×100）

圖5 小型豬PDLSC PCK免疫細(xì)胞化學(xué)染色（×100）

2.3 小型豬PDLSCs 成骨誘導(dǎo) 各誘導(dǎo)組PDLSCs添加誘導(dǎo)劑后，細(xì)胞增殖速度放緩或停止增殖，形態(tài)由短梭形變?yōu)槎噙呅?，誘導(dǎo)14 d左右可見細(xì)胞聚集成團(tuán)塊，核偏向一側(cè)，培養(yǎng)皿底出現(xiàn)肉眼可見的礦化結(jié)節(jié)，并隨培養(yǎng)時(shí)間的增長而變大，數(shù)量增多。對照組細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，仍為短梭形或多角形，細(xì)胞出現(xiàn)接觸性抑制。（1）ALP染色結(jié)果：各誘導(dǎo)組PDLSCs誘導(dǎo)至第14天，使用ALP染色試劑盒染色，各誘導(dǎo)組細(xì)胞染色結(jié)果均為強(qiáng)陽性，表現(xiàn)為胞漿內(nèi)出現(xiàn)咖啡色或褐色顆粒。對照組細(xì)胞為陰性。（2）茜素紅染色：各實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)PDLSCs 21 d后，行茜素紅染色，誘導(dǎo)組培養(yǎng)皿底可見紅色沉淀，呈現(xiàn)為“流沙”狀改變，對照組無明顯變化。鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均可見散在礦化區(qū)域被染為紅色結(jié)節(jié)狀。對照組未見陽性染色。

2.4 ALP活性檢測 PDLSCs成骨誘導(dǎo)14 d后，相對于對照組，RA組細(xì)胞ALP活性較對照組明顯上調(diào)（P＜0.001），ALP活性隨RA濃度增高而增加（P＜0.001），呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系（見圖6）。

圖6 成骨誘導(dǎo)14 d ALP活性檢測結(jié)果

2.5 Real-Time PCR定量分析ALP、OCN、OPN、Col I基因表達(dá) 小型豬PDLSCs成骨誘導(dǎo)21 d后，各誘導(dǎo)組細(xì)胞ALP基因表達(dá)明顯上調(diào)，均高于對照組（P＜0.001），并且ALP基因表達(dá)上調(diào)水平隨RA濃度增高而增加（P＜0.03）。RA 0.5 μm組、1 μm組、2 μm組ALP基因表達(dá)分別是對照組的4.11、6.41、10.07 倍。相對于對照組，RA各誘導(dǎo)組細(xì)胞OPN基因表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.001），OPN基因表達(dá)隨RA濃度增高而增高，但RA 1 μm組與RA 2 μm組OPN表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.065）。RA 0.5 μm組、1 μm組、2 μm組OPN基因表達(dá)分別是對照組的2.71、3.94、4.08 倍。RA各誘導(dǎo)組OCN基因表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.001），OCN基因表達(dá)上調(diào)水平隨RA濃度增高而增高（P＜0.001），RA 0.5 μm組、1 μm組、2 μm組OCN基因表達(dá)分別是對照組的2.35、2.85、5.21倍。RA 0.5 μm組細(xì)胞ColI基因表達(dá)下調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.239），RA 1 μm組、RA 2 μm組ColI基因表達(dá)均高于對照組和RA 0.5 μm組（P＜0.018），RA 2 μm組細(xì)胞ColI基因表達(dá)高于RA 1 μm組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.246）。RA 0.5 μm組、1 μm組、2 μm組ColI基因表達(dá)分別是對照組的0.93、1.18、1.27倍。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)在多種成熟的組織內(nèi)如牙髓、脂肪、肝臟、骨髓、神經(jīng)、牙周膜等組織［4，12-16］可分離出具有可多方向誘導(dǎo)分化能力的細(xì)胞，稱為成體干細(xì)胞。BYOUNG等［4］將人PDLSCs移植于牙周骨組織缺損區(qū)域內(nèi)，PDLSCs可促進(jìn)牙周組織再生，表明PDLSCs可能是促進(jìn)牙周組織再生的種子細(xì)胞之一。

STRO-1是常被用于鑒定充質(zhì)來源成體干細(xì)胞的表面標(biāo)記物之一［4，17］。本研究使用有限稀釋法成功分離純化小型豬PDLSCs單克隆細(xì)胞株，免疫熒光法檢測純化后的小型豬PDLSCs結(jié)果發(fā)現(xiàn)STRO-1陽性表達(dá)，表明有限稀釋法純化后的PDLSCs具有成體干細(xì)胞的特性。Vimentin為陽性表達(dá)，PCK陰性表達(dá)，表明純化后的小型豬PDLSCs為間充質(zhì)來源，無外胚層及上皮細(xì)胞污染。

ALP是干細(xì)胞成骨分化早期標(biāo)志物［18］，是成骨細(xì)胞重要的免疫表型之一。本研究分別使用0.5 μm、1 μm、2 μm三種濃度的RA誘導(dǎo)小型豬PDLSCs 14 d，使用ALP染色試劑盒對其進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)各誘導(dǎo)組細(xì)胞ALP染色呈強(qiáng)陽性，而對照組為陰性。在成骨誘導(dǎo)第21天，茜素紅染色結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組均為陽性染色，對照組為陰性。表明小型豬PDLSCs在各濃度RA誘導(dǎo)下，成骨活性相對于對照組明顯增強(qiáng)，出現(xiàn)成骨方向分化。本研究檢測成骨誘導(dǎo)14 d各組細(xì)胞ALP活性結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞ALP活性與RA濃度呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，ALP是衡量成骨能力的指標(biāo)之一，可以認(rèn)為2 μm組RA對于小型豬PDLSCs誘導(dǎo)成骨的能力更強(qiáng)，這一結(jié)果與以對脫落乳牙干細(xì)胞及牙髓干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)的研究結(jié)果相類似［11，19］。

OPN是成骨細(xì)胞重要免疫表型之一，亦可作為成骨細(xì)胞分化的重要標(biāo)志［19-20］。OCN是成骨細(xì)胞在骨礦化峰期之后才出現(xiàn)積聚，因此，可以認(rèn)為OCN是一種晚期并且具有高度特異性的成骨標(biāo)記物［21］。Col I作為成骨早期標(biāo)記物之一，常被用于鑒定成骨細(xì)胞以及干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化的檢測。在小型豬PDLSCs成骨誘導(dǎo)第21天時(shí)，使用Real-time PCR方法檢測各組細(xì)胞ALP、OPN、OCN、Col I基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ALP、OCN基因表達(dá)隨RA濃度增加而上調(diào)，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。OPN基因表達(dá)水平隨RA濃度增高而增高，但RA 1 μm組與RA 2 μm組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ColI基因明顯上調(diào)，Col I基因表達(dá)水平隨RA濃度增加升高，但RA 1 μm與RA 2 μm兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。RA 0.5 μm組細(xì)胞Col I基因表達(dá)相對對照組出現(xiàn)下調(diào)，但與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CHADIPIRALLA等［11］應(yīng)用RA分別誘導(dǎo)人脫落乳牙干細(xì)胞和人PDLSCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA明顯下調(diào)Col I基因表達(dá)水平，與本研究結(jié)果不同，這可能與細(xì)胞來源不同和所使用的培養(yǎng)基不同有關(guān)，前者無血清培養(yǎng)基，可能無法提供足夠的營養(yǎng)以合成Col I，從而抑制了Col I基因的表達(dá)。綜上所述，三種濃度的RA均可誘導(dǎo)小型豬PDLSCs分化為成骨樣細(xì)胞，RA可能是一種更優(yōu)秀的成骨誘導(dǎo)劑，其成骨誘導(dǎo)能力在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，但其成骨誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍有待于進(jìn)一步研究。

目前慢性牙周炎的治療方法仍難以有效獲得牙周組織再生，組織工程學(xué)原理為牙周組織再生提供了新思路。RA是維生素A類的衍生物，對細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及胚胎發(fā)育起著非常重要的作用，可使用生物制藥的工藝人工合成，具有較好的生物安全性，成本低廉，臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)更豐富，其能否用于聯(lián)合PDLSCs修復(fù)較大范圍骨組織缺損，能否作為藥物應(yīng)用于牙周炎的治療，具有較好的臨床研究前景，本研究為其提供了新思路和動物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。