陳燕生,楊哲,沈卓,李文菲

低級別膠質(zhì)瘤(lower grade glioma,LGG)是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一,盡管神經(jīng)外科專家努力改善LGG患者的生存時間,但部分LGG患者由于腫瘤異質(zhì)性導(dǎo)致預(yù)后差異顯著[1]。有研究證實免疫療法顯著改善了LGG的預(yù)后,精確地識別LGG的腫瘤免疫表型對患者進行免疫治療至關(guān)重要[2]。磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)由于其無創(chuàng)性,被廣泛用于LGG的術(shù)前檢查,為臨床診斷提供重要信息。大量研究表明影像組學(xué)廣泛用于LGG的分子分型的診斷、預(yù)后預(yù)測及基因表達狀態(tài)[3-7],然而關(guān)于LGG不同影像表型的免疫特征研究并未報道。最新研究報道了影像組學(xué)與頭頸部腫瘤免疫亞型存在平行關(guān)系,同時多中心大樣本研究也證實影像組學(xué)可以預(yù)測腫瘤的免疫表型進而為評估免疫檢查點如程序性死亡分子1 (programmed cell death protein-1,PD-1)和程序性死亡配體1(programmed death-ligand 1,PD-L1)治療的療效提供了一種有效的方法[8,9]。本研究旨在通過MRI影像組學(xué)特征預(yù)測LGG的預(yù)后進而分析不同LGG免疫亞型與影像特征的相關(guān)性。

材料與方法

1．研究隊列

共納入199例患者來自于 TCIA(www.cancerimagingarchive.net)中的LGG 患者。納入和排除患者的依據(jù)由兩名具有5年神經(jīng)系統(tǒng)診斷經(jīng)驗的高年資放射醫(yī)師決定:①術(shù)前未經(jīng)任何治療,包括但不限于化學(xué)治療、放射治療及保守治療;②同時具有軸位T2、T2FLAIR和T1增強圖像,層厚5 mm;③臨床信息應(yīng)同時具有性別、年齡、術(shù)后治療、隨訪等基線數(shù)據(jù)資料和腫瘤分級、亞型、IDH和1p/19q狀態(tài)等分子病理資料;④同時具有TCGA(www.cancergenome.nih.gov)數(shù)據(jù)庫的mRNA轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)文件及Immport(https://immport.niaid.nih.gov)數(shù)據(jù)庫的免疫基因信息。 通過對TCIA影像數(shù)據(jù)患者與TCGA基因數(shù)據(jù)ID進行匹配,最終本研究根據(jù)以上納入和排除標(biāo)準(zhǔn)共納入了133例同時具有影像和免疫相關(guān)基因數(shù)據(jù)的LGG患者。

2．LGG預(yù)后相關(guān)的MRI影像組學(xué)特征提取

由兩名高年資神經(jīng)組放射醫(yī)師在3D-slicer軟件(4.8.1版本)對LGG的病灶進行識別并進行腫瘤分割(圖1)。首先由低年資醫(yī)師在橫軸面增強T1序列中找到病灶位置,逐層勾畫感興趣區(qū),每個病例均在依據(jù)T2/FLAIR等序列排除瘤周水腫,利用General Registration插件進行融合對比,進一步提高瘤體與瘤周水腫的劃分。多平面重組(multiplanar reconstruction,MPR)圖像上手動描繪膠質(zhì)瘤輪廓(圖1a),為了保證三維圖像(圖1b)的準(zhǔn)確性,將橫軸面MPR圖像和相應(yīng)的輪廓重建為冠狀面(圖1c)和矢狀面(圖1d)圖像輪廓作為參考。然后由另一位具有5年工作經(jīng)驗的放射專家檢查膠質(zhì)瘤三維輪廓,隨時對ROI進行修改和微調(diào)?；赑yradiomics軟件包總共提取851個放射組學(xué)特征,包括形狀特征(n=14)、一階特征(n=162)、灰度共生矩陣特征(n=216)、灰度游程矩陣特征(n=144)、灰度大小區(qū)域矩陣特征(n=144)、相鄰灰度差矩陣特征(n=45)、灰度依賴矩陣特征(n=126)。基于Pyradiomics軟件包提供的算法提取感興趣區(qū)域內(nèi)影像組學(xué)特征。在進行后續(xù)分析前,為了提高特征的穩(wěn)定性,納入符合圖像生物標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)化倡議中提出的特征[10]。采用Z-score方法對特征進行歸一化處理,兩位醫(yī)師分別對50名隨機選擇的患者完成了腫瘤分割和影像組學(xué)特征提取。然后醫(yī)師在1個月后重復(fù)勾畫了先前患者。為了減少手動分割中的組間差異影響,筆者采用Spearman相關(guān)篩選觀察者內(nèi)和觀察者之間穩(wěn)定性較高的特征(intra correlation coefficient,ICC>0.85)。應(yīng)用10倍交叉驗證的最小絕對收縮和選擇算子(least absolute shrinkage and selection operator,LASSO)比例風(fēng)險回歸建立影像組學(xué)特征模型。根據(jù)最優(yōu)λ值構(gòu)建影像組學(xué)評分,通過以下算法計算每個患者的風(fēng)險評分:影像組學(xué)評分(Radscore)=(β1×特征1值)+(β2×特征2值)+…+(βn × 特征n值)。根據(jù)臨界值(中位風(fēng)險評分)將所有患者分為高危組和低危組。以上構(gòu)建影像組學(xué)評分方法,本研究團隊在先前研究中詳細描述[11-12]。繪制Kaplan Meier生存曲線,比較高低風(fēng)險組LGG患者生存期。

圖1 膠質(zhì)瘤三維感興趣區(qū)分割示意圖。a)橫軸面圖像勾畫范圍;b)三維體積示意圖;c、d)冠狀面和矢狀面圖像保證腫瘤勾畫的準(zhǔn)確性。

3．聚類分析對LGG免疫亞型分組

基于先前發(fā)表的相關(guān)研究[13],使用單樣本基因富集分析(single-sample gene set enrichment analysis,ssGSEA)來量化133例 LGG患者中免疫細胞、功能或通路的活性或富集水平。根據(jù)ssGSEA的結(jié)果,利用RStudio中的“hclust”將LGG患者分為高免疫組(沙漠炎癥型)和低免疫組(免疫沙漠型),分別計算兩組中每個患者的腫瘤純度評分、免疫評分和基質(zhì)評分。最后分析放射組學(xué)評分與免疫亞型的相關(guān)性。

4．統(tǒng)計分析

采用R語言(版本4.02)進行統(tǒng)計學(xué)分析和作圖。采用LASSO回歸篩選最佳影像組學(xué)特征構(gòu)建影像組學(xué)評分。采用Kruskal-Wallis檢驗進行不同免疫分型之間影像組學(xué)評分(Radscore)、ESTIMATE評分、免疫評分和基質(zhì)評分、腫瘤純度的差異性分析。Kaplan-Meier生存分析采用log-rank檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

本研究共納入133例LGG患者,男68例,女65例,年齡18～75歲,平均(42.0±14.1)歲。異檸檬酸脫氫酶 (isocitrate dehydrogenase,IDH)野生型28例,突變型105例,其中野生型1p19q共缺失68例。經(jīng)過LASSO回歸篩選最佳特征,最終11個組學(xué)特征用來構(gòu)建影像組學(xué)評分預(yù)測LGG患者預(yù)后(表1),不同組學(xué)特征與LGG患者臨床病理相關(guān)性熱圖見圖2。膠質(zhì)瘤級別越高,影像評分越高。根據(jù)評分中位值分為高、低風(fēng)險組,高風(fēng)險組患者預(yù)后明顯差于低風(fēng)險組,風(fēng)險比(hazard ratios,HR)為3.3(95% CI:1.90～5.91,P<0.001),見圖3a。影像組學(xué)評分模型在預(yù)測LGG患者1年、3年、5年生存風(fēng)險的準(zhǔn)確率分別為79%、78%和80%(圖3b)。

表1 構(gòu)建影像組學(xué)評分的詳細特征

圖2 預(yù)后相關(guān)組學(xué)特征與臨床病理變量復(fù)合型熱圖。共有11特征構(gòu)建影像組學(xué)評分,紅色越深代表評分越高,風(fēng)險越高,紫色越深代表評分越低,風(fēng)險越低。* 代表不同臨床病理特征影像組學(xué)評分存在顯著差異(*為P<0.05,**為P<0.01,***為P<0.001)。 圖3 a)影像組學(xué)評分與LGG患者生存期關(guān)系,高風(fēng)險患者(患者)中位生存期明顯短于低風(fēng)險組(紫色);b)影像組學(xué)評分預(yù)測LGG患者1、3、5年ROC曲線。

本研究根據(jù)ssGSEA來量化133例LGG患者中免疫細胞、功能或通路的活性或富集水平,由于7例患者免疫細胞信息缺失,共有126例患者進行聚類分析。利用聚類分析將LGG患者分為兩種亞型(免疫炎癥型13例和免疫沙漠型113例),見圖4a。本研究還發(fā)現(xiàn)不同的免疫亞型在總生存期中具有不同預(yù)后意義,免疫沙漠型LGG患者預(yù)后較好(圖4b)。每個患者腫瘤純度、免疫評分、基質(zhì)評分和影像組學(xué)評分與免疫亞型的相關(guān)性熱圖見圖5。本研究發(fā)現(xiàn)不同免疫亞型的腫瘤純度、免疫評分、基質(zhì)評分及影像組學(xué)評分差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖6,P<0.05),發(fā)現(xiàn)免疫炎癥型患者影像組學(xué)評分較高,腫瘤純度較低,異質(zhì)性較高,預(yù)后較差。

圖4 LGG患者不同免疫分型聚類分析。a)聚類分析將LGG患者分為兩種不同的免疫表型?！凹t色簇”代表免疫細胞浸潤較多的免疫炎癥型腫瘤,“藍色簇”代表免疫細胞浸潤較少的免疫沙漠型腫瘤;b)不同免疫分型K-M生存曲線,免疫炎癥型預(yù)后明顯差于免疫沙漠型。 圖5 影像組學(xué)評分、腫瘤純度、預(yù)估評分、免疫評分、基質(zhì)評分與不同免疫分型相關(guān)性熱圖。紅色代表富集分數(shù)越高,綠色代表富集分數(shù)越低(*為P<0.05,**為P<0.01,***為P<0.001)。

圖6 不同免疫亞型之間各指標(biāo)差異分析(*為P<0.05,**為P<0.01,***為P<0.001)。a)影像組學(xué)評分;b)免疫評分;c)基質(zhì)評分;d)腫瘤純度。

討 論

本研究首次基于放射基因組學(xué)全面分析影像組學(xué)與LGG預(yù)后及不同免疫分型的相關(guān)性?；?1個組學(xué)構(gòu)建的組學(xué)特征有效將LGG分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組,高風(fēng)險患者預(yù)后明顯差于低風(fēng)險組。影像組學(xué)評分與LGG病理類型存在顯著相關(guān),腫瘤級別越高,組學(xué)評分越高,IDH突變型患者影像組學(xué)評分低于IDH野生型。為了探索預(yù)后差異的遺傳背景,分析了相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組圖譜。聚類分析將LGG患者分為兩種不同免疫亞型,LGG主要表現(xiàn)為免疫沙漠型,預(yù)后明顯好于免疫炎癥型。分析不同免疫分型與影像組學(xué)評分的相關(guān)性,結(jié)果表明影像組學(xué)評分與免疫炎癥型存在一定平行關(guān)系,免疫炎癥型患者影像組學(xué)評分較高,異質(zhì)性明顯高于免疫沙漠型。

膠質(zhì)瘤的時空異質(zhì)性不能局限于術(shù)后病理獲取,由于少量的活檢組織不能全面反映整個腫瘤的異質(zhì)性,因此無創(chuàng)性的MRI圖像分析在LGG膠質(zhì)瘤評估中扮演著重要角色。先前大量研究證實MRI組學(xué)特征在預(yù)測低級別膠質(zhì)瘤IDH分型及預(yù)后均表現(xiàn)出較高的準(zhǔn)確性[7,14],已經(jīng)成為精準(zhǔn)治療的橋梁;本研究基于MRI增強特征構(gòu)建的影像組學(xué)評分可以有效將LGG分進行風(fēng)險分層并且具有較高的預(yù)后預(yù)測能力,與先前研究基本一致[15];本研究同時發(fā)現(xiàn)不同病理分型、分子分型之間影像組學(xué)評分存在顯著差異,Li等[16]最新開發(fā)基于臨床MRI掃描的放射組學(xué)特征可有效鑒別不同級別的LGG、不同IDH突變和1p/19q共缺失狀態(tài),準(zhǔn)確率為0.81～0.89,與本研究結(jié)果類似。然而不同影像特征預(yù)后差異的生物學(xué)機制鮮見報道。

放射基因組學(xué)是整合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀基因組學(xué)及影像組學(xué)等多組學(xué)數(shù)據(jù)全面分析腫瘤遺傳背景,已經(jīng)逐漸成為研究關(guān)注的熱點[17,18]。Sun等[17]研究團隊納入435名膠質(zhì)母細胞瘤患者,研究發(fā)現(xiàn)基于13個影像組學(xué)特征構(gòu)建的影像組學(xué)評分與總生存期相關(guān)(HR為3.68) ,聚類分析發(fā)現(xiàn)四種不同影像表型與免疫、增殖等不同生物學(xué)行為密切相關(guān)。Lai等[19]利用術(shù)前CT影像特征(腫瘤直徑及轉(zhuǎn)移角)可以有效預(yù)測胃癌染色體不穩(wěn)定狀態(tài),ROC曲線下面積為0.89。最新研究基于TCGA-TICA數(shù)據(jù)庫利用73名乳腺腫瘤患者乳腺動態(tài)對比增強磁共振成像中提取的放射學(xué)特征來預(yù)測10種細胞類型在乳腺癌病變中的浸潤,證實乳腺腫瘤患者影像特征和遺傳微環(huán)境的相關(guān)性[20]。這一系列研究表明放射基因組學(xué)具有預(yù)測腫瘤微環(huán)境的潛力,更多捕捉腫瘤內(nèi)基因水平的變化,影像特征與分子表型間存在一定的關(guān)聯(lián)性。本研究首次聯(lián)合TCGA-TICA數(shù)據(jù)庫進一步探索133例LGG患者影像特征與免疫基因表達譜之間的關(guān)聯(lián)性,表明不同影像特征表現(xiàn)為不同的免疫亞型,表明不同的影像特征具有不同的生物學(xué)機制。本研究了發(fā)現(xiàn)大多數(shù)免疫細胞在LGG中可以獲得相對較低的 ssGSEA評分,表明大部分LGG 可能是一種“免疫沙漠型”腫瘤,少部分LGG患者屬于“免疫炎癥型”。還值得注意的是,免疫沙漠型LGG由于免疫細胞浸潤較少,免疫療法對大部分LGG患者的療效較差[21,22],相反,免疫炎癥型LGG患者對免疫療法相對有效。同時本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤純度低、免疫評分高、基質(zhì)評分高、ESTIMATE評分高為特征的LGG患者預(yù)后較差,上述結(jié)果已經(jīng)在相關(guān)研究證實[23]。最重要的是,研究結(jié)果表明免疫沙漠型LGG患者影像組學(xué)評分較低,預(yù)后較好,在一定程度上反映了免疫沙漠型患者異質(zhì)性較低,進一步說明影像特征對表征免疫亞型具有一定的潛力。

本研究的局限性:①盡管由于樣本量的限制,本研究的結(jié)論是初步的,但如果在更大的隊列中得到驗證,這些發(fā)現(xiàn)對膠質(zhì)瘤免疫治療將具有重要的臨床意義;②本研究僅僅提取了T1增強序列的影像組學(xué)特征、瘤周水腫和壞死區(qū)特征對低級別膠質(zhì)瘤也具有重要意義,另外感興趣區(qū)的勾畫存在一定的主觀性,未來自動分割技術(shù)將有助于解決該弊端;③低級別膠質(zhì)瘤患者免疫治療方案缺乏,不能準(zhǔn)確預(yù)測免疫治療反應(yīng)。

綜上所述,本研究聯(lián)合LGG的MRI影像組學(xué)與基因轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征,構(gòu)建影像組學(xué)評分預(yù)測LGG預(yù)后,采用聚類分析方法評估不同免疫分型與影像組學(xué)評分的關(guān)聯(lián)性進行嘗試性分析,結(jié)果表明影像組學(xué)評分與免疫炎癥型存在一定平行關(guān)系,免疫炎癥型患者影像組學(xué)評分較高,異質(zhì)性明顯高于免疫沙漠型,預(yù)后較差。放射基因組學(xué)分析通過影像組學(xué)特征無創(chuàng)性表征不同免疫亞型信息,可為免疫靶向治療開拓新的視角。