馬曉杰，趙延明，王軍燕，周苗苗，彭欣，潘乃菲，高惠敏，劉宸銘，蘇成付

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 青島 266109)

玉米是重要的糧食和飼料作物，也是一種生物質(zhì)能源材料[1-2]，在人們生產(chǎn)生活中占據(jù)重要地位。 果穗是玉米的主要收獲器官，穗長(zhǎng)是影響玉米籽粒產(chǎn)量的重要性狀之一。 Jenkins 等[3]早期研究表明，玉米自交系產(chǎn)量與穗長(zhǎng)性狀顯著正相關(guān)；梁曉玲等基于17 個(gè)玉米雜交種[4]、李泉木等基于20 個(gè)雜交組合[5]的研究結(jié)果也證明穗長(zhǎng)性狀與產(chǎn)量間存在正相關(guān)關(guān)系。 因此，定位玉米穗長(zhǎng)的QTL 具有重要意義，不僅有助于理解玉米穗長(zhǎng)性狀的遺傳基礎(chǔ)和分子調(diào)控機(jī)制，而且可為挖掘玉米產(chǎn)量潛力奠定基礎(chǔ)。

前人已對(duì)玉米穗長(zhǎng)性狀開(kāi)展了一些QTL 定位研究，但因穗長(zhǎng)是復(fù)雜的數(shù)量性狀，不同試驗(yàn)材料在不同環(huán)境下的研究結(jié)果不同[6]。 王幫太等[7]以87-1 和綜3 為試驗(yàn)材料構(gòu)建染色體單片段代換系(SSSL)，并基于兩種環(huán)境下的表型數(shù)據(jù)，定位到20 個(gè)穗長(zhǎng)QTL 位點(diǎn)，解釋表型貢獻(xiàn)率12.10%～19.18%。 胡利宗等[8]基于NX110 與NX5314 組合的BC2F2回交群體，定位到4 個(gè)控制穗長(zhǎng)的QTLs，解釋表型變異1.32%～23.50%。 Li等[9]基于Dan232 和N04 雜交組合的F2、BC2F2和RIL 群體，在4 個(gè)環(huán)境下鑒定出14 個(gè)控制玉米穗長(zhǎng)的QTLs，解釋表型變異4.5%～8.7%。 Sabadin等[10]基于玉米自交系L-06-05F 與L-14-4B 組合獲得包含400 個(gè)家系的F2∶3群體，定位到5 個(gè)控制玉米穗長(zhǎng)的QTLs，解釋表型變異3.1%～7.9%。湯繼華等[11]以綜3 與87-1 為材料配制雜交組合，利用F2群體，在兩種環(huán)境中鑒定到8 個(gè)穗長(zhǎng)QTLs，解釋表型變異3.11%～11.86%。 Ross[12]利用玉米自交系SE-40 與LE-37 雜交獲得的F2和F2∶3群體，分別定位到9 個(gè)和26 個(gè)與穗長(zhǎng)相關(guān)的QTLs。 Veldboom 等[13]利用Mo17/H99 組合衍生的F2∶3群體定位到5 個(gè)穗長(zhǎng)QTLs。 代國(guó)麗等[14]利用L26/095 組合的F2群體鑒定到3 個(gè)玉米穗長(zhǎng)QTLs。 謝惠玲等[15]利用黃C/許178 組合獲得的重組自交系，定位到8 個(gè)穗長(zhǎng)QTLs。 霍冬敖[16]利用玉米自交系TY6 分別與Mo17 和W138組配F2分離群體以及F2∶3群體，鑒定到11 個(gè)玉米穗長(zhǎng)QTLs，解釋表型變異0.9%～15.6%。 李庭鋒[17]基于吉846/掖3189 組合的重組自交系群體，定位到19 個(gè)玉米穗長(zhǎng)QTLs，解釋表型貢獻(xiàn)率4.09%～14.49%。 王輝等[18]以鄭58 和HD568 為親本構(gòu)建RIL 群體，在不同種植密度下進(jìn)行QTL定位研究，檢測(cè)到8 個(gè)穗長(zhǎng)QTLs，分別位于1、2、3、4、9 號(hào)染色體，可解釋表型變異4.37% ～10.50%。Zhou 等[19]以鄭58/昌7-2 組合的F2∶3群體、D276/D72/A188/Jiao51 進(jìn)行四元雜交獲得的四交群體為材料，結(jié)合SSR 分子標(biāo)記，在兩環(huán)境下共檢測(cè)到14 個(gè)穗長(zhǎng)QTLs。 李衛(wèi)華等[20]以昌7-2的單片段代換系為材料，共檢測(cè)到22 個(gè)穗部性狀QTLs，其中控制穗長(zhǎng)性狀的QTLs 有9 個(gè)，單個(gè)QTL 可解釋8.6%～14.25%的表型變異；且發(fā)現(xiàn)了前人研究中同樣被檢測(cè)到的3 個(gè)玉米穗長(zhǎng)QTLs 和1 個(gè)穗粗QTL 穩(wěn)定表達(dá)位點(diǎn)。 Huo 等[21]以Mo17×TY6、W138×TY6 構(gòu)建兩套F2∶3家系群體，共檢測(cè)到11 個(gè)穗長(zhǎng)QTLs，可解釋0.9% ～15.6%的表型變異；在1 號(hào)染色體發(fā)現(xiàn)一個(gè)一因多效位點(diǎn)qEL1.10，同時(shí)調(diào)控穗長(zhǎng)及行粒數(shù)性狀。Zhao 等以廊黃×TS141 和昌7-2×TS141 兩組親本構(gòu)建的兩組F2∶3家系為材料，檢測(cè)到9 個(gè)穗長(zhǎng)QTLs，單個(gè)QTL 可解釋4.0%～17.2%的表型變異[22]；應(yīng)用同樣的試驗(yàn)材料，在不同環(huán)境下，利用復(fù)合區(qū)間作圖法(CIM)及基于混合線性模型的復(fù)合區(qū)間作圖法(MCIM)相結(jié)合，定位到2 個(gè)調(diào)控穗長(zhǎng)的MQTLs[23]。 Shi 等[24]構(gòu)建了240 個(gè)家系的DH 群體，結(jié)合高密度遺傳圖譜，定位到5 個(gè)與穗長(zhǎng)相關(guān)的QTLs，并在1 號(hào)染色體上定位到成簇QTLs，穗長(zhǎng)QTL(qEL1)、穗粗QTL(qED1)和穗軸粗QTL(qCD1)被重疊定位，3 個(gè)QTLs 分別解釋15.7%、28.3%和22.6%的表型變異。

在穗長(zhǎng)基因克隆上，張人予[25]克隆了玉米穗長(zhǎng)基因EL3，通過(guò)CRISPR/Cas9 技術(shù)進(jìn)行基因敲除和超表達(dá)、結(jié)合轉(zhuǎn)錄組技術(shù)驗(yàn)證了該基因。 Jia等[26]克隆了一個(gè)調(diào)控行粒數(shù)QTLqKNR6，研究結(jié)果表明該QTL 主效基因同時(shí)影響玉米穗長(zhǎng)與行粒數(shù)性狀。 Luo 等[27]運(yùn)用全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)技術(shù)，定位了一個(gè)未知蛋白編碼基因YIGE1，通過(guò)基因敲除及過(guò)表達(dá)分析，驗(yàn)證了YIGE1基因?qū)τ衩谆ㄐ蚍稚M織(IM)、行粒數(shù)(KNR)和穗長(zhǎng)(EL)具有正調(diào)控作用；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該基因可能通過(guò)參與糖和生長(zhǎng)素信號(hào)途徑，進(jìn)而調(diào)控玉米IM 的發(fā)育，影響行粒數(shù)和穗長(zhǎng)，最終增加玉米的產(chǎn)量。

通過(guò)多環(huán)境QTL 定位研究可以發(fā)現(xiàn)控制穗長(zhǎng)的穩(wěn)定QTL 位點(diǎn)，既為進(jìn)一步精細(xì)定位、克隆相關(guān)主效候選基因并深入研究其調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為玉米基因組學(xué)研究提供重要的試驗(yàn)材料和數(shù)據(jù)支持，有助于進(jìn)一步深入解析玉米穗長(zhǎng)遺傳調(diào)控機(jī)制。 雖然目前已有大量研究者利用不同作圖群體檢測(cè)了數(shù)百個(gè)穗長(zhǎng)QTLs，但多為初定位，未經(jīng)多環(huán)境驗(yàn)證其穩(wěn)定性，很難進(jìn)一步克隆利用。 本研究以穗長(zhǎng)性狀差異顯著的玉米自交系為親本，通過(guò)配制雜交組合，獲得F2代分離群體?；贔2代群體構(gòu)建高密度遺傳圖譜，結(jié)合多環(huán)境穗長(zhǎng)表型數(shù)據(jù)，采用WinQTLCart2.5 中的復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì)目標(biāo)性狀QTL 進(jìn)行定位，旨在對(duì)玉米穗長(zhǎng)性狀進(jìn)行遺傳剖析，研究穗長(zhǎng)的遺傳機(jī)制，提供新的玉米穗長(zhǎng)QTL 位點(diǎn)，為高產(chǎn)玉米新品種選育提供理論參考，加速玉米育種進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 分離群體構(gòu)建及表型調(diào)查

2013 年夏以穗長(zhǎng)差異顯著的玉米自交系SG5 和SG7 為試驗(yàn)材料配制雜交組合，獲得F1代雜交種子，自交F1得到F2代種子。 2014 年冬在海南省三亞市的盤縣玉米育種試驗(yàn)站種植由199株單株組成的F2分離群體，并自交，得到F2∶3家系。 2018 年和2019 年將F2∶3家系按穗行的方式，種植于盤縣玉米育種試驗(yàn)站，采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，單行區(qū)，每個(gè)家系一行，每行15 株，行距和株距分別為0.50 m 和0.35 m，田間管理及水肥施用與當(dāng)?shù)卮筇镉衩紫嗤?待果穗成熟收獲曬干后，用直尺測(cè)量穗基部到穗頂端的長(zhǎng)度，即穗長(zhǎng)。F2∶3家系穗長(zhǎng)通過(guò)測(cè)量株行中間正常8 個(gè)果穗的平均值獲得。 表型數(shù)據(jù)錄入Microsoft Excel 表中保存，頻數(shù)分布圖及方差分析由SPSS 20.0 完成。

1.2 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及QTL 定位

在玉米抽雄吐絲前，對(duì)兩個(gè)親本以及F2采取單株取樣。 剪取大小合適的葉片分別裝入帶有標(biāo)記的離心管中，置于液氮罐后轉(zhuǎn)至冰箱-80 ℃保存待用。 DNA 提取、基因組測(cè)序、SNP 分型及高密度遺傳連鎖圖譜構(gòu)建的具體方法見(jiàn)前期研究[28]。 應(yīng)用QTL Cartographer 2.5 的復(fù)合區(qū)間作圖法(CIM)的向前回歸模型進(jìn)行穗長(zhǎng)表型數(shù)據(jù)的全基因組掃描，步長(zhǎng)1 cM，為避免遺傳信息遺漏，LOD 值設(shè)置為2.5；QTL 加性或顯性效應(yīng)值為正表明QTL 的增加效應(yīng)來(lái)自母本SG5，QTL 加性或顯性效應(yīng)值為負(fù)則表明QTL 的增加效應(yīng)來(lái)自父本SG7。 應(yīng)用MapChart 2.32 軟件進(jìn)行QTL 在染色體上的位置描述。 將多環(huán)境F2和F2∶3群體QTL定位結(jié)果進(jìn)行比較，多環(huán)境重復(fù)表達(dá)的QTL 位點(diǎn)被認(rèn)定為穩(wěn)定的QTL 位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 穗長(zhǎng)性狀的統(tǒng)計(jì)分析

將2018、2019 年種植的F2∶3分離群體分別記為F2∶3-2018 和F2∶3-2019。 對(duì)F2、F2∶3-2018 和F2∶3-2019 三個(gè)環(huán)境穗長(zhǎng)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果(表1 和圖1)顯示，三個(gè)環(huán)境下，親本穗長(zhǎng)表現(xiàn)穩(wěn)定，SG5 穗長(zhǎng)為14.38 cm，SG7 穗長(zhǎng)為12.72 cm；F2家系間穗長(zhǎng)變異范圍為12.8 ～21.0 cm， 平均15.42 cm；F2∶3-2018 家系間穗長(zhǎng)變異范圍為12.1～20.2 cm， 平均15.37 cm； F2∶3-2019 家系間穗長(zhǎng)變異范圍為10.8 ～21.7 cm， 平均15.40 cm?？梢?jiàn)，群體呈超親混合分布形式，家系間差異明顯，存在遺傳變異，該分離數(shù)據(jù)可以進(jìn)行QTL 定位分析。

圖1 F2、F2∶3-2018、F2∶3-2019 群體穗長(zhǎng)性狀頻次分布

表1 F2、F2∶3-2018 和F2∶3-2019 分離群體的玉米穗長(zhǎng)性狀的統(tǒng)計(jì)分析 cm

2.2 QTL 定位結(jié)果

基于前期研究中構(gòu)建的高密度遺傳連鎖圖譜[28]，利用CIM 法，對(duì)多環(huán)境穗長(zhǎng)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL 定位。 從檢測(cè)結(jié)果(表2)看，在F2群體中共檢測(cè)到4 個(gè)QTL 位點(diǎn)qEL-1、qEL-2、qEL-3和qEL-4，分別位于第1、2、5、6 染色體上，其中，位于第1 染色體上的qEL-1具有最大的表型貢獻(xiàn)率，為24.0%，LOD 值為15.3；qEL-2具有最小的表型貢獻(xiàn)率，為3.0%，LOD 值7.2。 在F2∶3-2018中共檢測(cè)到4 個(gè)QTL 位點(diǎn)(qEL-1、qEL-2、qEL-3和qEL-5)，分別位于第1、2、3、5 染色體上，其中，位于第1 染色體上的qEL-1具有最大的表型貢獻(xiàn)率，為23.5%，LOD 值為16.6；qEL-2位于第2染色體，表型貢獻(xiàn)率最小，為4.2%。 在F2∶3-2019中共檢測(cè)到3 個(gè)QTL 位點(diǎn)(qEL-1、qEL-2、qEL-5)，分別位于第1、2、3 染色體上，其中，位于第1染色體上的qEL-1具有最大的表型貢獻(xiàn)率，為25.6%，LOD 值為15.3；qEL-2位于第2 染色體，其表型貢獻(xiàn)率最小，為3.9%。

表2 F2、F2∶3-2018 和F2∶3-2019 分離群體的玉米穗長(zhǎng)性狀QTLs 定位結(jié)果

經(jīng)遺傳位置比對(duì)(圖2)，在F2、F2∶3-2018 和F2∶3-2019 三個(gè)環(huán)境下共定位到5 個(gè)穗長(zhǎng)QTLs，其中，qEL-1和qEL-2在三個(gè)環(huán)境中重復(fù)被檢測(cè)到，qEL-3在F2和F2∶3-2018 兩個(gè)環(huán)境中被檢測(cè)到，qEL-5在F2∶3-2018 和F2∶3-2019 兩個(gè)環(huán)境中被檢測(cè)到，而qEL-4只在F2環(huán)境中被檢測(cè)到。

圖2 基于F2、F2∶3-2018 和F2∶3-2019 分離群體的玉米穗長(zhǎng)QTLs 位置

可見(jiàn)，qEL-1和qEL-2為三環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)QTLs。 從QTL 作用方式看，qEL-1表現(xiàn)為加性效應(yīng)，其增效等位基因來(lái)自父本SG7；qEL-2表現(xiàn)為顯性效應(yīng)，其增效基因來(lái)自父本SG7。

3 討論

遺傳圖譜的分子標(biāo)記密度對(duì)QTL 準(zhǔn)確定位及候選基因預(yù)測(cè)具有重大的理論價(jià)值。 分子標(biāo)記密度低，分布不均勻，分子標(biāo)記間的遺傳距離大，則定位到的QTL 之間距離過(guò)大，對(duì)QTL 定位準(zhǔn)確性影響較大。 隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，全基因組測(cè)序逐漸被應(yīng)用到QTL 定位中，SNP 分子標(biāo)記借助于高通量基因分型技術(shù)，已在遺傳分析中得到廣泛應(yīng)用。 同低密度遺傳連鎖圖譜相比，高密度遺傳連鎖圖譜具有眾多優(yōu)勢(shì):首先，可以更準(zhǔn)確地定位QTL 位置，縮小候選區(qū)間，提高QTL 定位的精度，同時(shí)，高密度遺傳連鎖圖譜還能夠檢測(cè)到更多的QTLs，提高檢測(cè)的靈敏性；其次，高密度遺傳連鎖圖譜可以提供更多的分子標(biāo)記和候選基因信息，有助于篩選與目標(biāo)性狀相關(guān)的候選基因，進(jìn)一步了解基因功能和分子機(jī)制；此外，高密度遺傳連鎖圖譜可以加速分子育種進(jìn)程，通過(guò)分子標(biāo)記輔助育種，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)性狀的精準(zhǔn)選育。 可見(jiàn)，高密度遺傳連鎖圖譜不僅能提高QTL 的檢測(cè)效率，還能提供與QTL 緊密連鎖的分子標(biāo)記，用于分子標(biāo)記輔助選擇。 前期研究中基于F2分離群體構(gòu)建的高密度遺傳連鎖圖譜[28]，為本研究QTL 定位提供了重組的分子標(biāo)記數(shù)量，獲得了與目標(biāo)QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，為后期玉米穗長(zhǎng)性狀精細(xì)定位奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。 應(yīng)用構(gòu)建的高密度遺傳連鎖圖譜，我們分別在1、2、3、5、6 號(hào)染色體上檢測(cè)到玉米穗長(zhǎng)QTLs，其最大表型貢獻(xiàn)率達(dá)到25.6%，位于第1 染色體上。 王幫太[7]、胡利宗[8]、Li[9]、霍冬敖[16]、李庭鋒[17]、呂學(xué)高[29]、周廣飛[30]等均在第1 染色體檢測(cè)到玉米穗長(zhǎng)QTLs；王幫太[7]、Li[9]、湯繼華[11]、代國(guó)麗[14]、霍冬敖[16]等均在第2 染色體檢測(cè)到玉米穗長(zhǎng)QTLs。 可見(jiàn)，1、2 號(hào)染色體是挖掘玉米穗長(zhǎng)性狀的重要染色體，這與本研究在第1、2 染色體獲得三環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)穗長(zhǎng)QTLs 的結(jié)果一致。

多環(huán)境檢測(cè)能夠減少環(huán)境誤差的影響，提高QTL 檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性，同時(shí)還能發(fā)現(xiàn)遺傳效應(yīng)較小的QTL，提高檢測(cè)的靈敏性。 不同環(huán)境對(duì)同一性狀的影響不同，在不同環(huán)境中檢測(cè)QTL能夠驗(yàn)證其效應(yīng)是否一致和穩(wěn)定，排除偶然或環(huán)境干擾的影響，有助于進(jìn)一步研究QTL 的表達(dá)規(guī)律和遺傳機(jī)制。 玉米大部分產(chǎn)量性狀QTL 為復(fù)雜的數(shù)量性狀，受環(huán)境影響較大，環(huán)境條件不同，產(chǎn)量性狀QTL 表達(dá)也不同，因此在多環(huán)境中被重復(fù)檢測(cè)到的QTL 可視為穩(wěn)定QTL，對(duì)于作物遺傳改良和分子育種具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)多環(huán)境QTL 檢測(cè)方法，以F2、F2∶3-2018 及F2∶3-2019 三環(huán)境穗長(zhǎng)表型數(shù)據(jù)，結(jié)合高密度遺傳連鎖圖譜，從SG5 和SG7 的F2∶3群體中檢測(cè)到5 個(gè)控制玉米穗長(zhǎng)QTLs，其中，qEL-1和qEL-2在三個(gè)環(huán)境中穩(wěn)定表達(dá)，且qEL-1具有超過(guò)20%的穩(wěn)定表型貢獻(xiàn)率；qEL-3和qEL-5均在兩個(gè)環(huán)境中被檢測(cè)到。 這些QTLs 可視為多環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)位點(diǎn)，不僅可為玉米穗長(zhǎng)性狀主效位點(diǎn)的精細(xì)定位、圖位克隆提供依據(jù)，同時(shí)可為玉米高產(chǎn)分子育種奠定理論基礎(chǔ)。