田鳳鳴，陳強(qiáng)，何九軍，王國(guó)斌，張曉娜

(1. 隴南師范高等?？茖W(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院/隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心，甘肅 隴南 742500；2. 隴南市武都區(qū)花椒服務(wù)中心，甘肅 隴南 742500)

花椒根腐病是一種危害性極強(qiáng)的土傳病害，嚴(yán)重時(shí)能造成椒樹死亡。 前期研究鑒定認(rèn)為，引起甘肅隴南武都花椒種植區(qū)根腐病的病原菌為腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)[1]。 隨著化學(xué)農(nóng)藥減量化防治的推廣，花椒根腐病的生物防治成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，也是獲得一種可持續(xù)且安全有效的病害防治方案的重要選項(xiàng)。 拮抗菌對(duì)病原菌具有高度特異性，綠色環(huán)保是拮抗菌在防治植物病害中所具有的優(yōu)點(diǎn)[2]。 農(nóng)藥商業(yè)化生產(chǎn)中，越來(lái)越多的優(yōu)良微生物菌種資源被開發(fā)成生防制劑，且其防治效果受到好評(píng)。 植物病害生物防治中芽孢桿菌顯示出巨大的潛力和應(yīng)用前景[3]。

響應(yīng)面分析法現(xiàn)已成為優(yōu)化拮抗菌發(fā)酵培養(yǎng)的常用手段，該方法的特點(diǎn)是能節(jié)約時(shí)間和減少試驗(yàn)次數(shù)，克服了單因素試驗(yàn)存在的不足[4-8]。目前有關(guān)花椒根腐病拮抗菌的資源較少，優(yōu)良菌種資源更是相對(duì)匱乏，已報(bào)道的對(duì)花椒根腐病具有良好拮抗作用的菌株有淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)[9]、蠟樣芽孢桿菌[10]、綠色木霉和哈茨木霉[11]、貝萊斯芽孢桿菌T-1[12]。 本研究于2021 年以引起花椒根腐病的主要致病真菌腐皮鐮刀菌為指示菌，采用土壤平板稀釋法和平板對(duì)峙法分離獲得花椒根腐病拮抗菌W-5，繼而對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，測(cè)定其抑菌活性，并基于單因素試驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken 設(shè)計(jì)的響應(yīng)面法對(duì)菌株W-5 的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為花椒根腐病拮抗生物菌劑的開發(fā)與應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 指示菌腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)H1 和拮抗菌W-5 分別從患有花椒根腐病的花椒根部組織和根系土壤中分離獲得，保存于隴南師范高等?？茖W(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。 用于廣譜抑菌試驗(yàn)的病原菌(藤倉(cāng)赤霉菌、禾谷鐮刀菌、梅毒鐮刀菌、層生鐮刀菌)由江西師范大學(xué)楊慧林老師惠贈(zèng)，核桃炭疽病松針刺盤孢菌由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究生魏彬惠贈(zèng)。 病原菌保存于4 ℃冰箱備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 供試培養(yǎng)基如下。

PDA 培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯去皮切塊稱取200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水定容至1 L。

LB 培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，溶質(zhì)溶解后，pH 值用5.0 mol/L NaOH 調(diào)至7.0，去離子水定容至1 L。

NYBD 培養(yǎng)基(g/L):酵母浸粉5.0 g，牛肉浸粉8.0 g，葡萄糖10.0 g，調(diào)pH 值至7.5，加蒸餾水至1 L。

以上三種培養(yǎng)基均在103.4 kPa 下滅菌21 min。

1.1.3 主要試劑和儀器 胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸粉、葡萄糖、瓊脂、氫氧化鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；722N 可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；氣浴式搖床，常州高德儀器制造有限公司產(chǎn)品；立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；細(xì)菌基因組提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.2 拮抗菌的分離、篩選及鑒定

1.2.1 拮抗菌W-5 的分離 稱取花椒根系土壤1.0 g，放入100 mL 無(wú)菌三角瓶中，加入無(wú)菌水90 mL，搖床上180 r/min 培養(yǎng)30 min，靜置30 min后，取上清液并將濃度梯度稀釋至10-1～10-8。 取10-6、10-7、10-8三個(gè)濃度梯度溶液200 μL 涂布于LB 固體培養(yǎng)基中32 ℃培養(yǎng)2 d，之后挑取單菌落，編號(hào)為W-5，并將其接種于LB 液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗菌W-5 的篩選 采用平板對(duì)峙法[13]對(duì)分離出的拮抗菌W-5 進(jìn)行抑菌效果測(cè)定。 以腐皮鐮刀菌為指示菌，用打孔器將其打成直徑為6 mm 的菌餅，接種于PDA 培養(yǎng)基中心，距離中心點(diǎn)2 cm 處成品字形放入無(wú)菌濾紙片，取W-5 單菌落菌液10 μL 加在濾紙片上，30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，測(cè)定病原真菌菌落直徑，計(jì)算抑制率。

1.2.3 拮抗菌W-5 的分子生物學(xué)鑒定 利用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)的方法對(duì)拮抗菌W-5 進(jìn)行鑒定。 將W-5 菌株接種至LB 培養(yǎng)基上，32 ℃培養(yǎng)2 d，置于光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)，單菌落置于體視顯微鏡(放大倍數(shù)為150×)下觀察其形態(tài)，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色[14]；分子鑒定采用細(xì)菌通用引物27F:5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇/1492R:5＇-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3＇進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 北京六合華大基因科技有限公司完成基因測(cè)序，采用BLAST 完成測(cè)序結(jié)果的同源性分析，系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建運(yùn)用MEGA 7.0 中N-J 法完成[15]。

1.3 拮抗菌W-5 對(duì)腐皮鐮刀菌前端菌絲生長(zhǎng)影響的觀察

將1.2.2 中平板對(duì)峙法獲得的抑菌平板置于體視顯微鏡(150×)下，觀察拮抗菌W-5 對(duì)病原菌腐皮鐮刀菌前端菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.4 拮抗菌W-5 對(duì)病原真菌抑菌譜的檢測(cè)

以5 種病原真菌(禾谷鐮刀菌、梅毒鐮刀菌、藤倉(cāng)赤霉菌、松針刺盤孢菌和層生鐮刀菌)為供試指示菌，采用平板對(duì)峙法檢測(cè)拮抗菌W-5 對(duì)各病原真菌的抑制率，其方法同1.2.2。

1.5 拮抗菌W-5 對(duì)花椒根片的離體抑菌試驗(yàn)

花椒根片的離體抑菌試驗(yàn)操作步驟參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。

1.6 拮抗菌W-5 產(chǎn)胞外酶的檢測(cè)及嗜鐵素培養(yǎng)基檢測(cè)

纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、蛋白酶檢測(cè)培養(yǎng)基的配制參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行，采用CAS 檢測(cè)平板進(jìn)行拮抗菌W-5 產(chǎn)嗜鐵素的檢測(cè)，其制備參照文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行。

1.7 拮抗菌W-5 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.7.1 測(cè)定繪制拮抗菌W-5 生長(zhǎng)曲線 將拮抗菌W-5 種子液按照1%的比例接入LB 液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min 搖床上振蕩培養(yǎng)，采用可見分光光度法每間隔2 h 測(cè)定其OD600值，共測(cè)定16 個(gè)點(diǎn)，每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，繪制其生長(zhǎng)曲線。

1.7.2 單因素試驗(yàn)篩選最佳發(fā)酵條件 前期試驗(yàn)已確定拮抗菌W-5 生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基為NYBD，以此為基礎(chǔ)比較不同溫度(26、28、30、32、34 ℃)、pH 值(2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5)、接種量(1%、3%、5%、7%、9%、11%)、 轉(zhuǎn)速(140、160、180、200、220 r/min )4 個(gè)因素對(duì)拮抗菌W-5 生長(zhǎng)的影響，以其OD600峰值為指標(biāo)確定最佳單因素發(fā)酵條件。

1.7.3 響應(yīng)面法確定最佳因素組合 在1.7.2 試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取溫度、pH 值、轉(zhuǎn)速和接種量為自變量，以拮抗菌株W-5 發(fā)酵液OD600為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面組合試驗(yàn)，以1、0、-1 表示4 個(gè)因素的高低水平進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析。 試驗(yàn)因素和水平見表1。 利用Design Expert 11 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)(表2)，優(yōu)化拮抗菌W-5 的最佳發(fā)酵條件。

表1 優(yōu)化拮抗菌W-5 發(fā)酵培養(yǎng)條件因素與水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)

表2 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)方案和結(jié)果

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2007 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析及作圖，響應(yīng)面結(jié)果采用Design Expert 11 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌W-5 的形態(tài)特征及革蘭氏染色結(jié)果分析

拮抗菌W-5 在LB 固體培養(yǎng)基中32 ℃培養(yǎng)2 d，于光學(xué)顯微鏡和體視顯微鏡下觀察菌落形態(tài)，結(jié)果(圖1)顯示，菌落較大為乳白色且不透明，邊緣不規(guī)則，表面粗糙且有褶皺，革蘭氏染色為陽(yáng)性菌。

圖1 拮抗菌W-5 的形態(tài)特征及革蘭氏染色結(jié)果

2.2 平板透明圈法檢測(cè)拮抗菌W-5 產(chǎn)酶能力和嗜鐵素檢測(cè)

三種胞外酶檢測(cè)結(jié)果顯示，拮抗菌W-5 在蛋白酶、纖維素酶檢測(cè)培養(yǎng)基中均可產(chǎn)生較大的降解圈(圖2A、B)，而在幾丁質(zhì)酶檢測(cè)培養(yǎng)基中無(wú)降解圈產(chǎn)生。 CAS 檢測(cè)結(jié)果顯示有明顯的橙黃色嗜鐵素的螯合圈(圖2C)。

圖2 拮抗菌W-5 產(chǎn)酶培養(yǎng)基和嗜鐵素培養(yǎng)基的檢測(cè)

2.3 拮抗菌W-5 對(duì)腐皮鐮刀菌的拮抗效果及對(duì)病原菌前端菌絲生長(zhǎng)的影響

培養(yǎng)5 d 后的腐皮鐮刀菌菌落直徑為110.0 mm (圖3A)，接種拮抗菌W-5 的病原菌菌落直徑為24.0 mm (圖3B)，抑制率高達(dá)82.7%。 體視顯微鏡下觀察拮抗菌W-5 對(duì)腐皮鐮刀菌前端菌絲生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示，未接種拮抗菌的病原菌菌絲前端呈放射狀且菌絲濃密蓬松、粗細(xì)均勻(圖3C)，接種拮抗菌W-5 的病原菌菌絲前端稀薄、扭曲成畸形，失去了延伸性(圖3D)。 以上結(jié)果說(shuō)明拮抗菌W-5 對(duì)花椒根腐病病原菌腐皮鐮刀菌確有抑制作用且效果良好。

圖3 菌株W-5 對(duì)腐皮鐮刀菌的拮抗效果及對(duì)病原菌前端菌絲生長(zhǎng)的影響

2.4 拮抗菌W-5 對(duì)病原真菌抑菌譜的檢測(cè)結(jié)果分析

為進(jìn)一步檢測(cè)拮抗菌W-5 對(duì)其他植物病原菌的抑菌活性，采用平板對(duì)峙法檢測(cè)其對(duì)5 種病原真菌的抑菌效果，結(jié)果顯示，拮抗菌W-5 對(duì)藤倉(cāng)赤霉菌的抑制率為74.3%(圖4A)，對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制率為74.6%(圖4B)，對(duì)梅毒鐮刀菌的抑制率為62.5%(圖4C)，對(duì)松針刺盤孢菌的抑制率為70.3%(圖4D)，對(duì)層生鐮刀菌的抑制率為71.4%(圖4E)。 表明拮抗菌株W-5 有較為廣泛的抑菌活性，具有一定的開發(fā)潛力。

圖4 拮抗菌W-5 對(duì)病原真菌的廣譜抑菌效果

2.5 拮抗菌W-5 離體拮抗結(jié)果分析

為再次驗(yàn)證拮抗菌W-5 對(duì)花椒根腐病病原菌的抑制效果，進(jìn)行了花椒根片的離體拮抗試驗(yàn)，結(jié)果表明:花椒根片在接種無(wú)菌水培養(yǎng)7 d 后依然保持原有色澤，無(wú)異味產(chǎn)生，根皮與木質(zhì)部不發(fā)生分離，根片周圍也無(wú)液體產(chǎn)生(圖5A)；培養(yǎng)3 d 后接種腐皮鐮刀菌的花椒根片則開始變軟發(fā)黑，逐漸產(chǎn)生病癥，且病原菌菌絲纏繞在花椒根片周圍，產(chǎn)生的液體使濾紙變色，根皮和木質(zhì)部發(fā)生分離，同時(shí)有臭味產(chǎn)生，且病癥與大田中典型花椒根腐病的病癥相同(圖5B)；而接種拮抗菌W-5和病原菌的花椒根片發(fā)病癥狀與圖5B 相比，發(fā)病癥狀減輕，根片顏色較淺且未出現(xiàn)變軟現(xiàn)象，根皮和根片未發(fā)生完全分離(圖5C)。 說(shuō)明離體狀態(tài)下拮抗菌W-5 對(duì)花椒根腐病病原菌仍有良好的拮抗效果，與2.3 中的結(jié)果一致。

圖5 拮抗菌W-5 對(duì)花椒根片的離體拮抗作用

2.6 拮抗菌W-5 的分子生物學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

采用通用引物對(duì)拮抗菌W-5 進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果顯示:PCR 擴(kuò)增有效片段的大小為1 480 bp。 對(duì)得到的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對(duì)，選取數(shù)據(jù)庫(kù)中與拮抗菌W-5 相近的15 個(gè)菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)菌株W-5 與HE659512.1 的親緣關(guān)系最近，同屬于枯草芽孢桿菌屬，結(jié)合其形態(tài)特征初步確定拮抗菌W-5 為枯草芽孢桿菌(圖6)。

圖6 基于16S rDNA 基因構(gòu)建的拮抗菌W-5 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.7 響應(yīng)面法優(yōu)化拮抗菌W-5 發(fā)酵條件的參數(shù)

2.7.1 拮抗菌W-5 生長(zhǎng)曲線繪制與分析 菌株W-5 生長(zhǎng)曲線(圖7)顯示，接種0 ～16 h 之間其生長(zhǎng)速率較快，16～22 h 之間生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，22 h 后生長(zhǎng)速率逐漸降低，故將拮抗菌W-5 的最佳生長(zhǎng)周期確定為22 h。

圖7 拮抗菌W-5 生長(zhǎng)曲線

2.7.2 拮抗菌W-5 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析 圖8為pH 值、溫度、接種量、轉(zhuǎn)速4 個(gè)發(fā)酵因素對(duì)拮抗菌株W-5 生長(zhǎng)的影響結(jié)果。 pH 值在2.5～10.5之間菌株W-5生長(zhǎng)呈現(xiàn)先快后慢的狀態(tài)；pH值在5.5～9.5 之間菌株生長(zhǎng)良好，表明弱堿性條件下其依然具有一定的生長(zhǎng)能力，即具有一定的耐堿性；pH 值為7.5 時(shí)其OD600達(dá)到峰值，因此確定該菌株生長(zhǎng)的最佳pH 值為7.5。 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)影響的結(jié)果顯示:26 ～34 ℃之間菌株均可生長(zhǎng)，30 ℃為該菌的最佳生長(zhǎng)溫度。 接種量在1%～11%之間，該菌生長(zhǎng)良好，接種量為3%時(shí)其OD600達(dá)到峰值，因此確定3%為該菌的最佳接菌量。 搖床上轉(zhuǎn)速在140～220 r/min 之間菌株生長(zhǎng)量呈現(xiàn)先升后降的狀態(tài)，180 r/min 時(shí)其OD600達(dá)到峰值，因此確定180 r/min 為最佳轉(zhuǎn)速。

圖8 不同發(fā)酵因素對(duì)拮抗菌株W-5 生長(zhǎng)的影響

2.7.3 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件結(jié)果分析 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2。 通過(guò)響應(yīng)面法獲得的方差分析結(jié)果(表3)來(lái)研究各因素對(duì)拮抗菌W-5發(fā)酵培養(yǎng)的影響，得出的回歸模型為:

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸方程方差分析

Y ＝1.94-0.0091A+ 0.0067B + 0.0168C +0.0195D+ 0. 0078AB + 0. 0257AC - 0. 0021AD +0.0544BC- 0.0217BD - 0.0516CD - 0. 2499A2-0.2650B2-0.3046C2-0.2700D2。

由該回歸方程分析及方差分析結(jié)果可知，回歸模型極顯著，說(shuō)明該模型對(duì)響應(yīng)值擬合良好；除AD、AB 項(xiàng)未達(dá)到顯著水平外，一次項(xiàng)B 對(duì)拮抗菌W-5 的OD600具有顯著水平，其余一次項(xiàng)、二次項(xiàng)、交互項(xiàng)(AC、BC、BD 和CD)對(duì)拮抗菌W-5 的OD600都達(dá)到極顯著水平，說(shuō)明其OD600的變化復(fù)雜，各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。說(shuō)明溫度、pH 值、接種量、轉(zhuǎn)速4 個(gè)因素對(duì)拮抗菌W-5的發(fā)酵培養(yǎng)工藝影響顯著或極顯著。 失擬度0.0601＞0.05，說(shuō)明試驗(yàn)點(diǎn)均能用該模型描述。 拮抗菌發(fā)酵培養(yǎng)工藝模型決定系數(shù)為R2＝0.9991，說(shuō)明模型的相關(guān)性很好，并能較好地進(jìn)行響應(yīng)值的變化分析，確定最佳發(fā)酵條件。 經(jīng)擬合檢驗(yàn)后校正系數(shù)R2adj ＝0.9983，兩者非常接近，說(shuō)明拮抗菌發(fā)酵培養(yǎng)響應(yīng)面二次回歸擬合度很好。 信噪比Adeq Precision ＝104.3978＞4，說(shuō)明該模型的試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠，可信度較高，預(yù)測(cè)較為準(zhǔn)確。 F 值分析結(jié)果顯示，對(duì)拮抗菌W-5 發(fā)酵的影響程度:轉(zhuǎn)速＞接種量＞溫度＞pH 值。

響應(yīng)曲面坡度的陡峭與平緩能夠直接反映4個(gè)因素對(duì)OD600的影響，即可以直觀地反映出pH值、溫度、接種量、轉(zhuǎn)速對(duì)拮抗菌W-5 發(fā)酵培養(yǎng)的影響。 圖9 顯示，4 個(gè)因素之間的各個(gè)響應(yīng)曲面均為凸型曲面且開口朝下，代表響應(yīng)值有著極高值，而且曲面坡度都比較陡峭，說(shuō)明其因子之間交互作用復(fù)雜。 各因素之間的交互作用對(duì)拮抗菌W-5 發(fā)酵培養(yǎng)的影響程度由大到小的順序?yàn)?CD＞BC＞AC＞BD＞AD，其中除AD、AB 項(xiàng)外，其余交互因素對(duì)拮抗菌W-5 OD600值的影響均達(dá)到極顯著水平。

圖9 菌株W-5 發(fā)酵中不同因素對(duì)OD600值影響的響應(yīng)面圖

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，可將拮抗菌W-5 發(fā)酵培養(yǎng)的最佳條件確定為:溫度31.3 ℃、pH 值7.5、接種量3.1%、轉(zhuǎn)速180.5 r/min，優(yōu)化后的OD600值達(dá)到1.832。 考慮到生產(chǎn)實(shí)際情況及操作的便利性，將該菌的最佳發(fā)酵條件修正為:溫度31℃、接種量3.0%、pH 值7.5、轉(zhuǎn)速181 r/min。

3 討論與結(jié)論

芽孢桿菌(Bacillusspp.)是自然界廣泛存在的重要生物防治微生物資源，植物病害防治中枯草芽孢桿菌(B. subtilis)被廣泛應(yīng)用[18]。 據(jù)報(bào)道，篩選出的枯草芽孢桿菌對(duì)玉米圓斑病、煙草白粉病、水稻稻瘟病、西瓜枯萎病等植物病害均表現(xiàn)出良好的抑菌效果[19-22]。

本試驗(yàn)從花椒根系土壤中分離獲得一株對(duì)花椒根腐病病原菌腐皮鐮刀菌具有良好抑制效果的拮抗細(xì)菌，編號(hào)W-5，形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)鑒定其為枯草芽孢桿菌。 研究表明，拮抗菌W-5 對(duì)腐皮鐮刀菌的抑制率可達(dá)82.7%，體視顯微鏡下觀察其對(duì)腐皮鐮刀菌前端菌絲生長(zhǎng)起到抑制作用；結(jié)合花椒根片的離體試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，W-5 對(duì)供試5 種病原菌(禾谷鐮刀菌、梅毒鐮刀菌、藤倉(cāng)赤霉菌、松針刺盤孢菌和層生鐮刀菌)均具有良好的抑菌效果，證實(shí)其具有廣泛的抑菌活性，可以作為生防菌的優(yōu)良菌種資源開發(fā)利用。 拮抗菌W-5 胞外酶和產(chǎn)嗜鐵素能力檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明，該菌能夠很好地分泌蛋白酶和纖維素酶，且產(chǎn)嗜鐵素的能力極強(qiáng)。 生防菌的生防作用是通過(guò)生防菌產(chǎn)生胞外酶來(lái)降解病原菌的細(xì)胞壁而實(shí)現(xiàn)的[23]。微生物產(chǎn)生的嗜鐵素能夠與病原微生物競(jìng)爭(zhēng)鐵營(yíng)養(yǎng)，從而達(dá)到阻礙病原菌生長(zhǎng)即實(shí)現(xiàn)生物防治的效果[24]。 以上試驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌W-5 在花椒根腐病的防治方面具有良好的開發(fā)與應(yīng)用前景。

采用響應(yīng)面法優(yōu)化拮抗菌發(fā)酵條件能更好地挖掘其拮抗作用，優(yōu)化后的發(fā)酵體系不但能夠提高菌株活菌量，而且能使菌株產(chǎn)生更多的抑菌代謝產(chǎn)物，從而提高生防效果[25]。 本研究以O(shè)D600值作為菌株W-5 的考量指標(biāo)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)并結(jié)合響應(yīng)面法分析優(yōu)化菌株的發(fā)酵條件，得出:在綜合考慮前期試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上確定溫度31.3 ℃、pH 值7.5、接種量3.1%、轉(zhuǎn)速180.5 r/min為該菌的最佳發(fā)酵參數(shù)，在此條件下其OD600值可達(dá)1.832。 這驗(yàn)證了響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵條件優(yōu)化的可行性。 優(yōu)化后的發(fā)酵體系不但提高此菌的有效活菌數(shù)，而且從操作方面可降低發(fā)酵成本，可為菌株W-5 開發(fā)為微生物菌劑用于花椒根腐病的綠色防治提供一定的理論參考。