田鳳鳴，陳強，何九軍，王國斌，張曉娜

(1. 隴南師范高等?？茖W(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院/隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心，甘肅 隴南 742500；2. 隴南市武都區(qū)花椒服務(wù)中心，甘肅 隴南 742500)

花椒根腐病是一種危害性極強的土傳病害，嚴(yán)重時能造成椒樹死亡。 前期研究鑒定認(rèn)為，引起甘肅隴南武都花椒種植區(qū)根腐病的病原菌為腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)[1]。 隨著化學(xué)農(nóng)藥減量化防治的推廣，花椒根腐病的生物防治成為當(dāng)前研究的熱點，也是獲得一種可持續(xù)且安全有效的病害防治方案的重要選項。 拮抗菌對病原菌具有高度特異性，綠色環(huán)保是拮抗菌在防治植物病害中所具有的優(yōu)點[2]。 農(nóng)藥商業(yè)化生產(chǎn)中，越來越多的優(yōu)良微生物菌種資源被開發(fā)成生防制劑，且其防治效果受到好評。 植物病害生物防治中芽孢桿菌顯示出巨大的潛力和應(yīng)用前景[3]。

響應(yīng)面分析法現(xiàn)已成為優(yōu)化拮抗菌發(fā)酵培養(yǎng)的常用手段，該方法的特點是能節(jié)約時間和減少試驗次數(shù)，克服了單因素試驗存在的不足[4-8]。目前有關(guān)花椒根腐病拮抗菌的資源較少，優(yōu)良菌種資源更是相對匱乏，已報道的對花椒根腐病具有良好拮抗作用的菌株有淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)[9]、蠟樣芽孢桿菌[10]、綠色木霉和哈茨木霉[11]、貝萊斯芽孢桿菌T-1[12]。 本研究于2021 年以引起花椒根腐病的主要致病真菌腐皮鐮刀菌為指示菌，采用土壤平板稀釋法和平板對峙法分離獲得花椒根腐病拮抗菌W-5，繼而對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，測定其抑菌活性，并基于單因素試驗結(jié)合Box-Behnken 設(shè)計的響應(yīng)面法對菌株W-5 的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為花椒根腐病拮抗生物菌劑的開發(fā)與應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 指示菌腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)H1 和拮抗菌W-5 分別從患有花椒根腐病的花椒根部組織和根系土壤中分離獲得，保存于隴南師范高等?？茖W(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院微生物實驗室。 用于廣譜抑菌試驗的病原菌(藤倉赤霉菌、禾谷鐮刀菌、梅毒鐮刀菌、層生鐮刀菌)由江西師范大學(xué)楊慧林老師惠贈，核桃炭疽病松針刺盤孢菌由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究生魏彬惠贈。 病原菌保存于4 ℃冰箱備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 供試培養(yǎng)基如下。

PDA 培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯去皮切塊稱取200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水定容至1 L。

LB 培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，溶質(zhì)溶解后，pH 值用5.0 mol/L NaOH 調(diào)至7.0，去離子水定容至1 L。

NYBD 培養(yǎng)基(g/L):酵母浸粉5.0 g，牛肉浸粉8.0 g，葡萄糖10.0 g，調(diào)pH 值至7.5，加蒸餾水至1 L。

以上三種培養(yǎng)基均在103.4 kPa 下滅菌21 min。

1.1.3 主要試劑和儀器 胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸粉、葡萄糖、瓊脂、氫氧化鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；722N 可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；氣浴式搖床，常州高德儀器制造有限公司產(chǎn)品；立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；細(xì)菌基因組提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.2 拮抗菌的分離、篩選及鑒定

1.2.1 拮抗菌W-5 的分離 稱取花椒根系土壤1.0 g，放入100 mL 無菌三角瓶中，加入無菌水90 mL，搖床上180 r/min 培養(yǎng)30 min，靜置30 min后，取上清液并將濃度梯度稀釋至10-1～10-8。 取10-6、10-7、10-8三個濃度梯度溶液200 μL 涂布于LB 固體培養(yǎng)基中32 ℃培養(yǎng)2 d，之后挑取單菌落，編號為W-5，并將其接種于LB 液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗菌W-5 的篩選 采用平板對峙法[13]對分離出的拮抗菌W-5 進(jìn)行抑菌效果測定。 以腐皮鐮刀菌為指示菌，用打孔器將其打成直徑為6 mm 的菌餅，接種于PDA 培養(yǎng)基中心，距離中心點2 cm 處成品字形放入無菌濾紙片，取W-5 單菌落菌液10 μL 加在濾紙片上，30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，測定病原真菌菌落直徑，計算抑制率。

1.2.3 拮抗菌W-5 的分子生物學(xué)鑒定 利用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)的方法對拮抗菌W-5 進(jìn)行鑒定。 將W-5 菌株接種至LB 培養(yǎng)基上，32 ℃培養(yǎng)2 d，置于光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)，單菌落置于體視顯微鏡(放大倍數(shù)為150×)下觀察其形態(tài)，同時對其進(jìn)行革蘭氏染色[14]；分子鑒定采用細(xì)菌通用引物27F:5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇/1492R:5＇-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3＇進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。 北京六合華大基因科技有限公司完成基因測序，采用BLAST 完成測序結(jié)果的同源性分析，系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建運用MEGA 7.0 中N-J 法完成[15]。

1.3 拮抗菌W-5 對腐皮鐮刀菌前端菌絲生長影響的觀察

將1.2.2 中平板對峙法獲得的抑菌平板置于體視顯微鏡(150×)下，觀察拮抗菌W-5 對病原菌腐皮鐮刀菌前端菌絲生長的影響。

1.4 拮抗菌W-5 對病原真菌抑菌譜的檢測

以5 種病原真菌(禾谷鐮刀菌、梅毒鐮刀菌、藤倉赤霉菌、松針刺盤孢菌和層生鐮刀菌)為供試指示菌，采用平板對峙法檢測拮抗菌W-5 對各病原真菌的抑制率，其方法同1.2.2。

1.5 拮抗菌W-5 對花椒根片的離體抑菌試驗

花椒根片的離體抑菌試驗操作步驟參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。

1.6 拮抗菌W-5 產(chǎn)胞外酶的檢測及嗜鐵素培養(yǎng)基檢測

纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、蛋白酶檢測培養(yǎng)基的配制參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行，采用CAS 檢測平板進(jìn)行拮抗菌W-5 產(chǎn)嗜鐵素的檢測，其制備參照文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行。

1.7 拮抗菌W-5 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.7.1 測定繪制拮抗菌W-5 生長曲線 將拮抗菌W-5 種子液按照1%的比例接入LB 液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min 搖床上振蕩培養(yǎng)，采用可見分光光度法每間隔2 h 測定其OD600值，共測定16 個點，每個檢測點設(shè)置3 個重復(fù)，繪制其生長曲線。

1.7.2 單因素試驗篩選最佳發(fā)酵條件 前期試驗已確定拮抗菌W-5 生長的最佳培養(yǎng)基為NYBD，以此為基礎(chǔ)比較不同溫度(26、28、30、32、34 ℃)、pH 值(2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5)、接種量(1%、3%、5%、7%、9%、11%)、 轉(zhuǎn)速(140、160、180、200、220 r/min )4 個因素對拮抗菌W-5 生長的影響，以其OD600峰值為指標(biāo)確定最佳單因素發(fā)酵條件。

1.7.3 響應(yīng)面法確定最佳因素組合 在1.7.2 試驗基礎(chǔ)上，選取溫度、pH 值、轉(zhuǎn)速和接種量為自變量，以拮抗菌株W-5 發(fā)酵液OD600為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面組合試驗，以1、0、-1 表示4 個因素的高低水平進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析。 試驗因素和水平見表1。 利用Design Expert 11 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(表2)，優(yōu)化拮抗菌W-5 的最佳發(fā)酵條件。

表1 優(yōu)化拮抗菌W-5 發(fā)酵培養(yǎng)條件因素與水平的響應(yīng)面設(shè)計

表2 響應(yīng)面法設(shè)計方案和結(jié)果

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2007 對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析及作圖，響應(yīng)面結(jié)果采用Design Expert 11 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌W-5 的形態(tài)特征及革蘭氏染色結(jié)果分析

拮抗菌W-5 在LB 固體培養(yǎng)基中32 ℃培養(yǎng)2 d，于光學(xué)顯微鏡和體視顯微鏡下觀察菌落形態(tài)，結(jié)果(圖1)顯示，菌落較大為乳白色且不透明，邊緣不規(guī)則，表面粗糙且有褶皺，革蘭氏染色為陽性菌。

圖1 拮抗菌W-5 的形態(tài)特征及革蘭氏染色結(jié)果

2.2 平板透明圈法檢測拮抗菌W-5 產(chǎn)酶能力和嗜鐵素檢測

三種胞外酶檢測結(jié)果顯示，拮抗菌W-5 在蛋白酶、纖維素酶檢測培養(yǎng)基中均可產(chǎn)生較大的降解圈(圖2A、B)，而在幾丁質(zhì)酶檢測培養(yǎng)基中無降解圈產(chǎn)生。 CAS 檢測結(jié)果顯示有明顯的橙黃色嗜鐵素的螯合圈(圖2C)。

圖2 拮抗菌W-5 產(chǎn)酶培養(yǎng)基和嗜鐵素培養(yǎng)基的檢測

2.3 拮抗菌W-5 對腐皮鐮刀菌的拮抗效果及對病原菌前端菌絲生長的影響

培養(yǎng)5 d 后的腐皮鐮刀菌菌落直徑為110.0 mm (圖3A)，接種拮抗菌W-5 的病原菌菌落直徑為24.0 mm (圖3B)，抑制率高達(dá)82.7%。 體視顯微鏡下觀察拮抗菌W-5 對腐皮鐮刀菌前端菌絲生長的影響，結(jié)果顯示，未接種拮抗菌的病原菌菌絲前端呈放射狀且菌絲濃密蓬松、粗細(xì)均勻(圖3C)，接種拮抗菌W-5 的病原菌菌絲前端稀薄、扭曲成畸形，失去了延伸性(圖3D)。 以上結(jié)果說明拮抗菌W-5 對花椒根腐病病原菌腐皮鐮刀菌確有抑制作用且效果良好。

圖3 菌株W-5 對腐皮鐮刀菌的拮抗效果及對病原菌前端菌絲生長的影響

2.4 拮抗菌W-5 對病原真菌抑菌譜的檢測結(jié)果分析

為進(jìn)一步檢測拮抗菌W-5 對其他植物病原菌的抑菌活性，采用平板對峙法檢測其對5 種病原真菌的抑菌效果，結(jié)果顯示，拮抗菌W-5 對藤倉赤霉菌的抑制率為74.3%(圖4A)，對禾谷鐮刀菌的抑制率為74.6%(圖4B)，對梅毒鐮刀菌的抑制率為62.5%(圖4C)，對松針刺盤孢菌的抑制率為70.3%(圖4D)，對層生鐮刀菌的抑制率為71.4%(圖4E)。 表明拮抗菌株W-5 有較為廣泛的抑菌活性，具有一定的開發(fā)潛力。

圖4 拮抗菌W-5 對病原真菌的廣譜抑菌效果

2.5 拮抗菌W-5 離體拮抗結(jié)果分析

為再次驗證拮抗菌W-5 對花椒根腐病病原菌的抑制效果，進(jìn)行了花椒根片的離體拮抗試驗，結(jié)果表明:花椒根片在接種無菌水培養(yǎng)7 d 后依然保持原有色澤，無異味產(chǎn)生，根皮與木質(zhì)部不發(fā)生分離，根片周圍也無液體產(chǎn)生(圖5A)；培養(yǎng)3 d 后接種腐皮鐮刀菌的花椒根片則開始變軟發(fā)黑，逐漸產(chǎn)生病癥，且病原菌菌絲纏繞在花椒根片周圍，產(chǎn)生的液體使濾紙變色，根皮和木質(zhì)部發(fā)生分離，同時有臭味產(chǎn)生，且病癥與大田中典型花椒根腐病的病癥相同(圖5B)；而接種拮抗菌W-5和病原菌的花椒根片發(fā)病癥狀與圖5B 相比，發(fā)病癥狀減輕，根片顏色較淺且未出現(xiàn)變軟現(xiàn)象，根皮和根片未發(fā)生完全分離(圖5C)。 說明離體狀態(tài)下拮抗菌W-5 對花椒根腐病病原菌仍有良好的拮抗效果，與2.3 中的結(jié)果一致。

圖5 拮抗菌W-5 對花椒根片的離體拮抗作用

2.6 拮抗菌W-5 的分子生物學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

采用通用引物對拮抗菌W-5 進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果顯示:PCR 擴(kuò)增有效片段的大小為1 480 bp。 對得到的測序結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對，選取數(shù)據(jù)庫中與拮抗菌W-5 相近的15 個菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)菌株W-5 與HE659512.1 的親緣關(guān)系最近，同屬于枯草芽孢桿菌屬，結(jié)合其形態(tài)特征初步確定拮抗菌W-5 為枯草芽孢桿菌(圖6)。

圖6 基于16S rDNA 基因構(gòu)建的拮抗菌W-5 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.7 響應(yīng)面法優(yōu)化拮抗菌W-5 發(fā)酵條件的參數(shù)

2.7.1 拮抗菌W-5 生長曲線繪制與分析 菌株W-5 生長曲線(圖7)顯示，接種0 ～16 h 之間其生長速率較快，16～22 h 之間生長進(jìn)入穩(wěn)定期，22 h 后生長速率逐漸降低，故將拮抗菌W-5 的最佳生長周期確定為22 h。

圖7 拮抗菌W-5 生長曲線

2.7.2 拮抗菌W-5 單因素試驗結(jié)果分析 圖8為pH 值、溫度、接種量、轉(zhuǎn)速4 個發(fā)酵因素對拮抗菌株W-5 生長的影響結(jié)果。 pH 值在2.5～10.5之間菌株W-5生長呈現(xiàn)先快后慢的狀態(tài)；pH值在5.5～9.5 之間菌株生長良好，表明弱堿性條件下其依然具有一定的生長能力，即具有一定的耐堿性；pH 值為7.5 時其OD600達(dá)到峰值，因此確定該菌株生長的最佳pH 值為7.5。 溫度對菌株生長影響的結(jié)果顯示:26 ～34 ℃之間菌株均可生長，30 ℃為該菌的最佳生長溫度。 接種量在1%～11%之間，該菌生長良好，接種量為3%時其OD600達(dá)到峰值，因此確定3%為該菌的最佳接菌量。 搖床上轉(zhuǎn)速在140～220 r/min 之間菌株生長量呈現(xiàn)先升后降的狀態(tài)，180 r/min 時其OD600達(dá)到峰值，因此確定180 r/min 為最佳轉(zhuǎn)速。

圖8 不同發(fā)酵因素對拮抗菌株W-5 生長的影響

2.7.3 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件結(jié)果分析 響應(yīng)面法試驗設(shè)計和結(jié)果見表2。 通過響應(yīng)面法獲得的方差分析結(jié)果(表3)來研究各因素對拮抗菌W-5發(fā)酵培養(yǎng)的影響，得出的回歸模型為:

表3 響應(yīng)面試驗回歸方程方差分析

Y ＝1.94-0.0091A+ 0.0067B + 0.0168C +0.0195D+ 0. 0078AB + 0. 0257AC - 0. 0021AD +0.0544BC- 0.0217BD - 0.0516CD - 0. 2499A2-0.2650B2-0.3046C2-0.2700D2。

由該回歸方程分析及方差分析結(jié)果可知，回歸模型極顯著，說明該模型對響應(yīng)值擬合良好；除AD、AB 項未達(dá)到顯著水平外，一次項B 對拮抗菌W-5 的OD600具有顯著水平，其余一次項、二次項、交互項(AC、BC、BD 和CD)對拮抗菌W-5 的OD600都達(dá)到極顯著水平，說明其OD600的變化復(fù)雜，各試驗因素對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系。說明溫度、pH 值、接種量、轉(zhuǎn)速4 個因素對拮抗菌W-5的發(fā)酵培養(yǎng)工藝影響顯著或極顯著。 失擬度0.0601＞0.05，說明試驗點均能用該模型描述。 拮抗菌發(fā)酵培養(yǎng)工藝模型決定系數(shù)為R2＝0.9991，說明模型的相關(guān)性很好，并能較好地進(jìn)行響應(yīng)值的變化分析，確定最佳發(fā)酵條件。 經(jīng)擬合檢驗后校正系數(shù)R2adj ＝0.9983，兩者非常接近，說明拮抗菌發(fā)酵培養(yǎng)響應(yīng)面二次回歸擬合度很好。 信噪比Adeq Precision ＝104.3978＞4，說明該模型的試驗設(shè)計可靠，可信度較高，預(yù)測較為準(zhǔn)確。 F 值分析結(jié)果顯示，對拮抗菌W-5 發(fā)酵的影響程度:轉(zhuǎn)速＞接種量＞溫度＞pH 值。

響應(yīng)曲面坡度的陡峭與平緩能夠直接反映4個因素對OD600的影響，即可以直觀地反映出pH值、溫度、接種量、轉(zhuǎn)速對拮抗菌W-5 發(fā)酵培養(yǎng)的影響。 圖9 顯示，4 個因素之間的各個響應(yīng)曲面均為凸型曲面且開口朝下，代表響應(yīng)值有著極高值，而且曲面坡度都比較陡峭，說明其因子之間交互作用復(fù)雜。 各因素之間的交互作用對拮抗菌W-5 發(fā)酵培養(yǎng)的影響程度由大到小的順序為:CD＞BC＞AC＞BD＞AD，其中除AD、AB 項外，其余交互因素對拮抗菌W-5 OD600值的影響均達(dá)到極顯著水平。

圖9 菌株W-5 發(fā)酵中不同因素對OD600值影響的響應(yīng)面圖

綜合以上試驗結(jié)果，可將拮抗菌W-5 發(fā)酵培養(yǎng)的最佳條件確定為:溫度31.3 ℃、pH 值7.5、接種量3.1%、轉(zhuǎn)速180.5 r/min，優(yōu)化后的OD600值達(dá)到1.832。 考慮到生產(chǎn)實際情況及操作的便利性，將該菌的最佳發(fā)酵條件修正為:溫度31℃、接種量3.0%、pH 值7.5、轉(zhuǎn)速181 r/min。

3 討論與結(jié)論

芽孢桿菌(Bacillusspp.)是自然界廣泛存在的重要生物防治微生物資源，植物病害防治中枯草芽孢桿菌(B. subtilis)被廣泛應(yīng)用[18]。 據(jù)報道，篩選出的枯草芽孢桿菌對玉米圓斑病、煙草白粉病、水稻稻瘟病、西瓜枯萎病等植物病害均表現(xiàn)出良好的抑菌效果[19-22]。

本試驗從花椒根系土壤中分離獲得一株對花椒根腐病病原菌腐皮鐮刀菌具有良好抑制效果的拮抗細(xì)菌，編號W-5，形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)鑒定其為枯草芽孢桿菌。 研究表明，拮抗菌W-5 對腐皮鐮刀菌的抑制率可達(dá)82.7%，體視顯微鏡下觀察其對腐皮鐮刀菌前端菌絲生長起到抑制作用；結(jié)合花椒根片的離體試驗結(jié)果說明，W-5 對供試5 種病原菌(禾谷鐮刀菌、梅毒鐮刀菌、藤倉赤霉菌、松針刺盤孢菌和層生鐮刀菌)均具有良好的抑菌效果，證實其具有廣泛的抑菌活性，可以作為生防菌的優(yōu)良菌種資源開發(fā)利用。 拮抗菌W-5 胞外酶和產(chǎn)嗜鐵素能力檢測結(jié)果說明，該菌能夠很好地分泌蛋白酶和纖維素酶，且產(chǎn)嗜鐵素的能力極強。 生防菌的生防作用是通過生防菌產(chǎn)生胞外酶來降解病原菌的細(xì)胞壁而實現(xiàn)的[23]。微生物產(chǎn)生的嗜鐵素能夠與病原微生物競爭鐵營養(yǎng)，從而達(dá)到阻礙病原菌生長即實現(xiàn)生物防治的效果[24]。 以上試驗結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌W-5 在花椒根腐病的防治方面具有良好的開發(fā)與應(yīng)用前景。

采用響應(yīng)面法優(yōu)化拮抗菌發(fā)酵條件能更好地挖掘其拮抗作用，優(yōu)化后的發(fā)酵體系不但能夠提高菌株活菌量，而且能使菌株產(chǎn)生更多的抑菌代謝產(chǎn)物，從而提高生防效果[25]。 本研究以O(shè)D600值作為菌株W-5 的考量指標(biāo)，采用Box-Behnken設(shè)計并結(jié)合響應(yīng)面法分析優(yōu)化菌株的發(fā)酵條件，得出:在綜合考慮前期試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上確定溫度31.3 ℃、pH 值7.5、接種量3.1%、轉(zhuǎn)速180.5 r/min為該菌的最佳發(fā)酵參數(shù)，在此條件下其OD600值可達(dá)1.832。 這驗證了響應(yīng)面法對發(fā)酵條件優(yōu)化的可行性。 優(yōu)化后的發(fā)酵體系不但提高此菌的有效活菌數(shù)，而且從操作方面可降低發(fā)酵成本，可為菌株W-5 開發(fā)為微生物菌劑用于花椒根腐病的綠色防治提供一定的理論參考。