薛德星，李美，高興祥，李健

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山東 濟(jì)南 250100)

木霉菌(Trichodermaspp.)屬絲孢綱絲孢目叢梗孢科，廣泛分布于植物根系及有機(jī)質(zhì)土壤中[1]。 目前已報(bào)道的木霉種超過(guò)250 個(gè)，研究主要集中在哈茨木霉(T. harzianum)、里氏木霉(T.reesei)、綠色木霉(T. viride)、深綠木霉(T. atroviride)、刺孢木霉(T. asperellum)、鉤狀木霉(T.hamatum)、康氏木霉(T. koningii)等[2-4]。 木霉菌生長(zhǎng)迅速，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，依靠空間競(jìng)爭(zhēng)、重寄生和拮抗作用抑制植物病原菌侵害，特別對(duì)灰霉病菌(Botrytis cinerea)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)等具有較好的防治效果[5，6]。

重寄生作用是木霉菌進(jìn)行生物防治機(jī)制之一，通過(guò)識(shí)別、接觸、纏繞、穿透和寄生一系列連續(xù)步驟實(shí)現(xiàn)[6]。 木霉菌寄生病原菌過(guò)程中合成幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶和蛋白酶水解致病菌細(xì)胞壁，穿透細(xì)胞壁進(jìn)入病原菌體內(nèi)吸取養(yǎng)分，導(dǎo)致病原菌死亡[7-9]。 擠占病原菌生存空間和營(yíng)養(yǎng)資源競(jìng)爭(zhēng)也是木霉菌重要的生防機(jī)制[9-10]。 顧小龍等[11]研究表明，土壤中添加木霉菌劑后，作物根際的微生物種群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，細(xì)菌、放線菌數(shù)量升高，病原真菌數(shù)量下降。 2005 年，棘孢木霉在我國(guó)首次報(bào)道，該木霉菌對(duì)植物病害具有廣譜的防治效果[12]。 近年來(lái)，棘孢木霉在生物防治方面的作用引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。 李琳等[13]篩選出具有耐寒和耐鹽性的棘孢木霉菌株T31，測(cè)定了菌株T31 生長(zhǎng)和產(chǎn)孢最適條件，為木霉菌在東北地區(qū)推廣應(yīng)用提供了依據(jù)。 棘孢木霉152-42 具有耐高鹽和耐高溫的特點(diǎn)，可顯著降低草坪褐斑病的發(fā)生[14]。 鄭柯斌等[15]從海洋沉積物中分離得到棘孢木霉TCS007，其乙酸乙酯提取物對(duì)油菜菌核病菌的抑制率達(dá)96%。 棘孢木霉GYSW-6m1 對(duì)草莓炭疽病具有較好的防治效果，可顯著增加植株株高、根長(zhǎng)、總鮮重和總干重，促生率分別為7.96%、10.42%、22.54%、34.21%[16]。

本研究從羊茅草根際土壤中分離得到具有生防潛力的木霉菌GT30，通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對(duì)其進(jìn)行鑒定；采用平板對(duì)峙法研究GT30 的生防機(jī)制，并探究其生物學(xué)特征，以期為開發(fā)優(yōu)異生防菌劑提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

菌株來(lái)源:菌株GT30 分離自濟(jì)南地區(qū)羊茅草根際土壤樣本。

供試病原菌:葡萄黑霉病菌(Nigrospora sphaerica)、大蒜白斑病菌(Stemphylium eturmiunum)、葡萄炭疽病菌(Colletotrichum truncatum)、辣椒葉斑病菌(Alternaria burnsii)、西瓜褐斑病菌(Acremonium sclerotigenum)，均為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所實(shí)驗(yàn)室分離保存。

供試培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA)、葡萄糖蛋白胨酵母膏培養(yǎng)基(GPY)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)、水瓊脂培養(yǎng)基(WA)[17]。

1.2 菌株的分離篩選

稱取2 g 羊茅草根際土壤樣品加入裝有98 mL 無(wú)菌水的三角瓶中，充分振蕩混勻。 吸取1 mL上層液加入裝有9 mL 無(wú)菌水的試管中，采取10 倍稀釋法，分別吸取10-3、10-4和10-5土壤懸液1 mL，均勻涂布在含有氯霉素的PDA 培養(yǎng)基平板上，倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)5～7 d。

1.3 菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察:挑取純化的菌株接種于PDA 培養(yǎng)基平板上，倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，每天觀察菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢情況，利用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲和產(chǎn)孢器特征。

分子生物學(xué)鑒定[17-18]:采用真菌DNA 提取試劑盒提取菌株基因組DNA。 應(yīng)用引物ITS1(5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇)和ITS4(5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇) 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系(50 μL):模板DNA 2 μL，10 μmol/L 引物各2 μL，2×LATaqMasterMix 25 μL，ddH2O 19 μL。 PCR 反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min；95 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min 。 PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.4 對(duì)病原菌的拮抗作用試驗(yàn)

利用平板對(duì)峙法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)[16-17]。 取活化后直徑5 mm 的分離菌株及病原菌菌餅，與平板中心點(diǎn)呈直線等距離接種在PDA 平板上，以單獨(dú)接種病原菌作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3 次。 平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，6 d 后計(jì)算抑制率。 抑制率(%)＝(對(duì)照組平均直徑-處理組平均直徑)/對(duì)照組平均直徑×100。

覆蓋指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ級(jí)為木霉菌菌落與病原菌菌落不接觸，木霉菌絲不能覆蓋病原菌菌落；Ⅱ級(jí)為木霉菌絲覆蓋病原菌菌落1/2 以下，病原菌菌落健康，顏色無(wú)變化；Ⅲ級(jí)為木霉菌絲覆蓋病原菌菌落1/2 以上，并在病原菌菌落上大量產(chǎn)孢，病原菌菌落萎縮。

1.5 菌株的生物學(xué)特性

1.5.1 溫度對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 將直徑為5 mm 菌餅接種于PDA 培養(yǎng)基上，置于20、25、30、35 ℃恒溫箱培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3 次。2 d 后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，6 d 后利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子數(shù)[19]。

1.5.2 光照對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 將直徑為5 mm 菌餅接種于PDA 培養(yǎng)基上，設(shè)置全光照、12 h 光照/12 h 黑暗和全黑暗培養(yǎng)條件，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次。 檢測(cè)方法同1.5.1。

1.5.3 pH 值對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 用1 mol/L 的HCl 和NaOH 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH 值為4、5、6、7、8、9，將直徑為5 mm 菌餅接種于PDA 培養(yǎng)基上。 培養(yǎng)方法同1.5.2。 檢測(cè)方法同1.5.1。

1.5.4 培養(yǎng)基對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響配置馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨酵母膏培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和水瓊脂培養(yǎng)基，將直徑為5 mm 菌餅接種于培養(yǎng)基上。 培養(yǎng)方法同1.5.2。 檢測(cè)方法同1.5.1。

1.5.5 碳源對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 選擇葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、木糖和果糖作為供試碳源，PDA 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其他碳源同質(zhì)量替換葡萄糖，將直徑為5 mm 菌餅接種于不同碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上。 培養(yǎng)方法同1.5.2。 檢測(cè)方法同1.5.1。

1.5.6 氮源對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 選擇硝酸鉀、硫酸銨、蛋白胨和牛肉膏作為供試氮源，20 g/L 葡萄糖作為碳源，每升培養(yǎng)基添加5 g氮源，將直徑為5 mm 棘孢木霉菌餅接種于不同碳源的培養(yǎng)基上。 培養(yǎng)方法同1.5.2。 檢測(cè)方法同1.5.1。

1.5.7 金屬離子對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響將FDA 培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加0.5 g/L 的MgSO4、CaSO4、FeSO4，以不加任何金屬無(wú)機(jī)鹽作為對(duì)照。 將直徑為5 mm 菌餅接種于不同金屬無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上。 培養(yǎng)方法同1.5.2。 檢測(cè)方法同1.5.1。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行方差分析，多重比較采用Duncan’s 法(P＜0.05)。ITS-rDNA 基因測(cè)序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行核酸序列比對(duì)，利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株GT30 的鑒定

2.1.1 菌株GT30 的形態(tài)學(xué)鑒定 菌株GT30 在PDA 平板上生長(zhǎng)較快，培養(yǎng)3 d 菌落長(zhǎng)滿9 cm 的PDA 培養(yǎng)皿，氣生菌絲呈氈毛狀，初期菌絲為白色，后期菌絲產(chǎn)生深綠同心圓并向周圍擴(kuò)展(圖1A)；孢子梗對(duì)生生長(zhǎng)，主分支呈樹狀，瓶梗呈安培瓶狀且中部膨大(圖1B)；分生孢子為單孢，球形或卵形，外壁光滑，直徑2～4 μm(圖1C)。

圖1 菌株GT30 的形態(tài)特征

2.1.2 菌株GT30 的分子生物學(xué)鑒定 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，片段長(zhǎng)度為601 bp。 在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，菌株GT30 與棘孢木霉親緣關(guān)系最近，同源性為99.32%。 系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示菌株GT30 與棘孢木霉處于同一分支(圖2)。 通過(guò)菌株形態(tài)特征及ITS-rDNA 基因序列分析，將菌株GT30 鑒定為棘孢木霉。

圖2 基于ITS-rDNA 序列構(gòu)建菌株GT30 的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌株GT30 對(duì)病原菌的競(jìng)爭(zhēng)和寄生作用

平板對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株GT30 菌落生長(zhǎng)很快，能夠迅速占領(lǐng)營(yíng)養(yǎng)空間，導(dǎo)致病原菌生長(zhǎng)受到抑制(圖3)。 菌株GT30 對(duì)大蒜白斑病菌、葡萄炭疽病菌、辣椒葉斑病菌、葡萄黑霉病菌和西瓜褐斑病菌的抑菌率分別為63.7%、61.4%、56.6%、56.3%和32.5%(表1)，對(duì)大蒜白斑病菌和葡萄炭疽病菌具有較好的抑制效果。 菌株GT30 菌絲對(duì)大蒜白斑病菌、葡萄炭疽病菌、葡萄黑霉病菌的覆蓋指數(shù)為Ⅱ級(jí)。

表1 菌株GT30 對(duì)病原菌的抑制率和覆蓋指數(shù)

圖3 菌株GT30 對(duì)病原菌的抑制作用

2.3 棘孢木霉的生物學(xué)特性

2.3.1 溫度對(duì)菌株GT30 菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響菌株GT30 能夠在20 ～35 ℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)。 在30 ℃條件下生長(zhǎng)最快，菌落直徑達(dá)3.70 cm；在20、25、35 ℃條件下菌落直徑分別為2.77、3.41、2.70 cm。 培養(yǎng)6 d 后，25 ℃條件下GT30 產(chǎn)孢量最多，高達(dá)25.3×106個(gè)/mL；在20、30、35 ℃條件下產(chǎn)孢量分別為18.9×106、23.3×106、7.1×106個(gè)/mL(表2)。

表2 溫度對(duì)菌株GT30 菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

2.3.2 光照對(duì)菌株GT30 菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響菌株GT30 能夠在全光照、12 h 光照/12 h 黑暗和全黑暗培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)。 培養(yǎng)2 d 后，12 h 光照/12 h 黑暗處理的GT30 菌絲生長(zhǎng)最快。 培養(yǎng)6 d 后，全光照處理的GT30 產(chǎn)孢量最多，高達(dá)16.8×107個(gè)/mL(表3)。

表3 光照對(duì)菌株GT30 菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

2.3.3 pH 值對(duì)菌株GT30 菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 菌株GT30 在pH 值4 ～9 范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，在pH＝5 條件下生長(zhǎng)最快，菌落直徑達(dá)4.43 cm。GT30 在pH＝6 條件下產(chǎn)孢量最多，高達(dá)2.25×107個(gè)/mL，在pH 值為4、5、7、8、9 時(shí)產(chǎn)孢量分別為10.2×106、15.9×106、8.3×106、7.3×106、5.9×106個(gè)/mL(表4)。

表4 pH 值對(duì)菌株GT30 菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

2.3.4 培養(yǎng)基對(duì)菌株GT30 菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 菌株GT30 能夠在GPY、PSA、PDA 和NA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，培養(yǎng)2 d 后，GPY 培養(yǎng)基上的GT30菌絲生長(zhǎng)最快，菌落直徑達(dá)5.11 cm，PSA、PDA 和NA 培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)相對(duì)較慢。 培養(yǎng)6 d 后，GPY 培養(yǎng)基上GT30 產(chǎn)孢量最多，高達(dá)69.3×106個(gè)/mL。 GT30 菌株在WA 培養(yǎng)基上幾乎不生長(zhǎng)、不產(chǎn)孢(表5)。

2.3.5 碳源對(duì)菌株GT30 菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響菌株GT30 在6 種碳源培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，其中以葡萄糖為碳源時(shí)GT30 菌落直徑達(dá)4.37 cm，產(chǎn)孢量為1.91×107個(gè)/mL。 以果糖、蔗糖、乳糖、木糖和麥芽糖為碳源時(shí)，菌落直徑分別為3.48、3.41、3.14、3.35、3.79 cm，產(chǎn)孢量分別為2.17×107、2.03×107、1.02×107、1.86×107、1.77×107個(gè)/mL。菌株GT30 在無(wú)糖培養(yǎng)基上幾乎不生長(zhǎng)、不產(chǎn)孢(表6)。

2.3.6 氮源對(duì)菌株GT30 菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響菌株GT30 在4 種氮源培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，其中以牛肉膏為氮源時(shí)GT30 菌絲生長(zhǎng)最快，產(chǎn)孢最多，菌落直徑和產(chǎn)孢量分別為4.22 cm 和2.49×107個(gè)/mL。 以蛋白胨、硫酸銨和硝酸鉀為氮源時(shí)，菌落直徑分別為3.54、2.74、2.24 cm，產(chǎn)孢量分別為12.4×106、4.3×106、1.4×106個(gè)/mL。 菌株GT30 在無(wú)氮源培養(yǎng)基上幾乎不生長(zhǎng)、不產(chǎn)孢(表7)。

表7 氮源對(duì)菌株GT30 菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

2.3.7 金屬離子對(duì)菌株GT30 菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 菌株GT30 在含有Fe2+、Mg2+和Ca2+離子的培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，其中在含有Mg2+、Ca2+離子的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)較快，菌落直徑分別為4.93 cm和4.74 cm，產(chǎn)孢量分別為4.6×106個(gè)/mL 和3.9×106個(gè)/mL。 在含有Fe2+離子的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，菌落直徑為1.29 cm，產(chǎn)孢量為6.7×103個(gè)/mL(表8)。

表8 金屬離子氮源對(duì)菌株GT30菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

3 討論與結(jié)論

木霉菌已成為防治植物病害的主要生防菌種，對(duì)18 屬29 種植物病原菌具有顯著抑制作用[15]。 眾多研究表明木霉菌的生防機(jī)制包括競(jìng)爭(zhēng)作用、重寄生、抗生作用、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物抑制病原菌，同時(shí)還能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育[20]。 本研究從羊茅草根際土壤中分離得到一株生防木霉菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，確定菌株GT30 為棘孢木霉。 重寄生作用是木霉菌重要的生防機(jī)制之一，木霉菌通過(guò)識(shí)別病原菌的凝集素，對(duì)病原菌進(jìn)行識(shí)別、接觸、纏繞、穿透、寄生和溶解，最終導(dǎo)致病原菌死亡[6]。 平板對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株GT30 能夠寄生葡萄黑霉病菌、葡萄炭疽病菌和大蒜白斑病菌，GT30 菌絲的覆蓋指數(shù)為Ⅱ級(jí)。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于木霉菌生物學(xué)特性研究很多，本研究開展了溫度、光照、pH 值、培養(yǎng)基、碳源、氮源和金屬離子對(duì)菌株GT30 菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響，發(fā)現(xiàn)25～30 ℃適宜GT30 菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢；全光照培養(yǎng)條件有利于菌株GT30 產(chǎn)孢；在pH 值為5～6 范圍內(nèi)適宜GT30 菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢；GPY 培養(yǎng)基上的GT30 菌絲生長(zhǎng)最快，產(chǎn)孢量最多；葡萄糖和牛肉膏分別是菌株GT30 生長(zhǎng)所需最佳碳源和氮源；Mg2+和Ca2+離子能夠促進(jìn)菌株GT30 菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢。 本研究結(jié)果可為開發(fā)優(yōu)異生防木霉菌劑提供菌種資源和理論基礎(chǔ)。