肖波,方娟,張遠(yuǎn)遠(yuǎn),王燕,吳利榮

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是妊娠期間出現(xiàn)的代謝紊亂疾病[1]。GDM的危險(xiǎn)因素包括肥胖、既往糖尿病史、2型糖尿病家族史和遺傳等因素[2]。在妊娠晚期,血糖水平急劇升高[3]。但當(dāng)前缺乏早期預(yù)測和診斷GDM的分子標(biāo)志物,因此,研究GDM相關(guān)的生物指標(biāo),對提高GDM的診斷具有重要意義。在GDM患者血清中發(fā)現(xiàn)了大量失調(diào)的circRNA[4]。研究表明,環(huán)狀RNA叉頭框蛋白P1(circrna forkhead frame protein P1,circFOXP1)是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子,在調(diào)節(jié)全身葡萄糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用[5]。糖尿病小鼠的肝臟circFOXP1表達(dá)水平降低[6]。circMAP3K4在GDM患者的胎盤中高表達(dá),其表達(dá)與孕期母體體質(zhì)量增加和口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tole-rance test,OGTT)時(shí)間—血糖曲線的曲線下面積(AUC)呈正相關(guān)。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,circMAP3K4可以通過miR-6795-5p/PTPN1軸調(diào)節(jié)胰島素-PI3K/Akt通路[7]。目前,對于circFOXP1和circMAP3K4基因表達(dá)在GDM患者的研究甚少,因此,本研究旨在研究GDM患者血清中circFOXP1和circMAP3K4基因表達(dá)狀況,以期為GDM的診斷提供新的診斷標(biāo)志物,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2021年11月—2022年11月武漢科技大學(xué)附屬漢陽醫(yī)院婦產(chǎn)科收治GDM患者128例為GDM組,同期選擇在醫(yī)院孕檢的健康孕婦128例為對照組,2組人員年齡、孕周、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、產(chǎn)次、總膽固醇(TC)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與對照組比較,GDM組三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)水平顯著升高,高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平顯著降低(P<0.01),見表1。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2021001026),受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

表1 對照組與GDM組孕婦臨床資料比較

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①符合《妊娠合并糖尿病診治指南(2014版)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8];②首次確診為GDM者。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①患有糖尿病、高血壓的患者;②患有惡性腫瘤的患者；③免疫性疾病者;④精神異常無法進(jìn)行正常交流的患者。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 血脂血糖檢測:孕婦入組當(dāng)天抽取空腹肘靜脈血10 ml,離心留取血清放置于-20℃待用。血清5 ml用于檢測TC、TG、LDL-C、HDL-C、FPG、FINS水平。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測TC(上海酶研生物科技有限公司)、TG(上?；钌锟萍加邢薰?、LDL-C(上?；钌锟萍加邢薰?、HDL-C(上海恒斐生物科技有限公司)、FINS(上海西格生物科技有限公司)水平,采用葡萄糖氧化酶法測量血糖水平,試劑盒購自于北京索萊寶科技有限公司。

1.3.2 血清circFOXP1和circMAP3K4基因檢測:上述剩余血清5 ml,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測血清circFOXP1和circMAP3K4基因表達(dá),提取血清總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海吉至生化科技有限公司)合成cDNA。使用熒光定量PCR儀(型號Rotor-Gene Q,QIAGEN)和qPCR試劑盒(江西艾博因生物科技有限公司)進(jìn)行circFOXP1和circMAP3K4基因表達(dá)檢測,反應(yīng)體系共20 μl:2 × Probe qPCRFast Mix反應(yīng)酶 10 μl,cDNA 1 μl,上下引物各1 μl,ddH2O 7 μl。反應(yīng)條件:93℃ 90 s、93℃ 30 s、59℃ 30 s、72℃ 15 s,共計(jì)40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)重復(fù)3次,嚴(yán)格遵循試劑盒說明書進(jìn)行。采用2-△△CT法分析結(jié)果。qPCR引物由南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行合成,引物序列見表2。

表2 血清circFOXP1和circMAP3K4引物序列

2 結(jié) 果

2.1 2組血清circFOXP1和circMAP3K4基因表達(dá)比較 與對照組比較,GDM組患者血清circFOXP1表達(dá)顯著降低,circMAP3K4表達(dá)顯著升高(P<0.05),見表3。

表3 對照組與GDM組血清circFOXP1和circMAP3K4基因表達(dá)水平比較

2.2 GDM患者血清circFOXP1與circMAP3K4表達(dá)的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示,GDM患者血清circFOXP1和circMAP3K4表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.302,P=0.001)。

2.3 ROC曲線分析血清circFOXP1和circMAP3K4表達(dá)診斷GDM的價(jià)值 繪制血清circFOXP1和circMAP3K4表達(dá)診斷GDM的ROC曲線,并計(jì)算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示,血清circFOXP1、circMAP3K4及二者聯(lián)合診斷GDM發(fā)生的AUC分別為0.873、0.842、0.931,二者聯(lián)合優(yōu)于各自單獨(dú)診斷(Z/P=2.207/<0.001,2.029/0.023),見表4、圖1。

圖1 血清circFOXP1和circMAP3K4對GDM診斷的ROC曲線

表4 血清circFOXP1和circMAP3K4診斷GDM的價(jià)值比較

2.4 Logistic回歸分析影響GDM發(fā)生的危險(xiǎn)因素 以GDM是否發(fā)生為因變量(發(fā)生=1,未發(fā)生=0),以上述結(jié)果中P<0.05項(xiàng)目(TG、LDL-C、HDL-C、FPG、FINS、circFOXP1、circMAP3K4水平)為自變量,進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,FPG高、circFOXP1低表達(dá)和circMAP3K4高表達(dá)為GDM發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P<0.01),見表5。

表5 Logistic回歸分析影響GDM發(fā)生的危險(xiǎn)因素

3 討 論

GDM是指妊娠前糖代謝正常,但妊娠期孕婦體內(nèi)的糖耐量水平受損及空腹血糖水平升高[9]。隨著人類生活水平提高以及飲食的變化,GDM的發(fā)病率逐年增加[10]。在懷孕期間，發(fā)生不良妊娠的風(fēng)險(xiǎn)幾率增加,對所有待產(chǎn)孕婦及新生兒的生命健康造成嚴(yán)重威脅[11]。早期對GDM進(jìn)行診斷能夠盡早改善孕婦的妊娠過程,因此尋找GDM診斷相關(guān)的指標(biāo)具有重要的臨床價(jià)值。

circRNA是近期發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼RNA,研究發(fā)現(xiàn)circRNA在基因表達(dá)的調(diào)控中起著重要作用,在臨床診斷和治療中可作為潛在的生物指標(biāo)[12]。circRNA參與調(diào)節(jié)糖尿病患者胰島素的分泌[13]。circFOXP1已成為胰島素和生長因子作用的重要靶標(biāo),其在細(xì)胞生長、分化和應(yīng)激反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[14]。circFOXP1在人體組織中廣泛表達(dá)并調(diào)節(jié)許多組織的發(fā)育,包括心臟、胸腺和肺[15]。circFOXP1缺陷胚胎在心臟形態(tài)發(fā)生方面存在嚴(yán)重缺陷,包括流出道分隔和墊層缺陷,導(dǎo)致胚胎死亡[16]。本次研究表明,與對照組比較,GDM組患者血清中circFOXP1水平顯著降低,推測在GDM的發(fā)展中,circFOXP1可能起調(diào)控作用,表明circFOXP1可能參與了GDM的發(fā)生進(jìn)程。ROC曲線結(jié)果表明,circFOXP1診斷GDM發(fā)生的AUC為0.873,敏感度為0.825,特異度為0.778,表明circFOXP1對GDM的診斷有一定的效能,有成為診斷GDM發(fā)生的潛力。多因素分析結(jié)果顯示,circFOXP1低表達(dá)為GDM發(fā)生的危險(xiǎn)因素,進(jìn)一步說明circFOXP1可能成為診斷GDM發(fā)生的生物標(biāo)志物。

除胎盤外,circMAP3K4在幾種胰島素靶向組織中也表達(dá)豐富,如骨骼肌、肝臟和心臟[17]。circMAP6K3的m4A修飾可以影響其二級結(jié)構(gòu)剪接、降解或分子穩(wěn)定性,從而影響其表達(dá)[18]。有研究結(jié)果表明,circMAP3K4參與妊娠期間葡萄糖代謝過程,發(fā)現(xiàn)circMAP3K4在GDM患者的胎盤組織中高表達(dá)[7,19]。研究表明,circMAP3K4在參與調(diào)節(jié)母體葡萄糖代謝的過程中,會進(jìn)一步影響胎盤的表觀遺傳變化[20]。本次研究表明,GDM組患者血清中circMAP3K4水平顯著高于對照組,與以往研究結(jié)果一致[19],表明circMAP3K4在GDM患者血清中高表達(dá),在一定范圍內(nèi)影響葡萄糖的代謝過程。ROC曲線分析結(jié)果顯示,circMAP3K4診斷GDM發(fā)生的AUC為0.842,敏感度為0.854,特異度為0.745,提示circMAP3K4的水平對GDM具有一定的診斷效能;多因素分析結(jié)果顯示,circMAP3K4高表達(dá)為GDM發(fā)生的危險(xiǎn)因素,提示circMAP3K4可能參與GDM的發(fā)生及進(jìn)展,有望成為新的診斷GDM的潛在靶點(diǎn)。

相關(guān)性分析顯示,GDM患者血清circFOXP1與circMAP3K4基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),表明二者共同參與GDM的發(fā)生,從而影響到GDM患者的糖代謝穩(wěn)態(tài)。二者聯(lián)合診斷GDM的AUC高于血清circFOXP1和circMAP3K4單獨(dú)診斷的AUC值,表明二者聯(lián)合診斷價(jià)值優(yōu)于單一指標(biāo)檢測的診斷價(jià)值,能夠提高GDM的診斷效能。

綜上所述,在GDM患者血清中circFOXP1呈低表達(dá),circMAP3K4呈高表達(dá),二者是GDM發(fā)生的危險(xiǎn)因素,可以作為早期GDM診斷的生物標(biāo)志物。但本次研究數(shù)量較少,GDM的發(fā)生過程較為復(fù)雜,后續(xù)將擴(kuò)大樣本數(shù)量及延長研究時(shí)間,為GDM的研究提供可靠的臨床數(shù)據(jù)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

肖波、方娟:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù);張遠(yuǎn)遠(yuǎn):資料搜集整理,論文撰寫,論文修改;王燕:設(shè)計(jì)研究方案,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù);吳利榮:資料搜集整理,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,論文修改