王永亮 ,吳晨瑞 ,薛曉蓉,孫晉鑫,劉曉林,楊治平,張 強(qiáng),白 炬

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)/土壤環(huán)境與養(yǎng)分資源山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 太原 030031)

隨著城市人口的迅速增加,生活污泥的排放量日益增多。根據(jù)歐盟統(tǒng)計(jì)局的數(shù)據(jù),農(nóng)業(yè)利用是歐盟國(guó)家最普遍的污泥處置方式之一,高于我國(guó)17.95%～28.71%[1]。在美國(guó),約有50%左右的污泥通過好氧發(fā)酵、厭氧消化等多種方式進(jìn)行處理,最終變成肥料進(jìn)行資源化利用[2]。然而,我國(guó)生活污泥處理主要集中在工業(yè)方面,如厭氧消化產(chǎn)生沼氣、低溫?zé)峤馍a(chǎn)燃油、氣化生產(chǎn)可燃?xì)怏w,但該處理方法易產(chǎn)生有毒物質(zhì)[3]。目前,為了資源回收和持續(xù)發(fā)展,可從污泥中提取含氮化合物來促進(jìn)葉菜類作物對(duì)養(yǎng)分的吸收[4-5],而這些化合物是促進(jìn)植物生長(zhǎng)的關(guān)鍵成分,通常以蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物(如肽、氨基酸、氨等)存在[6]。而在農(nóng)業(yè)應(yīng)用實(shí)踐中,因污泥含有易腐爛有機(jī)物、病原微生物和重金屬,不宜直接施用[7-8]。污泥通過熱堿水解生產(chǎn)的一種富含多肽、蛋白質(zhì)、氨基酸的熱堿液,不僅可以用于提取氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),還可以有效避免施入土壤后造成重金屬元素的累積[9],但其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用還鮮有研究。該熱堿液用于農(nóng)業(yè)中,是否可以促進(jìn)作物的生長(zhǎng)發(fā)育還有待進(jìn)一步的研究。

蔬菜作為生活必需品,為人體提供所需的氨基酸和維生素等營(yíng)養(yǎng)元素。氮素是植物體內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的主要組成元素,在作物體內(nèi)發(fā)揮不可替代的作用。為追求高產(chǎn),設(shè)施菜田化肥過量現(xiàn)象嚴(yán)重,引起土壤質(zhì)量退化,蔬菜品質(zhì)降低,硝酸鹽含量升高。研究表明,氨基酸肥料與氮肥配合施用可以有效解決這一問題,合理的施肥結(jié)構(gòu)可促進(jìn)葉菜類作物的生長(zhǎng)和品質(zhì)[10-11],而與化肥相比,氨基酸肥料可提高蔬菜作物的養(yǎng)分利用效率,提高產(chǎn)量和品質(zhì),并降低農(nóng)藥成本,保護(hù)環(huán)境[12];同時(shí)氨基酸水溶性肥料中大部分的氮素都是水溶性的,很容易被植物所吸收利用[13];氨基酸是蛋白質(zhì)合成過程中的基本成分,同時(shí)可影響植株相關(guān)代謝過程[14]。小青菜(Brassica chinensis)作為葉菜類植株中的代表性作物,具有生長(zhǎng)快、生長(zhǎng)期短、復(fù)種指數(shù)高等特點(diǎn),因此需氮量大[15]。而熱堿液中富含豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽類成分,其中含有大量的氮素,但對(duì)葉菜類氮素轉(zhuǎn)化相關(guān)酶活性影響及氮素養(yǎng)分吸收和品質(zhì)形成尚不清楚。為此,探究熱堿液對(duì)作物氮素吸收、同化和利用及品質(zhì)形成等影響對(duì)污泥的無害化利用與作物高產(chǎn)、農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展尤為重要。

本研究以小青菜為試材,采用溫室盆栽試驗(yàn),設(shè)置不同的熱堿液施用量處理,以不施氮肥為對(duì)照,通過對(duì)小青菜中氮素循環(huán)相關(guān)酶活性及品質(zhì)、產(chǎn)量的測(cè)定,明確熱堿液對(duì)葉菜類作物中氮的吸收利用機(jī)制,為污泥無害化利用、資源化處理及化肥減施增效、農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

本試驗(yàn)在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)龍城校區(qū)溫室(37°46′40″N,112°34′43″E)中進(jìn)行,供試盆栽土壤采集于太原市清徐縣專業(yè)種植合作社菜園(37°36′14″N,112°20′44″E),該地區(qū)有5 年的蔬菜種植史,主要以種植小白菜(Brassica campestrisssp.chinensis)為主;屬于溫帶大陸性氣候,年平均氣溫為10.2～10.6 ℃,年均降水量為500 mm 左右;土壤類型為砂質(zhì)壤土,基礎(chǔ)理化性狀為: 全氮0.125 g·kg-1、有效磷8.56 mg·kg-1、速效鉀136.00 mg·kg-1、有機(jī)質(zhì)14.85 g·kg-1、pH 7.85。

供試蔬菜為小青菜,品種為‘夏多美’(北京農(nóng)種公司)。氮肥為尿素(含N 46%)、磷肥為過磷酸鈣(含P2O516%)、鉀肥為硫酸鉀(含K2O 50%)。本研究委托山西晉聯(lián)環(huán)科科技有限公司通過在pH=13、溫度為140 ℃、污泥含水率為91%和時(shí)間為3 h 的條件下將污泥放入高壓反應(yīng)釜中,加入一定量的去離子水調(diào)節(jié)其含水率并攪拌均勻,用CaO 粉末調(diào)節(jié)pH,設(shè)定反應(yīng)溫度,進(jìn)行攪拌,當(dāng)釜內(nèi)溫度達(dá)到設(shè)定溫度后開始計(jì)時(shí),之后分離濃縮,進(jìn)行熱堿液的制備[16],施用前將其pH 調(diào)至中性。其中主要成分如表1 所示,且重金屬含量遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)肥料中有毒有害物質(zhì)的限量要求》(GB 38400-2019)與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)含氨基酸水溶肥料》(NY 1429-2010)。

表1 熱堿液的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of alkaline thermal hydrolysis liquid

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

本試驗(yàn)設(shè)6 個(gè)處理,分別為施用0 kg·hm-2、52.5 kg·hm-2、105 kg·hm-2、157.5 kg·hm-2、210 kg·hm-2的熱堿液,用0～20 cm 土層、土壤容重為1.3 g·cm-3換算對(duì)應(yīng)盆栽熱堿液的施用量: 0 mg·kg-1(T1)、20.19 mg·kg-1(T2)、40.38 mg·kg-1(T3)、60.57 mg·kg-1(T4)、80.76 mg·kg-1(T5),以不施氮肥(CK)為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)9 次,共54 盆。

塑料盆規(guī)格為內(nèi)徑21.5 cm、高15 cm,每盆裝填供試土壤2.5 kg,除CK 處理不施用氮肥外,其余各處理施用基肥(N 為120 mg·kg-1,P2O5為 100 mg·kg-1,K2O 為 150 mg·kg-1),平衡3 d 后灌水,水分入滲均勻后再播種,每盆播12 粒種子,待幼苗長(zhǎng)出3 片真葉后進(jìn)行間苗,每盆留苗3 株,每日進(jìn)行稱重后澆水,使土壤孔隙含水量(WFPS)保持在60%。定苗后每隔7 d追施一次熱堿液(用檸檬酸調(diào)至中性后施用),CK 處理澆等量水,共6 次。

定苗后每隔兩周每個(gè)處理選擇3 個(gè)重復(fù),采集每盆地上部植株,到收獲共取樣3 次。在2021 年8 月10 日播種,于2021 年9 月26 日采收。試驗(yàn)期間的平均溫度為(25±5) ℃,所有植株在病蟲害防治方面的處理方式相同。

1.2 常規(guī)指標(biāo)測(cè)定

小青菜每次樣品采收后稱樣品鮮重為產(chǎn)量,部分樣品105 ℃下殺青30 min,70 ℃下烘干至恒重后稱干重為生物量;粉碎過60 目篩(孔徑0.25 mm)后,用Kjeldahl 法測(cè)定植株全氮含量和品質(zhì)。剩余樣品保存至-80 ℃環(huán)境中,用于酶活性測(cè)定。葉片SPAD值的測(cè)定采用 SPAD-502 儀在收獲期上午10:00 對(duì)小青菜綠葉部分進(jìn)行測(cè)定[17]。

1.3 小青菜品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

可溶性糖用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定,可溶性蛋白用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定,維生素C 含量用2,6-二氯靛酚滴定法測(cè)定,硝酸鹽含量用水楊酸比色法測(cè)定[18]。

1.4 氮素吸收轉(zhuǎn)化相關(guān)酶活性測(cè)定

采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定硝酸還原酶(NR)、亞硝酸還原酶(NiR)、谷氨酸脫氫酶(GDH)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合成酶(GOGAT)活性。分別稱取0.1 g 小青菜鮮樣樣本,加入1 mL 提取液,冰浴研磨,離心后提取上清液于96 孔UV 板中,加入其余試劑,在不同吸光度條件下用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。NR、GDH、GOGAT、GS 試劑盒購買于北京索萊寶生物有限公司,NiR 試劑盒購買于上海酶聯(lián)生物有限公司。詳細(xì)檢測(cè)方法參照說明書執(zhí)行。

1.5 參數(shù)計(jì)算及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行方差分析。在P＜0.05水平下,均值以最小顯著性差異法進(jìn)行檢驗(yàn),用Excel 進(jìn)行線性加平臺(tái)擬合,采用Origin 2018 進(jìn)行作圖,用Correlation Plot 進(jìn)行相關(guān)性分析,用Canoco 5 軟件進(jìn)行冗余分析(RDA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同熱堿液施用量對(duì)小青菜氮素養(yǎng)分吸收和SPAD、產(chǎn)量的影響

小青菜氮素累積量在整個(gè)生育期內(nèi)呈升高趨勢(shì)(圖1A),在整個(gè)生育期前兩周增加速率較后兩周明顯較高,其中T3、T4 處理在整個(gè)生育期內(nèi)均保持較高水平,且高于CK 處理。

圖1 不同熱堿液施用量對(duì)各時(shí)期小青菜氮素累積量(A)、干生物量(B)的影響Fig.1 Effects of different alkaline thermal hydrolysis liquid treatments on nitrogen accumulation (A) and dry biomass (B) of Brassica chinensis in different periods

小青菜生物量在整個(gè)生育期內(nèi)呈升高趨勢(shì)(圖1B),各施用熱堿液處理較CK 均能明顯提高生物量,且與其他施用熱堿液處理相比,T3 處理在整個(gè)生育期內(nèi)保持較高水平,3 次采樣分別高2.36%～56.63%、7.61%～63.68%和1.26%～69.47%,并且提高小青菜前期的生長(zhǎng)發(fā)育速率,加快作物生長(zhǎng)。

隨著熱堿液施用量的增加,SPAD 值呈先升高后穩(wěn)定的趨勢(shì)(表2),且熱堿液各處理之間均未達(dá)到顯著差異。與CK 相比,不同熱堿液施用處理小青菜產(chǎn)量、氮素累積量均有所提高(表2),分別增加26.40%～70.74%和41.72%～88.10%;隨著熱堿液施用量的增加呈先升高后降低的趨勢(shì),在T3 處理中達(dá)最大值。隨著熱堿液施用量的增加,氮素吸收率及氮素利用率均呈先增加后降低的趨勢(shì)(表2),在T3 處理中,氮素吸收率、氮素利用率達(dá)到峰值,比其他處理分別增加0.72%～32.73%和1.51%～33.45%,說明當(dāng)熱堿液施用量為40.38 mg·kg-1時(shí),熱堿液對(duì)小青菜氮素的吸收利用具有顯著效果。

表2 不同熱堿液施用量處理對(duì)小青菜氮素吸收利用的影響Table 2 Effects of different alkaline thermal hydrolysis liquid treatments on nitrogen absorption,utilization of Brassica chinensis

2.2 適宜熱堿液施用量分析

根據(jù)本研究數(shù)據(jù),進(jìn)行熱堿液施用量分析。對(duì)小青菜氮素累積量(Y)和熱堿液施用量(X)進(jìn)行二次項(xiàng)及線性加平臺(tái)擬合,小青菜氮素吸收量的二次項(xiàng)擬合方程為Y=-0.0027X2+0.656X+118.88 (R2=0.997)(圖2A),優(yōu)于線性加平臺(tái)擬合(R2=0.789) (圖2C),解析方程得出熱堿液施用量為121.48 kg·hm-2時(shí),氮素累積量最高,達(dá)158.73 mg·株-1。當(dāng)施用量從0 kg·hm-2增加到121.48 kg·hm-2時(shí),氮素累積量也隨之增加,之后隨著熱堿液施用量的增加,小青菜氮素累積量逐漸降低。

圖2 不同熱堿液施用量對(duì)小青菜氮素累積量、產(chǎn)量影響二次項(xiàng)擬合(A,B)和線性加平臺(tái)擬合(C,D)Fig.2 Quadratic term fitting (A,B) and linear plus platform fitting (C,D) of effects of application rates of alkaline thermal hydrolysis liquid on nitrogen accumulation and yield of Brassica chinensis

通過對(duì)小青菜產(chǎn)量(Y)和熱堿液施用量(X)進(jìn)行二次項(xiàng)及線性加平臺(tái)擬合,小青菜產(chǎn)量的二次項(xiàng)擬合方程為Y=-0.0011X2+0.2807X+51.379 (R2=0.998) (圖2B),優(yōu)于線性加平臺(tái)擬合(R2=0.894) (圖2D),解析方程得出熱堿液施用量為127.59 kg·hm-2時(shí),小青菜產(chǎn)量最高,達(dá)69.29 g·株-1。當(dāng)熱堿液施用量從0 kg·hm-2增加到127.59 kg·hm-2時(shí),產(chǎn)量也隨之增加,之后隨著施用量的增加,小青菜產(chǎn)量逐漸降低。說明適宜的熱堿液施用量可以提高小青菜產(chǎn)量,當(dāng)施用量超過一定閾值后,反而會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量的降低,符合報(bào)酬遞減規(guī)律。

2.3 不同熱堿液施用量對(duì)小青菜品質(zhì)的影響

小青菜品質(zhì)相關(guān)的各項(xiàng)指標(biāo),隨著熱堿液施用量的升高均呈先升高后下降的趨勢(shì)(硝酸鹽除外)。可溶性蛋白、可溶性糖和維生素C 含量的最高值均在T3 處理,分別為10.48 mg·g-1、8.08 mg·g-1和45.90 mg·kg-1(表3)。其中,T3 處理可溶性蛋白含量較CK、T1 處理分別增加61.73%和31.16%,差異達(dá)顯著水平(P＜0.05);可溶性糖含量較CK、T5 處理分別顯著增加74.14%、55.38% (P＜0.05);維生素C 含量較CK、T1 和T2 分別增加38.34%、27.36%和24.66%,差異均達(dá)顯著水平(P＜0.05)。

表3 不同熱堿液施用量處理對(duì)小青菜品質(zhì)的影響Table 3 Effects of different alkaline thermal hydrolysis liquid treatments on quality of Brassica chinensis

隨著熱堿液施用量的增加,硝酸鹽含量呈先下降后升高趨勢(shì),T2-T4 處理的硝酸鹽含量分別比T1降低14.55%、30.56%、27.62%。當(dāng)熱堿液施用量增加到一定程度時(shí)會(huì)提高小青菜體內(nèi)硝酸鹽含量,與不施用熱堿液處理無顯著差異,說明適宜施用該熱堿液不僅可以提高小青菜品質(zhì),并且可有效降低小青菜硝酸鹽含量,過量施用反而會(huì)產(chǎn)生負(fù)效果。

2.4 不同熱堿液施用量對(duì)小青菜硝態(tài)氮同化酶活性的影響

小青菜定苗后第2 周、第4 周和第6 周,NR 活性隨著熱堿液施用量的增加呈先升高后下降的趨勢(shì)(圖3A)。不同時(shí)期均在T3 處理下小青菜NR 活性最高,比其他處理分別增加56.56%～183.43%、16.55%～150.36%和7.86%～293.25%。同時(shí),在定苗后第2 周及第4 周隨著熱堿液施用量的增加,各處理間差異顯著;在第6 周,隨著施用量的增加,NR 活性呈先升高后下降再升高的趨勢(shì),T3 處理中最高,T4 處理最低。生長(zhǎng)發(fā)育后期較高熱堿液施用量下NR 活性再次升高,可能是因?yàn)樽魑锷L(zhǎng)后期積累過多硝酸鹽,刺激作物使得NR 活性增加,從而降低小青菜植物體內(nèi)硝酸鹽含量[20]。

圖3 不同熱堿液施用量處理對(duì)各時(shí)期小青菜硝酸還原酶(NR) (A)與亞硝酸還原酶(NiR) (B)活性的影響Fig.3 Nitrate reductase (NR) (A) and nitrite reductase (NiR) (B) activities in Brassica chinensis at different growth stages under different alkaline thermal hydrolysis liquid treatments

在定苗后第2 周、第4 周、第6 周,隨著熱堿液施用量的增加,NiR 活性總體呈先升高后下降再升高的趨勢(shì)(圖3B)。第2 周和第6 周的T3 處理中,小青菜的NiR 活性值最大,分別比其他處理增加24.70%～348.17%和7.62%～286.59%;在第4 周時(shí),T2 處理數(shù)值最大,分別比其他處理增加2.59%～75.68%,T3 處理與T2 處理無顯著性差異,比其他處理增加1.06%～71.24%。說明施用40.38 mg·kg-1熱堿液能夠提高亞硝酸還原酶活性,從而促進(jìn)對(duì)氮素的吸收利用。但在較高熱堿液施用量條件下酶活性再次升高,這可能是由于在較高施肥量下,因小青菜體內(nèi)積累過多亞硝酸鹽會(huì)對(duì)其產(chǎn)生毒害作用,從而提高酶活性,降低小青菜中亞硝酸鹽含量,保證作物健康地生長(zhǎng)發(fā)育。

分別在小青菜定苗后第2 周、第4 周和第6 周,GDH 活性隨著熱堿液施用量的增加呈先升高后降低趨勢(shì)(圖4A)。T3 處理小青菜中GDH 活性最高,分別比其他處理增加9.91%～149.21%、37.52%～308.35%和16.08%～123.12%。同時(shí)當(dāng)熱堿液施用量為40.38 mg·kg-1時(shí),小青菜體內(nèi)GDH 活性隨生長(zhǎng)發(fā)育保持較高水平,促進(jìn)作物對(duì)谷氨酸的合成,提高作物對(duì)氮素的吸收同化。

圖4 不同熱堿液施用量處理中各時(shí)期小青菜中谷氨酸脫氫酶(GDH)(A)、谷氨酸合成酶(GOGAT)和谷氨酰胺合成酶(GS)(B)活性Fig.4 Glutamate dehydrogenase (GDH,A),glutamate synthase (GOGAT) and glutamine synthase (GS) (B) activities in Brassica chinensis at different stages under different alkaline thermal hydrolysis liquid flush treatments

在小青菜定苗后第2 周,各處理間GS 活性無顯著差異。在第4 周、第6 周,GS 活性隨著熱堿液施用量的增加呈先升高后下降趨勢(shì)(圖4B),在3 個(gè)檢測(cè)時(shí)期內(nèi)均以T3 處理最高,分別比其他處理增加4.13%～17.82%、5.23%～122.27%和9.91%～121.21%,說明在該時(shí)期施用熱堿液可提高小青菜中GS 活性,并且在施用量為40.38 mg·kg-1時(shí)效果最好。

在小青菜定苗后第2 周、第4 周和第6 周,與GS 變化趨勢(shì)相同,隨著熱堿液施用量的增加,GOGAT活性呈先升高后下降趨勢(shì)(圖4B),T3 處理小青菜GOGAT 活性比其他處理分別增加31.31%～288.16%、9.63%～351.69%和28.45%～1274.32%,從而促進(jìn)GSGOGAT 循環(huán),提高氮素的吸收利用。定苗后小青菜體內(nèi)GS 活性隨生長(zhǎng)發(fā)育呈下降趨勢(shì),熱堿液施用量為40.38 mg·kg-1時(shí)可提高小青菜體內(nèi)GS 活性峰值,促進(jìn)谷氨酰胺的形成。定苗后小青菜體內(nèi)GOGAT活性隨生長(zhǎng)發(fā)育呈升高后趨于穩(wěn)定狀態(tài),在施用量為40.38 mg·kg-1條件下高于其他處理,并在小青菜整個(gè)生育期保持較高水平,以此保持對(duì)氮素較高水平的吸收轉(zhuǎn)化。

總體而言,在小青菜生長(zhǎng)發(fā)育期間施用熱堿液可明顯提高小青菜中GDH、GOGAT、GS 活性,并且在熱堿液施用量為40.38 mg·kg-1時(shí)效果最佳,從而提高小青菜對(duì)氮素的吸收利用。

2.5 不同時(shí)期小青菜氮素相關(guān)酶與產(chǎn)量、氮素吸收利用的相關(guān)性及冗余分析

氮素同化相關(guān)酶活性與產(chǎn)量、氮素吸收率、氮素利用率的相關(guān)性分析如表4 所示: 定苗后第2 周,產(chǎn)量和GOGAT 呈顯著正相關(guān)(P＜0.05),氮素吸收率和NR 呈顯著正相關(guān)(P＜0.05),氮素利用率和NR 呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。RDA 的結(jié)果表明,GOGAT 和GDH 分別解釋了產(chǎn)量等變化的28.5%和28.4% (表5);它們是影響產(chǎn)量、氮素吸收率和利用率的主導(dǎo)因素;GOGAT 與產(chǎn)量呈正相關(guān),NR 與氮素吸收率呈正相關(guān),與氮素利用率呈負(fù)相關(guān)(圖5),與表4 結(jié)果一致。

圖5 不同時(shí)期(A: 第2 周;B: 第4 周;C: 第6 周)不同處理下氮素相關(guān)酶與產(chǎn)量、氮素吸收率、氮素利用率的冗余分析(RDA)Fig.5 Redundancy analysis (RDA) of relationship at different periods (A: the second week;B: the fourth week;C: the sixth week)between nitrogen-related enzymes activies to yield,nitrogen uptake,and utilization

表4 不同時(shí)期小青菜氮同化相關(guān)酶活性與產(chǎn)量、氮素吸收利用的相關(guān)性Table 4 Pearson’s correlation analysis of nitrogen-related enzymes activities and yield,nitrogen absorption and utilization at different periods

表5 不同時(shí)期氮同化相關(guān)的酶活性冗余分析Table 5 Redundancy analysis of enzymes activities related to nitrogen assimilation at different periods

第4 周,氮素吸收率和GOGAT 呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)。RDA 的結(jié)果表明,GOGAT 影響了產(chǎn)量等變化的15.6% (表5),是影響產(chǎn)量、氮素吸收率、氮素利用率的主導(dǎo)因素。GOGAT 與氮素吸收率呈正相關(guān)(圖5),與表4 結(jié)果一致。

第6 周,產(chǎn)量、氮素吸收率分別和NR、GDH 呈極顯著相關(guān)(P＜0.01),氮素吸收率和GS 呈顯著相關(guān)(P＜0.05)。RDA 的結(jié)果表明,NR、GOGAT 和GDH含量分別解釋了產(chǎn)量等變化的38.8%、32.5%和17.8% (表5),表明它們是影響產(chǎn)量、氮素吸收利用的主導(dǎo)因素。NR 與產(chǎn)量、氮素吸收率呈正相關(guān);GDH 與產(chǎn)量、氮素吸收率呈負(fù)相關(guān);GS 與氮素吸收率呈負(fù)相關(guān)(圖5),與表4 結(jié)果一致。

2.6 不同時(shí)期氮素相關(guān)酶與品質(zhì)、氮素累積量的相關(guān)性分析

NR 在前2 周與可溶性糖呈顯著正相關(guān)(P＜0.05),其余時(shí)期并未達(dá)顯著水平。GDH 在前兩周與可溶性蛋白、可溶性糖、氮素累積量和產(chǎn)量均呈顯著正相關(guān)(P＜0.05),在第4 周和第6 周與可溶性糖呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)。GS 在整個(gè)生育期與可溶性蛋白、氮素累積量和產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)(P＜0.05),其中,在前兩周與可溶性蛋白達(dá)極顯著正相關(guān)(P＜0.01),與維生素C 呈顯著正相關(guān)(P＜0.05);在第4 周與可溶性糖呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01);在第6 周與可溶性糖呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)。GOGAT 在第2 周與可溶性糖呈顯著正相關(guān)(P＜0.05);在第4 周與可溶性糖和氮素累積量達(dá)顯著正相關(guān)(P＜0.05) (圖6)。

圖6 不同時(shí)期氮素相關(guān)酶與品質(zhì)、氮素累積量的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis of nitrogen-related enzymes and quality,nitrogen accumulation at different periods

3 討論

3.1 不同熱堿液施用量對(duì)小青菜養(yǎng)分吸收及產(chǎn)量的影響

通過實(shí)施發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)來提高作物的養(yǎng)分利用效率和產(chǎn)量是當(dāng)前全球糧食安全的主要問題之一[21],采用熱堿水解工藝提取的熱堿液,既解決了污泥的處置問題,同時(shí)實(shí)現(xiàn)了資源的可持續(xù)利用。在此背景下,我們針對(duì)不同施用量的熱堿液對(duì)小青菜氮素養(yǎng)分吸收、產(chǎn)量等進(jìn)行了研究。小青菜中氮素累積量隨著熱堿液施用量的增加呈先升高后降低趨勢(shì),在T3 處理最高,這可能是因?yàn)楫?dāng)熱堿液氮施用量超過40.38 mg·kg-1時(shí),會(huì)引起碳氮比過高,致使微生物的分解較慢,而且會(huì)消耗土壤中的有效態(tài)氮素[22],從而降低了小青菜對(duì)氮素的吸收利用,導(dǎo)致產(chǎn)量降低,由此說明過量施用熱堿液不利于植物養(yǎng)分積累。有研究表明,油菜(Brassica chinensis)隨著施肥量的增加,地上部養(yǎng)分吸收最初顯著增加,然后保持穩(wěn)定或顯著降低[23];同時(shí),氨基螯合物可顯著提高作物的葉片氮濃度[24],本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果過量施肥量會(huì)降低作物養(yǎng)分含量相似。對(duì)產(chǎn)量的影響結(jié)果表明,施用熱堿液與對(duì)照相比能有效提高小青菜產(chǎn)量,熱堿液施用量為40.38 mg·kg-1時(shí),產(chǎn)量最高,超過該施用量后產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)(表2),這可能是因?yàn)樵摕釅A液中含有氨基酸,作為植物容易獲得的生長(zhǎng)元素來源,適量的有機(jī)氮有助于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的發(fā)育,熱堿液過量后會(huì)造成土壤質(zhì)量下降,氮素吸收能力下降,導(dǎo)致產(chǎn)量降低。有研究表明,氨基酸肥料提供了作物可直接吸收的氮,比無機(jī)氮更易被植物細(xì)胞吸收[25],作物產(chǎn)量又是確定最佳施氮量的常用指標(biāo)[26];有研究發(fā)現(xiàn),適當(dāng)污泥施用量比高劑量能夠促進(jìn)葉菜產(chǎn)量的增加[27-29];氨基螯合肥對(duì)植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量有顯著積極影響[30-32];同時(shí),富含氨基酸的水溶性肥料與持續(xù)施用化肥的對(duì)照相比,可顯著促進(jìn)產(chǎn)量的增加[33-34],熱堿液可提高小青菜產(chǎn)量與前人研究結(jié)果相似。

3.2 不同熱堿液施用量對(duì)小青菜品質(zhì)的影響

本試驗(yàn)通過分析小青菜可溶性蛋白、可溶性糖、維生素C 和硝酸鹽評(píng)價(jià)不同施用量的熱堿液對(duì)小青菜品質(zhì)的影響(表3),過低或過高的熱堿液施用量會(huì)降低小青菜品質(zhì)含量,在熱堿液施用量為40.38 mg·kg-1時(shí),上述品質(zhì)指標(biāo)均達(dá)最高值,并且此時(shí)硝酸鹽含量最低(表3),因此,適宜的熱堿液施用量能夠提高小青菜品質(zhì)。小青菜硝酸鹽含量在熱堿液施用量為40.38 mg·kg-1時(shí)顯著降低,這很可能是氨基酸與無機(jī)態(tài)氮共同存在時(shí),植物偏向于吸收氨基酸,降低了外源硝態(tài)氮的攝入,同時(shí)熱堿液施入提高了硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶等氮代謝相關(guān)酶的活性,促進(jìn)了氮素循環(huán),從而降低了小青菜中硝酸鹽的積累[12]。有研究發(fā)現(xiàn),小分子氨基酸可提高小青菜品質(zhì)及降低硝酸鹽含量[35];也有研究發(fā)現(xiàn),一定量的酰胺態(tài)氮等會(huì)提高葉菜類作物的可溶性蛋白、可溶性糖等含量,并可有效降低其硝酸鹽含量[36]。谷氨酸脫氫酶(GDH)可分解谷氨酸為三羧酸循環(huán)提供碳骨架,從而促進(jìn)糖等物質(zhì)的合成;谷氨酰胺合成酶(GS)是處于氮代謝中心的多功能酶,參與多種氮代謝的調(diào)節(jié),其活性的提高可帶動(dòng)氮代謝途徑運(yùn)轉(zhuǎn),促進(jìn)氨基酸的合成和轉(zhuǎn)化[37],同時(shí),糖的積累也可促進(jìn)維生素C 的合成[38]。本研究表明,在小青菜整個(gè)生育期GDH與可溶性糖、GS 與可溶性蛋白呈顯著相關(guān)性,有研究表明,施用外源含氮物質(zhì)可提高作物體內(nèi)GDH、GS 和 谷氨酸合成酶(GOGAT)活性,從而提高其蛋白質(zhì)含量[39]。總之,在熱堿液施用量為40.38 mg·kg-1時(shí),不僅有利于減少植物中硝酸鹽的積累,而且有利于促進(jìn)氮轉(zhuǎn)化,提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)。

3.3 不同熱堿液施用量對(duì)小青菜氮吸收轉(zhuǎn)化相關(guān)酶的影響

氨基酸類肥料施入土壤進(jìn)入植物體后,可通過轉(zhuǎn)氨基作用、脫氨基作用及其他過程加以同化,從而影響植物的氮素循環(huán)途徑。硝酸還原酶(NR)是植物氮代謝的重要調(diào)節(jié)和限速酶。NR 在植物生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量形成和蛋白質(zhì)含量等方面起著重要作用,在NR 的催化作用下,根系將吸收的NO3－轉(zhuǎn)化為NO2－。在亞硝酸還原酶(NiR)的催化下,NO2－轉(zhuǎn)化為NH4+[40];NH4+在GDH 途徑和GS-GOGAT 途徑中分解和合成氨基酸等。本研究表明,NR 及NiR 活性隨著施用量的增加呈先增加后降低再增加的變化趨勢(shì)(圖3)。這可能是由于在較高施用量下,植株體內(nèi)積累過多硝酸鹽會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用,從而提高酶活性,降低小青菜中硝酸鹽含量,同時(shí)提供銨態(tài)氮同化所需原料,保證作物的生長(zhǎng)發(fā)育。在冗余分析中證實(shí)了在小青菜生長(zhǎng)發(fā)育期間,硝態(tài)氮的同化中NR 與產(chǎn)量、氮素吸收率之間呈顯著相關(guān)(圖5)。GDH是植物氮素代謝過程中一個(gè)關(guān)鍵酶,能催化谷氨酸的合成和分解[41]。GOGAT 具有提高氮素利用效率的作用,GS 對(duì)氨具有高親和力,并直接影響氮的吸收和利用[42]。GS、GOGAT 和GDH 酶活性的強(qiáng)弱顯示了植物將有機(jī)氮同化為氨基酸的能力,其活性受到不同施氮?jiǎng)┝康挠绊慬43]。本研究表明,小青菜中GDH、GS 和GOGAT隨著熱堿液施用量的增加其活性呈先升高后降低趨勢(shì),在熱堿液施用量為40.38 mg·kg-1時(shí)達(dá)最大值,并且在生育關(guān)鍵時(shí)期能夠保持較高水平(圖4),說明氮的高效利用時(shí)期與酶活性時(shí)期保持一致,因此適量的熱堿液對(duì)作物氮素吸收轉(zhuǎn)化相關(guān)酶活性具有良好的促進(jìn)作用。通過冗余分析表明,在小青菜生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期,銨態(tài)氮的同化中GOGAT 與產(chǎn)量、氮素吸收率之間呈顯著相關(guān)性(圖5)。本研究結(jié)果同前人關(guān)于適量氮肥可提高作物葉片中NR、GS、GOGAT 活性,但過量施用會(huì)降低其活性的結(jié)果一致[44-45]。同時(shí)有研究[46]表明,添加mM-γ-氨基丁酸(GABA)的營(yíng)養(yǎng)液在適宜施用量下提高了小白菜中NR、NiR、GS、GOGAT 的活性,與本研究結(jié)果一致。綜上所述,氮代謝相關(guān)的酶活性的提高是小青菜高產(chǎn)的重要原因之一。氮代謝相關(guān)酶活性越高,氮同化能力越強(qiáng),可以合成更多的氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),從而提高產(chǎn)量。

4 結(jié)論

1)通過分別對(duì)小青菜產(chǎn)量及氮素吸收量進(jìn)行擬合分析,在一定范圍內(nèi)小青菜產(chǎn)量及氮素吸收量隨施用量的增加而增加,當(dāng)熱堿液施用量為127.59 kg·hm-2時(shí),小青菜產(chǎn)量達(dá)到最高,當(dāng)熱堿液施用量為121.48 kg·hm-2時(shí),氮素吸收量達(dá)最高,超過最大限制用量其生長(zhǎng)受到抑制。綜上所述,121.48～127.59 kg·hm-2為該熱堿液對(duì)小青菜的最佳施用量。

2)在熱堿液施用量為40.38 mg·kg-1的條件下,小青菜中各品質(zhì)指標(biāo)均達(dá)到最高值,此時(shí)硝酸鹽含量最低,因此,適宜的熱堿液施用量能提高小青菜品質(zhì)。

3)不同熱堿液施用量對(duì)小青菜產(chǎn)量及氮素吸收同化相關(guān)酶活性影響較大,熱堿液施用量為40.38 mg·kg-1時(shí)會(huì)促進(jìn)NR、NiR、GDH、GOGAT、GS 酶活性提高,過高或過低的施用量都會(huì)不同程度降低其酶活性,從而影響作物對(duì)氮素的吸收同化;并且在此條件下葉綠素(SPAD 值)和產(chǎn)量均達(dá)到最高,其中GOGAT是決定產(chǎn)量、氮素利用率、氮素吸收率的主要因素,促進(jìn)了小青菜對(duì)氮素的吸收利用。本研究為熱堿液對(duì)葉菜類作物氮素的作用機(jī)理及為熱堿液的合理施用提供了依據(jù),不僅解決了污泥的處置問題,同時(shí)還能提高葉菜類作物的產(chǎn)量。