黃 彬，黃建建，湯優(yōu)令，周文才，汪雁楠，田仟仟，龔 春，舒惠理，溫 強*

（1.江西省林業(yè)科學院 江西省油茶種質(zhì)資源保護與利用重點實驗室，江西 南昌 330013；2.江西省安義縣園林技術(shù)推廣中心，江西 南昌 330500）

【研究意義】浙江紅山茶（2n=30）（Camellia chekiangoleosaHu.），亦稱為浙江紅花油茶、紅花油茶。作為茶花和普通油茶的近緣種，浙江紅山茶兼具優(yōu)良的觀賞和油用價值[1-2]，是我國南方山區(qū)特有的油茶樹種[3]。江西是浙江紅山茶的主要分布區(qū)之一[4]，境內(nèi)諸多市縣均有該樹種的天然分布，其中“中國紅花油茶”之鄉(xiāng)上饒德興市種植面積約2 660 hm2，豐富的資源為該樹種的品種選育奠定了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。另外，浙江紅山茶在江西境內(nèi)還存在較易混淆的近緣種如厚葉紅山茶（C.crassissima）與全緣紅山茶（C.subintegra）等，而前者在現(xiàn)行的兩套山茶屬分類系統(tǒng)[3,5]中能否與浙江紅山茶歸并為一種尚存爭議?；煜N的存在，也給浙江紅山茶資源的開發(fā)利用造成了一定困擾。群體遺傳多樣性研究能使人們充分發(fā)現(xiàn)和保護群體中各種基因和基因型資源，乃至挖掘重要經(jīng)濟性狀的變異并加以科學利用[6]。因此，有針對性的在江西省內(nèi)開展浙江紅山茶及其近緣種的遺傳多樣性研究，可為該樹種資源的保護與利用提供重要的理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M展】前人調(diào)查發(fā)現(xiàn)，浙江紅山茶天然分布于浙江南部、安徽南部、江西東北部、湖南南部和福建北部五省交界的海拔600～1 400 m的山地[7]，分布狹窄且碎片化，屬于狹域種。目前浙江紅山茶遺傳多樣性研究還相對較少。在區(qū)域一級層面，僅見宋倩倩等[8]利用相同的標記工具研究了福建省的13 個浙江紅山茶群體的遺傳多樣性；而在較大尺度范圍，Xie 等[9]通過ISSR 分子標記對浙江、江西、福建、安徽共7個浙江紅山茶群體進行了遺傳多樣性分析，筆者所在團隊近期也完成了浙江、江西、福建、湖南12 個浙江紅山茶群體的遺傳結(jié)構(gòu)的SSR 分析[10]，但后兩者的研究均僅在江西采集了2 個代表群體，無法全面反映江西省內(nèi)的浙江紅山茶遺傳多樣性?！颈狙芯壳腥朦c】基于此，作為浙江紅山茶的主分布區(qū)，在江西全境內(nèi)開展該物種及近緣種的遺傳多樣性研究，是全面揭示浙江紅山茶遺傳多樣性的有利補充?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬針對江西省內(nèi)浙江紅山茶及其近緣種的資源分布現(xiàn)狀，采用共顯性SSR 標記研究浙江紅山茶及其近緣種的群體遺傳結(jié)構(gòu)，為有效的區(qū)分浙江紅山茶及其近緣種提供分子證據(jù)，同時也為在更小尺度下揭示浙江紅山茶群體多層次的遺傳變異，為合理的開發(fā)與利用該樹種資源提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料來自江西省內(nèi)現(xiàn)存浙江紅山茶、全緣紅山茶和厚葉紅山茶天然群體，基本覆蓋了3 個物種在江西省境內(nèi)的主要分布區(qū)（圖1）。樣本間按間隔30 m 進行取樣，共采集11 個群體（8 個浙江紅山茶群體、2 個全緣紅山茶群體和1 個厚葉紅山茶群體）305 份樣本（表1），采摘幼嫩葉片、葉芽或花苞并迅速置于裝有硅膠干燥劑（硅膠與樣本10∶1，w∕w）的密封袋帶回實驗室，保存于-80 ℃超低溫冰箱。

圖1 11個群體樣本分布情況Fig.1 Distribution of 11 population samples

表1 11個群體樣本采集地點概況Tab.1 Overview of sample collection sites of 11 populations

1.2 DNA的提取及PCR擴增

采用改良CTAB[1]法提取DNA，用10 g∕L 的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量，Nanodrop2000（Thermo Scientific，USA）檢測DNA的濃度和純度，最后將DNA濃度稀釋至100 ng∕μL，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

選取19 對SSR 引物（表2）進行SSR-PCR 擴增，10 μL SSR-PCR 擴增體系：10×Buffer 1.0 μL，Mg2+（25 mmol∕L）1.0 μL，dNTPs（10 mmol∕L）1.0 μL，10 μmol∕L 的Primer-F、Primer-R 各0.4 μL，Taq酶（5 U∕μL）0.1 μL，DNA 模板（100 ng∕μL）0.5 μL，加滅菌ddH2O 補齊到10 μL。PCR 擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，57～60 ℃（因不同引物而異）退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25 個循環(huán)；最后72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。PCR 擴增產(chǎn)物用8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染顯色，并拍照記錄。

表2 19對多態(tài)性EST-SSR引物信息Tab.2 Information on 19 polymorphic EST-SSR primers

1.3 數(shù)據(jù)分析

PCR 擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果按基因型數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)讀取，并利用GenAlex 6.4軟件[11]進行數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換，同時計算各群體的固定指數(shù)（F），繪制基于Nei’s 遺傳距離的主成分分析圖（PCoA）。采用POPGENE 32軟件[12]檢測群體的Hardy-Weinberg（HWE）平衡并計算以下遺傳多樣性參數(shù)：平均等位基因數(shù)（A）、觀察等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne），觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Shannon信息指數(shù)（I）、基因流（Nm）、近交系數(shù)（FIS）和遺傳分化系數(shù)（FST）等F 統(tǒng)計變量。由Power Marker V3.25 軟件[13]計算SSR 標記的多態(tài)性信息含量（polymorphism information content，PIC），采用MEGA 5.0軟件[14]利用非加權(quán)類平均法（unweighted pair-group method using arithemtic average，UPGMA）進行群體聚類分析并生成遺傳聚類圖。利用Excel軟件基于群體遺傳分化（Fst）矩陣和地理空間距離矩陣進行Mantel相關(guān)性檢驗。利用Arlequin v3.1 軟件[15]對群體內(nèi)與群體間的遺傳變異進行AMOVA 分子方差分析。將厚葉紅山茶與浙江紅山茶進行種的歸并后的9個群體遺傳結(jié)構(gòu)分析由STRUCTURE軟件[16]完成，設(shè)置K得取值范圍為2～10，將MCMC（Markov Chain Monie Carfo）以及不作數(shù)迭代（length of burn-in period）的值都設(shè)為100 000次，重復運行次數(shù)為10。最佳K值通過在線網(wǎng)址Structure Harvester[17]（http：∕∕taylor0.biology.Ucla.edu∕structharvest∕）計算獲得，完成群體遺傳結(jié)構(gòu)圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR位點的遺傳多樣性

對8 個浙江紅山茶和1 個厚葉紅山茶群體的19 個SSR 位點進行多樣性分析發(fā)現(xiàn)（表3）：共檢測出154 個等位基因，平均每個位點檢測到8.105 個等位基因（Na）和4.557 個有效等位基因（Ne），平均多態(tài)信息含量（PIC）為0.721；其中，引物CC_eSSR49 的有效等位基因數(shù)（6.658）和PIC 值（0.832）均最高，引物CC_eSSR486 的有效等位基因數(shù)（1.600）和PIC 值（0.333）為最低。有18 對引物的PIC 值>0.5，占比94.74%，顯示絕大部分引物具有中或高多態(tài)性。Shannon’s 信息指數(shù)（I）在0.707～1.997 變化，平均值為1.650，觀察雜合度（Ho）和期望雜合度（He）的取值范圍分別是0.307～0.682 和0.375～0.850。

表3 基于9個群體的SSR位點的遺傳參數(shù)統(tǒng)計Tab.3 Genetic polymorphism of SSR loci in the populations of C.chekiangoleosa

2.2 浙江紅山茶及其近緣種的遺傳多樣性

對所有檢測的11個群體進行遺傳多樣性分析表明（表4），各群體的遺傳多樣性參數(shù)有一定的差異。平均等位基因數(shù)（A）和有效等位基因數(shù)（Ne）最高的是MTS群體（5.158，3.502），最低的是JFS群體（3.526，2.388）。群體的觀察雜合度和期望雜合度的變化范圍為0.360～0.550 和0.479～0.673。Shannon’s 信息指數(shù)（I）介于0.927～1.314，各群體的遺傳多樣性從小到大依次為CSM

表4 11個群體的遺傳多樣性Tab.4 Genetic diversity of 11 C.chkiangoleosa populations

通過比較平均值發(fā)現(xiàn)，浙江紅山茶、厚葉紅山茶和全緣紅山茶的遺傳多樣性差異不大（表4）。將厚葉紅山茶群體并入浙江紅山茶群體得到的平均期望雜合度是0.597。就有效等位基因、期望雜合度和Shannon’s 信息指數(shù)而言，厚葉紅山茶的遺傳多樣性水平要高于浙江紅山茶，全緣紅山茶的遺傳多樣性水平最低。

2.3 浙江紅山茶及其近緣種群體的遺傳聚類分析

遺傳距離和遺傳相似度體現(xiàn)了群體間的親緣關(guān)系。從表5 中可以得知，全緣紅山茶的CSY 群體與CSM群體之間的親緣關(guān)系比較近，遺傳距離為0.564 7，且這兩個群體與厚葉紅山茶和浙江紅山茶的群體之間有著相對低的遺傳相似度。厚葉紅山茶CCR 群體與SQS 群體和WFS 群體的遺傳相似度最高，分別為0.589 3和0.553 1，與HYS群體的遺傳相似度最低（0.415 1）。在8個浙江紅山茶群體中，遺傳相似度最高（0.761 2）的兩個群體是MTS群體和DXL群體；其次是MTS群體和SQS群體，它們的遺傳相似度和遺傳距離分別為0.725 0和0.321 6。

表5 11個群體的遺傳距離和遺傳相似度Tab.5 Nei’s unbiased（1972）measures of genetic identity and genetic distance of 11 populations

基于Nei’s（1983）遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類圖（圖2）顯示，11個群體被劃分為三大類。全緣紅山茶的CSY 和CSM 群體聚在一起，組成第Ⅰ大類。厚葉紅山茶CCR 群體單獨成為第Ⅱ大類并與其他來自浙江紅山茶的8 個群體組成的第Ⅲ大類相鄰。第Ⅲ大類所有群體又可以分為3 組，WFS 群體和JFS 群體聚在一起，TBS 群體自成一組，WYS、MTS、SQS、DXL 和HYS 群體聚成第3 組。全緣紅山茶和浙江紅山茶的親緣關(guān)系相對較遠，而厚葉群體與浙江紅山茶群體的親緣關(guān)系較近。此外，主坐標分析（PCoA）（圖3）的結(jié)果與UPGMA 聚類分析相吻合。基于305份樣本得出的UPGMA 聚類圖（圖4）中，厚葉紅山茶的個體與浙江紅山茶沒有交集，而有2個個體與全緣紅山茶聚在了一起。對厚葉紅山茶和浙江紅山茶共9個群體進行Mantel 檢測，結(jié)果表明這9 個群體的遺傳分化與地理距離有一定的正相關(guān)（R2=0.217，P<0.05），群體間存在一定的地理隔離效應(yīng)（圖5）。

圖2 11個群體UPGMA聚類分析Fig.2 UPGMA cluster diagram of 11 populations

圖3 11個群體PCoA主成分分析Fig.3 Principal component analysis of PCoA in 11 populations

圖4 305份樣本UPGMA聚類分析Fig.4 UPGMA cluster diagram of 305 samples

圖5 9個群體的Mantel檢測Fig.5 Mantel detection of 9 populations

2.4 浙江紅山茶群體的遺傳分化與遺傳結(jié)構(gòu)

由表3 可知，所有供檢測群體的總的遺傳分化系數(shù)（FST）為0.246；而經(jīng)物種歸并處理后的浙江紅山茶9個群體的遺傳分化系數(shù)（FST）為0.209，基因流（Nm）變異范圍在0.321～2.408，均值為0.947。表明將近緣種群體的并入會加劇總檢測群體間的遺傳分化；而經(jīng)物種歸并后的浙江紅山茶9個群體處于顯著分化水平且群體間的基因流較小，其中有20.9%的變異來源于群體間，79.1%的變異發(fā)生在群體內(nèi)，這與AMOVA分子方差分析（表6）的結(jié)果相近。為了進一步探討厚葉紅山茶群體與浙江紅山茶各群體之間的遺傳關(guān)系，采用STRUCTURE 軟件以貝葉斯聚類的方法比較9個群體的遺傳結(jié)構(gòu)，將K設(shè)為2～10，重復運行10次。結(jié)果顯示，K=5時獲得的最大ΔK值（圖6），表明9個群體的248份樣本被劃分為5個亞群（圖7）。WFS群體為第一亞群（綠色區(qū)），HYS、SQS和DXL群體組成第二亞群（粉色區(qū)），WYS和JFS群體為第三亞群（紅色區(qū)），TBS 和MTS 群體被劃分為第四亞群（藍色區(qū)），CCR 群體單獨作為第五亞群（黃色區(qū)），這一結(jié)果與UPGMA 聚類分析相似。每個亞群之間都存在一定的基因交流，但又有明顯的分化，其中，第二亞群的SQS群體遺傳組分復雜，與其他幾個亞群都有一定的基因滲透。

圖6 9個群體的最佳K值Fig.6 Optimal K values for 9 populations

圖7 9個群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析Fig.7 Genetic structure analysis of 9 populations

表6 9個群體的AMOVA分析Tab.6 AMOVA analysis of 9 populations

3 結(jié)論與討論

3.1 浙江紅山茶遺傳多樣性分析

目前山茶屬有張宏達與閔天祿2套分類系統(tǒng)，其中前者認為浙江紅山茶、厚葉紅山茶、全緣紅山茶為3 個獨立的種，而后者則將厚葉紅山茶與浙江紅山茶進行種的歸并[3,5]。基于此，本研究采用兩種方式探討浙江紅山茶及其近緣種的遺傳多樣性。其一是將厚葉紅山茶群體并入浙江山茶群體（9 個群體）統(tǒng)一為浙江紅山茶群體，其二是3 個物種分開合計11 個群體。本研究采用19 個SSR 標記對江西省內(nèi)浙江紅山茶及其近緣種群體進行遺傳分析，結(jié)果表明，有94.74%的SSR 標記具有中或高多態(tài)性，能夠有效的評估群體遺傳多樣性。在9個群體中，SSR 位點的有效等位基因（Ne）為4.557，平均期望雜合（He）為0.752，平均Shannon’s 信息指數(shù)（I）為1.650。本研究數(shù)據(jù)明顯高于Xie 等[8]基于ISSR 標記分析浙江紅山茶群體的遺傳多樣性結(jié)果（I=0.496 6，h=0.333 1）。數(shù)據(jù)顯示SSR 標記在揭示群體遺傳多樣性研究中具有比ISSR標記更大的優(yōu)勢。

遺傳多樣性水平在物種的進化和適應(yīng)環(huán)境過程中起著決定性的作用。在物種水平上，浙江紅山茶的基因多樣度H為0.752，要高于Huang 等[10]采用SSR 標記分析全國范圍內(nèi)的12 個浙江紅山茶群體的基因多樣度（0.596）。研究采集的江西浙江紅山茶群體（除厚葉紅山茶群體）主要集中在武夷山脈和懷玉山脈，而全國范圍的研究發(fā)現(xiàn)位于武夷山脈和懷玉山脈的群體表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性，可見兩者結(jié)論可相互印證，而對種群遺傳多樣性的評估可以揭示物種對不同環(huán)境的適應(yīng)性[10]，可見武夷山脈和懷玉山脈是浙江紅山茶最適宜生境。同時，與其他的狹域樹種相比，如山櫻花（Cerasus serrulata）（H=0.634）和蒙古櫟（Quercus mongolica）（H=0.624）比浙江紅山茶具有更低的基因多樣度[18-19]。在山茶屬的狹域樹種中，陳海玲等[20]利用SSR 標記對薄葉金花茶（C.chrysanthoides）、小花金花茶（C.micrantha）和小瓣金花茶（C.parvipetala）的7 個種群進行了遺傳多樣性分析，基因多樣度平均0.471；Li 等[21]同樣利用SSR 標記對金花茶（C.petelotii）及其變種（C.petelotiivar.microcarpa）的天然群體進行了遺傳多樣性分析，平均基因多樣度達到0.546，也均低于本研究結(jié)果，顯示浙江紅山茶是遺傳多樣性較豐富的物種。此外，本研究中，19 個SSR 位點的觀察雜合度（Ho）均低于期望雜合度（He），近交系數(shù)F>0群體發(fā)生近交，這意味著浙江紅山茶群體中的純合子過剩，這種情況也發(fā)生在千年桐（Vernicia montana）和白柳（Salix alba）的群體遺傳多樣性研究中[22-23]，而這一結(jié)果暗示浙江紅山茶群體內(nèi)正發(fā)生著雜合子缺失的過程，未來浙江紅山茶遺傳多樣性會隨之減少。綜合11 個群來看，遺傳多樣性水平厚葉紅山茶（H=0.611）與浙江紅山茶（H=0.595）相近，全緣紅山茶（H=0.501）可能略低于浙江紅山茶。

3.2 浙江紅山茶群體的遺傳分化和遺傳結(jié)構(gòu)

群體的分化程度及遺傳結(jié)構(gòu)可用遺傳分化系數(shù)（FST）來評估，0.050.25 分別表示群體處于中、高和極高的遺傳分化水平[24]。本研究中，F(xiàn)統(tǒng)計顯示浙江紅山茶群體高水平遺傳分化（FST=0.209），并與AMOVA 分析一致?；赟SR 位點評估的11 個群體FST為0.246 高于9 個群體的值，說明全緣紅山茶群體和浙江紅山茶群體間分化程度相對較高，親緣關(guān)系相對較遠，這與群體間的遺傳相似度結(jié)果達成一致。與基于SSR 分子標記的106種植物的遺傳分化系數(shù)[25]相比，受檢測的浙江紅山茶群體遺傳分化系數(shù)略低于窄分布物種的平均水平（FST=0.23），這與浙江紅山茶是狹域種具有較高水平的遺傳分化相符。但本研究低于筆者在全國范圍的[10]的研究結(jié)果（FST=0.239），可能在于更小尺度的群體間存在更近的遺傳關(guān)系。受花粉和種子擴散機制的影響，植物基因流是阻礙種群分化的重要因素，當群體間基因流（Nm）>1時，可以保有當前的遺傳結(jié)構(gòu)，克服遺傳漂變導致的遺傳分化[26]。本研究的基因流（0.767，0.947）均小于1，表明群體間的基因流受到阻礙，未能克服遺傳分化，這是致使浙江紅山茶群體呈現(xiàn)高水平分化的重要因素。

傳統(tǒng)經(jīng)典分類主要依賴于外觀形態(tài)進行。但對于自然環(huán)境錯綜復雜，物種形態(tài)變異豐富的物種類群，傳統(tǒng)分類學處理往往會存在認識分歧。對山茶屬分類系統(tǒng)來說，張宏達系統(tǒng)和閔天祿系統(tǒng)兩套分類系統(tǒng)分歧較大。其中，山茶屬紅山茶亞組的物種分類一直存有爭議，尤其是厚葉紅山茶和浙江紅山茶的種歸并問題。本研究基于SSR分子標記，從遺傳分化和遺傳結(jié)構(gòu)方面探討3個浙江紅山茶近緣種的遺傳關(guān)系。UPGMA 聚類將兩個全緣紅山茶群體（CSY 和CSM）聚為一類，與厚葉紅山茶和浙江紅山茶明顯區(qū)分開來，厚葉紅山茶群體（CCR）可以和浙江紅山茶群體聚為一類，也可以單獨成一類。溫強等[27]利用RPB2基因序列得出的浙江紅山茶及其近緣種的系統(tǒng)進化樹中，結(jié)果不支持將厚葉紅山茶和浙江紅山茶歸為一個種，二者之間的遺傳距離（0.025）高于物種平均值。Xie等[8]對7個浙江紅山茶群體進行聚類時，同樣將厚葉紅山茶群體（JYX）單獨聚為一類。本研究中，9 個群體的STRUCTURE 的遺傳結(jié)構(gòu)分析將厚葉紅山茶歸為一個亞群[8]。前人研究表明厚葉紅山茶與浙江紅山茶有一定的遺傳距離，但由于省內(nèi)厚葉紅山茶僅收集到一個群體，所以是否將兩者歸并成一個種還待進一步的研究探討。8 個浙江紅山茶群體大體上按懷玉山脈（HYS、SQS 和DXL）和武夷山脈（WYS、JFS）進行聚類，符合筆者全國范圍內(nèi)[10]得出12 個浙江紅山茶群體按山脈聚類的結(jié)果。

致謝：江西省林業(yè)局油茶專項（YCYJZX〔2023〕131，YCYJZX〔2023〕111）、江西省林業(yè)局科技創(chuàng)新專項（202228）、江西省林業(yè)科學院基礎(chǔ)研究與人才科研專項（2023521001）、江西省林業(yè)科學院基礎(chǔ)研究與人才科研專項（2022511001）和江西省林業(yè)科學院科研及成果推廣專項博士啟動項目（2021521001）同時對本研究給予了資助，謹致謝意！