趙亞玲 蔣宇林 馬斯禹 江欣 張媛媛 王艷俠 邵偉 王子夜 周希亞 甘佳

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院輸血科，北京 100730

多普勒超聲通過(guò)測(cè)定胎兒的大腦中動(dòng)脈（middle cerebral artery，MCA）峰值收縮速度（peak systolic velocity，PSV）可評(píng)估胎兒是否有貧血風(fēng)險(xiǎn)[4]。MCA-PSV超過(guò)1.5的中位數(shù)倍數(shù)（multiples of the median，MOM）表明胎兒可能嚴(yán)重貧血，需要以穿刺介入、宮內(nèi)輸血或誘導(dǎo)提前分娩的形式進(jìn)行干預(yù)[5-6]。盡管國(guó)內(nèi)外許多文獻(xiàn)報(bào)道了對(duì)產(chǎn)生抗-D的孕婦的臨床監(jiān)測(cè)、干預(yù)及產(chǎn)后新生兒的治療、預(yù)后，但孕期抗-D效價(jià)評(píng)分合并MCA-PSV的定期密切監(jiān)測(cè)、相關(guān)性分析以及指導(dǎo)RhD陰性孕婦的妊娠全周期管理報(bào)道甚少。

本文監(jiān)測(cè)了1例RhD陰性孕婦，意外抗體陽(yáng)性，特異性鑒定為抗-D，并在孕期每1～2周持續(xù)監(jiān)測(cè)抗-D效價(jià)、評(píng)分和胎兒MCA-PSV變化，結(jié)果顯示，孕期該孕婦抗-D效價(jià)和MCA-PSV水平變化趨勢(shì)相似，相比于效價(jià)，效價(jià)評(píng)分似乎更能反應(yīng)胎-母免疫反應(yīng)情況，并與MCA-PSV水平呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，結(jié)合結(jié)果分析進(jìn)一步指導(dǎo)臨床進(jìn)行宮內(nèi)輸血及后續(xù)妊娠管理方案。

材料與方法

1 臨床資料

孕婦38歲，孕2產(chǎn)1，血型為A型，RhD陰性，丈夫血型為A型，RhD陽(yáng)性，第一胎血型為A型，RhD陽(yáng)性，第一次妊娠期間及產(chǎn)后無(wú)抗-D免疫球蛋白保護(hù)，孕17+2周意外抗體篩選試驗(yàn)陽(yáng)性，超聲無(wú)胎兒水腫表現(xiàn)。孕23+3周轉(zhuǎn)診至我院，定期監(jiān)測(cè)免疫血液學(xué)情況、胎兒生長(zhǎng)及血流超聲。

2 主要儀器與試劑

反定型和抗體篩查細(xì)胞購(gòu)自?shī)W森多臨床診斷（英國(guó)）有限責(zé)任公司（批號(hào)：A587Z，3SS160Z），抗人球蛋白試劑（單抗-IgG，K1131）和抗體鑒定16譜細(xì)胞（K1385）購(gòu)自sanquin公司，IgM型單克隆抗體抗-A、抗-B和抗-D血型定型試劑購(gòu)自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，微柱血型卡和抗篩卡及其專用孵育器和離心機(jī)為英國(guó)奧森多臨床診斷有限責(zé)任公司，RhD、RhC、Rhc、RhE、Rhe血型鑒定微柱凝膠卡購(gòu)自江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司，Ortho Autovue Innova全自動(dòng)血型分析儀。

3 方法

3.1 血型鑒定和直接抗人球蛋白試驗(yàn)

采用全自動(dòng)血型分析儀進(jìn)行血型鑒定、紅細(xì)胞意外抗體篩查試驗(yàn)和直接抗人球蛋白試驗(yàn)（direct antiglobulin test，DAT）。

3.2 抗體鑒定

將孕婦血漿與抗體鑒定16譜細(xì)胞反應(yīng)，采用柱凝集抗球蛋白法鑒定不規(guī)則抗體的特異性。

本系統(tǒng)軟件程序全部采用C語(yǔ)言編寫，根據(jù)系統(tǒng)所實(shí)現(xiàn)的功能可分為數(shù)據(jù)采集模塊、數(shù)據(jù)處理和GPRS無(wú)線發(fā)送模塊。傳感器數(shù)據(jù)采集模塊采集茶園環(huán)境信息，如空氣溫度、濕度，光照強(qiáng)度和土壤含水量及溫度。通過(guò)單片機(jī)內(nèi)數(shù)據(jù)處理，GPRS無(wú)線數(shù)傳模塊負(fù)責(zé)將采集到的數(shù)據(jù)通過(guò)無(wú)線的方式傳送到監(jiān)測(cè)中心。本系統(tǒng)的軟件設(shè)計(jì)流程圖，如圖2所示。

3.3 抗-D效價(jià)

抗-D效價(jià)分別采用柱凝集抗球蛋白法及鹽水介質(zhì)抗球蛋白法測(cè)定，柱凝集抗球蛋白法采用ORTHO VISION自動(dòng)血型檢測(cè)儀、Ortho的2%紅細(xì)胞（R0r）及抗人球蛋白卡進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)后記錄凝集強(qiáng)度；鹽水介質(zhì)抗球蛋白法參考AABB技術(shù)手冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作[7]，將孕婦血漿用PBS倍比稀釋，等量加入Ortho的2%紅細(xì)胞（R0r），37℃孵育1 h后，生理鹽水洗滌4次，留細(xì)胞后，加入抗球蛋白試劑后，重懸，離心后記錄凝集強(qiáng)度?？贵w效價(jià)為肉眼可見(jiàn)的凝集強(qiáng)度為1+的最高稀釋度的倒數(shù)，所有反應(yīng)的凝集強(qiáng)度根據(jù)AABB技術(shù)手冊(cè)推薦的評(píng)分體系進(jìn)行評(píng)分（表1）[7]，然后將所有評(píng)分求和得到抗-D效價(jià)評(píng)分。

表1 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)結(jié)果的分級(jí)和評(píng)分

3.4 多普勒超聲

具有一定經(jīng)驗(yàn)的技師根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行多普勒超聲檢查[6]，評(píng)估胎兒血流動(dòng)力學(xué)情況，使用較低頻超聲探頭清晰地顯示W(wǎng)illis環(huán)解剖結(jié)構(gòu)、彩色血流分布及走行，多普勒光標(biāo)線與血管軸線平行，超聲波作用的角度盡可能接近零。將多普勒取樣容積完全置于血管腔內(nèi)，并記錄波形，確定收縮期頻移的峰值及舒張末期頻移值。

3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0.2對(duì)孕婦孕期（宮內(nèi)輸血前）抗體效價(jià)評(píng)分與胎兒MCA-PSV的值進(jìn)行相關(guān)性分析，抗體效價(jià)及評(píng)分獨(dú)立檢測(cè)三次，胎兒MCAPSV的值采用MOM表示，以調(diào)整孕齡對(duì)檢測(cè)的影響，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 孕婦免疫血液學(xué)檢測(cè)及圍產(chǎn)期監(jiān)測(cè)結(jié)果

產(chǎn)前孕婦免疫血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，孕婦血漿中檢出抗-D抗體。圖1A數(shù)據(jù)顯示，抗-D效價(jià)在孕后期趨于穩(wěn)定（經(jīng)典抗球蛋白法-1∶256；柱凝集法-1∶512），但效價(jià)評(píng)分仍有上升趨勢(shì)，且效價(jià)評(píng)分和胎兒MCA-PSV呈現(xiàn)相似的上升趨勢(shì)（圖1B），期間未見(jiàn)胎兒水腫現(xiàn)象。孕婦在孕32+3周柱凝集抗球蛋白法測(cè)抗-D效價(jià)為512，效價(jià)評(píng)分達(dá)106（圖1），超聲胎兒MCA-PSV：72.3 cm/s（1.59 MOM），估算胎兒血紅蛋白（hemoglobin，Hb） 7.3 g/dL，處于貧血狀態(tài)，經(jīng)多科會(huì)診充分評(píng)估后，于孕33周全身麻醉及超聲引導(dǎo)下行胎兒宮內(nèi)輸血，輸血前留取臍靜脈血測(cè)紅細(xì)胞壓積（PCV）為31%，總膽紅素（TBil）4.3 mg/dL，臍靜脈血免疫血液學(xué)結(jié)果見(jiàn)表3，共輸注O型RhD陰性輻照洗滌濃縮紅細(xì)胞40 mL，輸注過(guò)程順利。

圖1 孕期抗體效價(jià)/評(píng)分及MCA-PSV MOM水平監(jiān)測(cè)

表2 產(chǎn)前孕婦免疫血液學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

表3 宮內(nèi)輸血前臍靜脈血及產(chǎn)后新生兒免疫血液學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

2 胎兒MCA-PSV水平與抗-D效價(jià)評(píng)分的相關(guān)分析

圖1與圖2數(shù)據(jù)提示，相比于抗-D效價(jià)，效價(jià)評(píng)分與宮內(nèi)輸血前胎兒MCA-PSV呈現(xiàn)較好的相關(guān)性（圖2），相關(guān)系數(shù)R2=0.668 3，P=0.024 7（經(jīng)典鹽水介質(zhì)抗球蛋白法）；同樣，柱凝集抗球蛋白法測(cè)定的抗-D效價(jià)評(píng)分與胎兒MCA-PSV也有一定的相關(guān)性R2=0.791 8，P=0.007 3（圖2B），均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 孕期MCA-PSV與抗-D效價(jià)及效價(jià)評(píng)分的相關(guān)性分析

3 新生兒免疫血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果及產(chǎn)后情況

孕婦34+2周查抗-D效價(jià)評(píng)分進(jìn)行性升高，胎兒MCA-PSV再次升高（1.59 MOM），超聲尚未提示胎兒水腫現(xiàn)象，但繼續(xù)妊娠溶血將進(jìn)一步加重，增大宮內(nèi)風(fēng)險(xiǎn)，患者已予地塞米松促肺成熟等治療，胎兒發(fā)育與孕周基本相符，基于以上經(jīng)多科會(huì)診充分評(píng)估后，考慮孕婦應(yīng)盡快終止妊娠，故于孕34+4周剖宮產(chǎn)產(chǎn)一女嬰，新生兒免疫血液學(xué)結(jié)果見(jiàn)表3，新生兒溶血三項(xiàng)均為陽(yáng)性，出生后經(jīng)皮氧合最低80%，呻吟，呼吸困難，三凹征陽(yáng)性，立即予BIPAP呼吸機(jī)輔助通氣，經(jīng)皮血氧可升至90%以上。心率146次/分，呼吸54次/分，血壓56/31 mmHg，pcv 40%，Bil 7.30 mg/dL，膽紅素達(dá)換血標(biāo)準(zhǔn)，立即雙面藍(lán)光，建立靜脈通路，加用白細(xì)胞濾器進(jìn)行換血治療，換血前Hb 11.2 g/dL，換血總量約330 mL（O型ccdee表型輻照紅細(xì)胞220 mL，O型RhD陰性血漿110 mL），換血后查PCV 43%，Bil 6.1 mg/dL，Hb 14.4 g/dL，繼續(xù)四面強(qiáng)光療，靜脈使用丙球（IVIg 1 g/kg）封閉抗體，輸注白蛋白結(jié)合間接膽紅素，膽紅素水平控制良好，生后第10天停藍(lán)光光療，停光后監(jiān)測(cè)膽紅素進(jìn)行性升高，HGB亦緩慢下降，考慮溶血尚未完全阻斷，再次予藍(lán)光光療×48 h，IVIg 1 g/kg，生后15 d膽紅素水平穩(wěn)定，PCV穩(wěn)定于40%左右，自主呼吸平順，于出生后第20天出院。

討 論

IgG抗體通過(guò)胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)引起溶血，可能導(dǎo)致胎兒貧血、水腫、心力衰竭等癥狀，因此，一旦RhD陰性孕婦在妊娠期間檢測(cè)到抗-D抗體，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行定量分析以評(píng)估HDFN的風(fēng)險(xiǎn)。抗體效價(jià)作為孕期輔助監(jiān)測(cè)的指標(biāo)，用于測(cè)定母體循環(huán)中抗體的強(qiáng)度[8]，與HDFN的發(fā)病率呈正相關(guān)。然而，效價(jià)的終點(diǎn)判讀法被認(rèn)為是半定量結(jié)果，可能不能準(zhǔn)確反映免疫血液學(xué)情況，并且與HDFN的嚴(yán)重程度預(yù)測(cè)相關(guān)性較差。相較于效價(jià)，效價(jià)評(píng)分考慮了反應(yīng)的強(qiáng)度和抗體的親和力等因素，可以減弱終點(diǎn)判讀法對(duì)結(jié)果的影響，相對(duì)較好地反映孕婦血漿中抗-D抗體的濃度[9-10]。本研究的結(jié)果也提示，效價(jià)評(píng)分似乎能夠更好的反映胎母免疫情況（圖1），并與MCA-PSV呈更好的相關(guān)性（圖2），因此，對(duì)于是否進(jìn)行胎兒多普勒超聲檢測(cè)以及在超聲評(píng)估后是否進(jìn)行宮內(nèi)輸血等治療措施，我們認(rèn)為效價(jià)評(píng)分結(jié)果具有重要意義。

盡管羊膜腔穿刺、臍帶血管穿刺等方法能較為直觀地診斷胎兒貧血，但是這些侵入性操作增加了胎兒宮內(nèi)缺氧以及早產(chǎn)、流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)（約2%）。由于貧血胎兒心輸出量增加和血液粘度降低，其MCAPSV水平常常高于相同孕期的正常胎兒[4]，多普勒超聲作為一種非侵入性的監(jiān)測(cè)手段，通過(guò)測(cè)定胎兒的MCA-PSV水平來(lái)評(píng)估胎兒是否有貧血風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。已有報(bào)道MCA-PSV預(yù)測(cè)中度貧血和重度貧血的靈敏度為100%，假陽(yáng)性率為12%，并且在抗體致敏的胎兒中，MCA-PSV水平和血紅蛋白濃度有較好的相關(guān)性（R2=0.55，P＜0.001）[6]，本研究中，隨著孕期的增加，胎兒MCA-PSV水平呈上升趨勢(shì)，可見(jiàn)隨著母體抗體效價(jià)評(píng)分的增加，結(jié)合到胎兒紅細(xì)胞表面的抗-D抗體的濃度增加，胎兒溶血的嚴(yán)重程度增加，表明多普勒超聲作為一種非侵入性工具，在胎兒貧血的早期診斷和監(jiān)測(cè)中具有重要意義。

研究表明，抗-D效價(jià)與第一次宮內(nèi)輸血時(shí)胎兒的血紅蛋白具有較好的相關(guān)性，且抗-D效價(jià)的增加往往與抗-D濃度具有較好的相關(guān)性[11]，說(shuō)明抗-D效價(jià)的變化能夠影響胎兒溶血的程度，進(jìn)而可能與胎兒多普勒超聲檢測(cè)的MCA-PSV水平有一定的相關(guān)性。本研究也提示抗體效價(jià)評(píng)分與MCA-PSV的MOM值可能存在一定的相關(guān)性，母體抗-D效價(jià)的變化反映了胎母間免疫反應(yīng)情況，而胎兒MCA-PSV水平變化反應(yīng)了胎兒在宮內(nèi)的溶血狀態(tài)，故我們認(rèn)為，對(duì)于已檢出抗體的孕婦，當(dāng)其抗體效價(jià)達(dá)到16或效價(jià)評(píng)分上升時(shí)，應(yīng)開(kāi)始進(jìn)行多普勒超聲監(jiān)測(cè)，抗體效價(jià)評(píng)分有所增加尤其是柱凝集法效價(jià)評(píng)分大于100時(shí)應(yīng)引起重視，若同時(shí)伴有胎兒MCA-PSV超過(guò)1.5 MOM，需充分評(píng)估宮內(nèi)干預(yù)、早期分娩及新生兒治療等風(fēng)險(xiǎn)給出適當(dāng)?shù)娜焉锕芾矸桨浮?/p>

在本研究中，孕婦的抗-D效價(jià)評(píng)分逐漸升高，孕32+3周時(shí)柱凝集法抗-D效價(jià)達(dá)512，效價(jià)評(píng)分106，多普勒超聲顯示胎兒MCA-PSV：72.3 cm/s （1.59 MOM），提示胎兒溶血嚴(yán)重，考慮胎兒貧血、未足月且發(fā)育不成熟等情況，經(jīng)多學(xué)科評(píng)估后決定對(duì)胎兒實(shí)施宮內(nèi)輸血。在宮內(nèi)輸血前，通過(guò)臍靜脈抽取血樣測(cè)得紅細(xì)胞壓積（PCV）為31%。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道宮內(nèi)輸血后胎兒HCT每天下降約1%[12]，即在宮內(nèi)輸血后大約11天，胎兒的PCV可能會(huì)下降至30%以下，增加宮內(nèi)妊娠風(fēng)險(xiǎn)。孕婦孕34+2周測(cè)效價(jià)積分進(jìn)一步升高，MCA-PSV再次超過(guò)1.5 MOM，故剖宮產(chǎn)終止妊娠，成功誕一名女嬰，經(jīng)換血及藍(lán)光光療后，該新生兒生命體征穩(wěn)定，并安全出院。有研究結(jié)果顯示，在妊娠35周后，MCA-PSV檢測(cè)胎兒貧血的敏感性下降[13]。因此，對(duì)于合并同種異體免疫的妊娠，在妊娠35周前，若監(jiān)測(cè)到抗體效價(jià)積分逐漸升高并且MCAPSV超過(guò)對(duì)應(yīng)胎齡的1.5 MOM水平，需要仔細(xì)評(píng)估宮內(nèi)干預(yù)和分娩后早產(chǎn)兒評(píng)估/治療的風(fēng)險(xiǎn)，必要時(shí)可以考慮宮內(nèi)輸血措施[13-15]。此外，隨著宮內(nèi)輸血次數(shù)的增加，MCA-PSV預(yù)測(cè)胎兒貧血的靈敏度會(huì)逐漸下降[16]。研究發(fā)現(xiàn)，若用MCA-PSV來(lái)確定第二次宮內(nèi)輸血時(shí)機(jī)，建議將MCA-PSV閾值定為1.32 MOM，該閾值可較好地識(shí)別胎兒中重度貧血，指導(dǎo)是否需要進(jìn)行第二次宮內(nèi)輸血[16-17]。此外，建議在接受兩次宮內(nèi)輸血后不再使用MCA-PSV來(lái)預(yù)測(cè)胎兒貧血[17]。宮內(nèi)輸血后，應(yīng)結(jié)合臍靜脈Hb水平、后續(xù)效價(jià)積分變化和胎兒情況來(lái)確定最佳的分娩時(shí)機(jī)。

綜上，抗體效價(jià)評(píng)分和胎兒多普勒超聲的監(jiān)測(cè)不僅輔助臨床評(píng)估宮內(nèi)輸血的必要性，也為后續(xù)實(shí)施剖宮產(chǎn)、新生兒換血的治療提供了參考依據(jù)，最后經(jīng)婦產(chǎn)科、兒科、輸血科、超聲科等多學(xué)科合作，不僅實(shí)現(xiàn)了該高抗-D效價(jià)的孕婦順利生產(chǎn)，也成功救治了生產(chǎn)的HDFN患兒。可見(jiàn)相比單獨(dú)進(jìn)行效價(jià)監(jiān)測(cè)，抗體效價(jià)評(píng)分和多普勒超聲綜合監(jiān)測(cè)能更好地評(píng)估胎兒免疫溶血情況，結(jié)合臨床指標(biāo)和其他超聲表現(xiàn)，對(duì)新生兒溶血病的預(yù)判、干預(yù)及治療具有重要的指導(dǎo)意義，對(duì)孕婦圍產(chǎn)期的管理方案具有重要的參考價(jià)值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突