于 璇,魏 霜,姜子德,王衛(wèi)芳

(1.廣州海關技術中心,廣州 510623;2.華南農業(yè)大學植物保護學院,廣州 510640)

【研究意義】十字花科細菌性黑斑病菌(Pseudomonassyringaepv.maculicola)和油菜莖基潰瘍病菌(Leptosphaeriamaculans)能夠侵染油菜籽,隨農產品貿易經油菜籽傳入我國的風險高,給我國農業(yè)生產帶來重大安全隱患[1-4],上海、廈門等多個口岸曾從進口油菜籽中多次檢出上述病菌[5-7]。傳統(tǒng)檢測方法周期長、靈敏度低,無法滿足口岸通關需求。【前人研究進展】目前,油菜莖基潰瘍病病菌和十字花科細菌性黑斑病菌常用的鑒定和檢測方法包括分離培養(yǎng)法、常規(guī)PCR[8-9]、實時熒光定量PCR[10-11]、LAMP-LFD檢測方法[12]、重組聚合酶等溫擴增技術[13]、血清學檢測方法[14]等。隨著分子生物學的快速發(fā)展,PCR技術逐漸應用于植物致病菌的檢測[2,9],但是檢測中遇到的假陰性問題仍未得到有效解決,因此,多數(shù)學者認為在PCR檢測方法中加入擴增內標(Internal amplification control,IAC)非常必要[15-16]?！颈狙芯壳腥朦c】IAC-PCR方法已廣泛應用于食品微生物和植物病毒檢測[16-24],但尚未有應用于油菜籽中油菜莖基潰瘍病病菌和十字花科細菌性黑斑病菌檢測的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】通過人工構建一段隨機序列并作為IAC添加進實時熒光PCR體系中,對體系進行優(yōu)化,建立含有擴增內標的十字花科細菌性黑斑病菌和油菜莖基潰瘍病菌的多重實時熒光PCR方法,并且從特異性、靈敏度以及實際樣品檢測等多個方面對該方法進行系統(tǒng)評價,以期建立能同時檢測十字花科黑斑病菌與油菜莖基潰瘍病菌的含擴增內標的多重實時熒光PCR方法,指示PCR反應中假陰性的情況,提高實驗室檢測效率及口岸對病菌的攔截率,為防止上述2種病菌隨進口種子的傳入提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試劑:LB培養(yǎng)液(廣州環(huán)凱微生物科技有限公司)、NA培養(yǎng)基(廣州環(huán)凱微生物科技有限公司)、PDA培養(yǎng)基(廣州環(huán)凱微生物科技有限公司)、Premix Ex Taqtm試劑(日本TaKaRa公司)、DL 2000 DNA Marker(日本TaKaRa公司)、6×Loading Buffer(日本TaKaRa公司)、TAE緩沖液(日本TaKaRa公司)、生理鹽水、滅菌水、無水乙醇。

儀器:光照培養(yǎng)箱(IPP110plus)、研磨儀(GT200)、臺式冷凍離心機(2-16KL)、核酸光標記儀(HG-EMA)、熒光定量PCR儀(QuantStudios5)、PCR儀(T100TMThermal Cycler)、凝膠成像系統(tǒng)(Geldoc XR+)、核酸蛋白分析儀(ND2000)。

菌株:十字花科細菌性黑斑病菌菌株(P.syringaepv.maculicola)、油菜莖基潰瘍病菌(L.maculans)菌株為廣州海關技術中心植物檢疫研究所在進口油菜籽中分離、鑒定、保存的菌株,其他菌株為廣州海關技術中心植物檢疫研究所保存菌株,編號為:油菜莖基潰瘍病菌(L.maculans)(1371,1358,1362)、油菜黑脛病菌(L.biglobosa)(Z-5,Z-11)、番茄莖點霉(P.lycopersici)(P-1187)、葡萄莖枯病菌(P.glomerata)(P-3428)、炭疽菌屬(Colletotrichumsp.)(2309)、鏈格孢屬(Alternariasp.)(4523,4546)、十字花科細菌性黑斑病菌(P.syringaepv.maculicola)(1037,3846)、丁香假單胞菌番茄致病變種(P.syringaepv.tomato)(1059,1067,1125)、丁香假單胞菌豌豆致病變種(P.syringaepv.pisi)(4832,4845)、丁香假單胞菌黍致病變種(P.syringaepv.panici)(P-36)、丁香假單胞菌斑生致病變種(P.syringaepv.maculicola)(M-23)、丁香假單胞菌大豆致病變種(P.syringaepv.glycinea)(1146)、黃單胞屬(Xanthomonassp.)(X-51,X-37)、假單胞屬(Pseudomonassp.)(5861)、熒光假單胞(P.fluorescens)(2312,2315)。用新型植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN,目錄號DP302,北京)分別提取病原真菌與病原細菌基因組DNA;用DNA提取試劑盒(達安基因,DA0591)提取實際樣品的總DNA,測定DNA濃度。

引物與探針:十字花科細菌性黑斑病實時熒光PCR引物與探針序列參照國家標準《十字花科細菌性黑斑病檢疫鑒定方法》(GB/T36844—2018),油菜莖基潰瘍病菌實時熒光PCR引物與探針序列參照行業(yè)標準《油菜莖基潰瘍菌病檢疫鑒定方法》(SN/T 3685—2013);IAC探針應用Primer Premier 5.0軟件設計,在NCBI網(wǎng)站中進行BLAST分析比較和評估,保證特異性。引物和探針序列如表1所示,均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物與探針序列

1.2 方法

1.2.1 IAC的構建 利用在線軟件(http://www.bio-soft.net/sms/index.html)隨機生成一段DNA序列,將其在NCBI中進行比照,若沒有出現(xiàn)與之同源的DNA片段,在這段隨機DNA序列上、下游分別連接十字花科細菌性黑斑病菌目標片段的引物序列,構成十字花科細菌性黑斑病菌目標DNA的擴增內標DNA序列。將擴增內標DNA序列委托人工基因合成,合成片段載體pUC57,計算拷貝數(shù),-20 ℃保存?zhèn)溆?菌液置于甘油管中-70 ℃保存。

1.2.2 含IAC的多重實時熒光PCR體系優(yōu)化 十字花科細菌性黑斑病菌與油菜莖基潰瘍病菌引物篩選。十字花科細菌性黑斑病菌特異性引物PM1/PM3分別與油菜莖基潰瘍病菌的4對特異性引物(Forward Primer/Reverse Primer,LM3/LM4,LMf/LMr,Lmb3/R2)進行普通多重PCR反應,反應體系為:DNA 2.0 μL(各1 μL),2×Permix ExTaq(Probe qPCR) 12.5 μL,10 μmol/L PM1/PM3各1.0 μL,10 μmol/L油菜莖基潰瘍病菌特異性引物各1.0μL,ddH2O補足至25.0 μL。用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。PCR反應程序為95 ℃ 1 min;95 ℃ 5 s,60 ℃ 1 min,40個循環(huán)。

十字花科細菌性黑斑病菌與油菜莖基潰瘍病菌引物探針比例優(yōu)化。通過對2種菌的引物比例、探針比例進行優(yōu)化,最終建立多重實時熒光PCR反應體系,優(yōu)化參數(shù)如表2所示。反應體系為:DNA 2.0 μL(各1.0 μL),2×Permix ExTaq(Probe qPCR) 10.0 μL,10 μmol/L引物按表2比例添加,10 μmol/L探針按表2比例添加,ddH2O補足至20.0 μL。PCR反應程序同“十字花科細菌性黑斑病菌與油菜莖基潰瘍病菌引物篩選”。

表2 反應體系優(yōu)化參數(shù)

1.2.3 優(yōu)化IAC的添加量 檢測靈敏度。通過拷貝數(shù)計算公式:(6.02×1023)×(ng/μL×10-9)/(DNAlength×660)=copies/μL計算出IAC拷貝數(shù)為1.114×1012/μL,10倍梯度稀釋至1.114×100/μL。選取拷貝數(shù)為1.114×105、1.114×104、1.114×103、1.114×102、1.114×101、1.114×100/μL的IAC作為模板,進行實時熒光PCR擴增,反應體系為:DNA 1.0 μL,2×Permix ExTaq(probe qPCR) 10.0 μL,10 μmol/L PM1/PM3各1.0 μL,10 μmol/L IAC探針1.0 μL,ddH2O補足至20.0 μL。PCR反應程序同“十字花科細菌性黑斑病菌與油菜莖基潰瘍病菌引物篩選”。

IAC添加拷貝數(shù)與探針濃度優(yōu)化。以十字花科細菌性黑斑病菌與油菜莖基潰瘍病菌DNA為模板加IAC進行多重實時熒光PCR反應,分別添加拷貝數(shù)為1.114×104、1.114×103、1.114×102、1.114×101/μL的IAC 1.0 μL,IAC探針添加量分別為0.3、0.5和0.7 μL,反應體系為:DNA 3.0 μL(各1.0 μL,IAC拷貝數(shù)按文中添加),2×Permix ExTaq(Probe qPCR) 10.0 μL,10 μmol/L PM1/PM3各1.0 μL,10 μmol/L探針0.25 μL,10 μmol/L Forward Primer/Reverse Primer各1.0 μL,10 μmol/L 探針0.5 μL,添加0.30、0.50、0.70 μL 10 μmol/L IAC探針,添加 ddH2O補足至20.0 μL,并設十字花科細菌性黑斑病菌與油菜莖基潰瘍病菌的多重實時熒光PCR擴增作為對照。PCR反應程序同“十字花科細菌性黑斑病菌與油菜莖基潰瘍病菌引物篩選”。

IAC特異性驗證。以十字花科細菌性黑斑病菌DNA、油菜莖基潰瘍病菌DNA、IAC分別為模板進行實時熒光PCR反應,反應體系為:DNA 2.0 μL,2×Permix ExTaq(Probe qPCR) 10.0 μL,10 μmol/L PM1/PM3各1.0 μL,10 μmol/L IAC探針0.50 μL,ddH2O補足至20.0 μL,并設以無菌水為模板的實時熒光PCR擴增作為陰性對照,PCR反應程序同“十字花科細菌性黑斑病菌與油菜莖基潰瘍病菌引物篩選”。

1.2.4 含IAC的多重實時熒光PCR體系特異性驗證 選取十字花科細菌性黑斑病菌2株、油菜莖基潰瘍病菌靶標菌3株、非靶標菌19株,分別提取DNA作為模板,進行含IAC的多重實時熒光PCR擴增,反應體系為:DNA 2.0 μL,2×Permix ExTaq(Probe qPCR) 10.0 μL,10 μmol/L PM1/PM3各1.0 μL,10 μmol/L探針0.25 μL,10 μmol/L Forward Primer/Reverse Primer各1.0 μL,10 μmol/L 探針0.50 μL,10 μmol/L IAC探針0.50 μL,ddH2O補足至20.0 μL。PCR反應程序同“十字花科細菌性黑斑病菌與油菜莖基潰瘍病菌引物篩選”。

1.2.5 含IAC的多重實時熒光PCR體系靈敏度測試 分別將濃度為6.9×101與1.6×101ng/μL的十字花科細菌性黑斑病菌和油菜莖基潰瘍病菌的DNA 10倍梯度稀釋至6.9×10-6和1.6×10-6ng/μL,作為模板分別進行含IAC的多重實時熒光PCR擴增,分別以無菌水為模板的含IAC多重實時熒光PCR和以無菌水為模板不含IAC的多重實時熒光PCR為陰性對照。反應體系為:DNA 2.0 μL,2×Permix ExTaq(Probe qPCR) 10.0 μL,10 μmol/L PM1/PM3或10 μmol/L Forward Primer/Reverse Primer各1.0 μL,10 μmol/L探針0.25 μL,10 μmol/L 探針0.5 μL,10 μmol/L IAC探針0.5 μL,ddH2O補足至20.0 μL,PCR反應程序同“十字花科細菌性黑斑病菌與油菜莖基潰瘍病菌引物篩選”。

1.2.6 含IAC的多重實時熒光PCR體系檢測實際樣品 從進口的52批油菜籽與十字花科蔬菜種子樣品中隨機取樣,提取DNA,分別進行含IAC的多重實時熒光PCR擴增,反應體系為:DNA 2.0 μL,2×Permix ExTaq(Probe qPCR) 10.0 μL,10 μmol/L PM1/PM3各1.0 μL,10 μmol/L探針0.25 μL,10 μmol/L Forward Primer/Reverse Primer各1.0 μL,10 μmol/L 探針0.50 μL,10 μmol/L IAC探針0.50 μL,ddH2O補足至20.0 μL。另設人工感染十字花科細菌性黑斑病菌和油菜莖基潰瘍病菌的樣品對照。PCR反應程序同“十字花科細菌性黑斑病菌與油菜莖基潰瘍病菌引物篩選”。

2 結果與分析

2.1 IAC的構建

利用在線軟件(http://www.bio-soft.net/sms/index.html)隨機生成一段DNA序列,將其在NCBI中進行比照,沒有出現(xiàn)與之同源的DNA片段,在這段隨機DNA序列上、下游分別連接十字花科細菌性黑斑病菌目標片段的引物序列,構成十字花科細菌性黑斑病菌目標DNA的擴增內標DNA序列。

擴增內標序列:GCGAAACGACAGCAACAGTGACGTGTCGTCCCACAGGGGTCTATTGGGGAT CATGACCAAAGCCTCCGGGCGTAGTCATCTCTGTGG AGGGACCTTGCCATCGTGTTGCCGCTATCGACTCG。單劃線部分是十字花科細菌性黑斑病菌上、下游引物,雙劃線部分是IAC探針。

2.2 含IAC多重實時熒光PCR體系優(yōu)化

2.2.1 十字花科細菌性黑斑病菌與油菜莖基潰瘍病菌引物篩選 以十字花科細菌性黑斑病菌與油菜莖基潰瘍病菌DNA為模板,十字花科細菌性黑斑病菌特異性引物PM1/PM3分別與油菜莖基潰瘍病菌的4對特異性引物(Lmb3/R2、LM3/LM4、 LMf/LMr、Forward Primer/Reverse Primer)進行普通多重PCR反應。從圖1可知,與普通PCR對比,僅Forward Primer/Reverse Primer與PM1/PM3同時擴增出陽性條帶,LMb3/R2、LM3/LM4產物328、276 bp與PM1/PM3產物307 bp條帶大小相近,不好辨別,因此選取Forward Primer/Reverse Primer作為多重PCR體系中油菜莖基潰瘍病菌的引物。

M:DL 2000 DNA Marke;1: PMI/PM3與Lm3/Lm4普通多重PCR結果;2: PMI/PM3與LMf/LMr普通多重PCR結果;3: PMI/PM3與Forward Primer/Reverse Prime 普通多重PCR結果; 4: PMI/PM3與Lmb3/R2普通多重PCR結果;5:Lm3/Lm4普通PCR結果;6: LMf/LMr普通PCR結果;7: Forward Primer/Reverse Prime普通PCR結果;8:Lmb3/R2普通PCR結果;9: PMI/PM3普通PCR結果;10: 陰性對照。M:DL 2000 DNA Marke;1: Multiplex PCR results of PMI/PM3 and LM3/LM4;2:Multiplex PCR results of PMI/PM3 and LMf/LMr;3: Multiplex PCR results of PMI/PM3 and Forward Primer/Reverse Primer;4: Results of multiplex PCR PMI/PM3 and Lmb3/R2;5:Result of PCR PMI/PM3 and LM3/LM4;6:Result of PCR LMf/LMr; 7: Result of PCR Forward Primer/Reverse Prime;8: Result of PCR Lmb3/R2;9: Result of PCR PMI/PM3;10: Negative control.圖1 2種病菌引物篩選PCR反應Fig.1 Two kinds of pathogenic bacteria primers screened for the PCR reactions

2.2.2 十字花科細菌性黑斑病菌與油菜莖基潰瘍病菌引物探針比例優(yōu)化 當十字花科細菌性黑斑病菌與油菜莖基潰瘍病菌的引物比例為0.8/1.0,探針比例為0.25/0.50時Ct值最小,擴增效率最好,理論上應該選擇0.8/1.0作為本實驗引物比例,但是由于IAC與十字花科細菌性黑斑病菌共用1對引物,會消耗掉一定量的引物,當探針比例為1/1時,十字花科細菌性黑斑病菌條帶更亮,因此本研究確定多重實時熒光PCR反應體系中十字花科細菌性黑斑病菌與油菜莖基潰瘍病菌引物比例為1/1,探針比例采用0.25/0.50。

2.3 IAC添加量優(yōu)化

2.3.1 IAC檢測靈敏度 分別以1.114×105、1.114×104、1.114×103、1.114×102、1.114×101、1.114×100/μL拷貝數(shù)的IAC為模板進行實時熒光PCR擴增。從圖2可知,IAC的檢測靈敏度為1.114×102/μL。為了使IAC對檢測靈敏的影響降到最低,在確保內標能夠清晰的指示假陰性的同時,盡量選擇較低濃度,因此選擇1.114×104、1.114×103、1.114×102、1.114×101/μL進行下一步實驗,確定擴增內標的添加量。

圖2 IAC檢測靈敏度Fig.2 IAC detection sensitivity

2.3.2 IAC拷貝數(shù)與探針添加量優(yōu)化 以十字花科細菌性黑斑病菌與油菜莖基潰瘍病菌DNA為模板進行含IAC的多重實時熒光PCR擴增,根據(jù)2.3.1檢測靈敏度結果,在確保內標能夠清晰指示假陰性的同時,盡量選擇較低濃度的原則,使其對檢測靈敏的影響降到最低。因此排除拷貝數(shù)1.114×105/μL,分別添加拷貝數(shù)為1.114×104、1.114×103、1.114×102、1.114×101/μL的IAC,添加量分別為0.3、0.5和0.7 μL,從表3中可知,當添加拷貝數(shù)為1.114×104/μL時Ct值增大,影響靈敏度,當拷貝數(shù)添加1.114×103、1.114×102/μL時對PSM與LM的Ct值影響最小,考慮到當添加IAC的拷貝數(shù)為1.114×102/μL時,Ct值接近35,不容易判斷,因此選擇1.114×103/μL為本體系的拷貝數(shù)添加量;對比探針添加量可以看出,當探針添加0.5 μL時,PSM與LM的Ct值最小。所以在20.0 μL體系中,選擇添加IAC拷貝數(shù)為1.114×103/μL,IAC探針添加量為0.5 μL。

表3 IAC拷貝數(shù)與探針添加量

2.3.3 IAC特異性驗證 以十字花科細菌性黑斑病菌DNA、油菜莖基潰瘍病菌DNA、IAC為模板分別進行實時熒光PCR擴增。從圖3可知,僅IAC擴增出陽性曲線,目標菌為陰性,說明該IAC特異性良好。

1～3:IAC為模板的實時熒光PCR驗證結果;4～6:十字花科細菌性黑斑病菌DNA為模板的實時熒光PCR驗證結果;7～9:油菜莖基潰瘍病菌DNA為模板的實時熒光PCR驗證結果;NC:以無菌水為模板的陰性對照。1-3: Results of real-time PCR validation using IAC as template; 4-6: Results of real-time PCR validation using DNA as template of P. syringae pv. Maculicola;7-9: Results of real-time PCR validation using DNA as template of L. maculans; NC: Negative control.圖3 IAC實時熒光PCR特異性驗證結果Fig.3 Results of specificity verification by IAC real-time PCR

2.4 含IAC多重實時熒光PCR體系特異性驗證

選取十字花科細菌性黑斑病菌2株與油菜莖基潰瘍病菌3株靶標菌、19株非靶標菌提取DNA,作為模板進行含IAC的多重實時熒光PCR擴增與實時熒光PCR擴增。從圖4可知,該反應特異性高,對非目標菌檢測結果均為陰性,對目標菌檢測結果均為陽性。

1～3:油菜莖基潰瘍病菌含IAC多重實時熒光PCR擴增結果;4～5:十字花科細菌性黑斑病菌含IAC多重實時熒光PCR擴增結果;6～24:非靶標菌含IAC多重實時熒光PCR擴增結果;IAC:靶標菌與非靶標菌IAC實時熒光PCR擴增結果。1-3:Results of IAC-containing multiplex real-time PCR amplification of L. maculans;4-5:Results of IAC-containing multiplex real-time PCR amplification of P. syringae pv. Maculicola;6-24:Results of multiple real-time PCR amplification of non-target bacteria containing IAC;IAC:Real-time PCR amplification results of all IAC in the system.圖4 含IAC的多重實時熒光PCR反應結果Fig.4 Multiple real-time qPCR reaction results of IAC-containing test strains

2.5 含IAC多重實時熒光PCR體系靈敏度測試

提取的十字花科細菌性黑斑病菌與油菜莖基潰瘍病菌DNA濃度分別為6.9×101和1.6×101ng/μL,進行10倍稀釋,稀釋至6.9×10-6和1.6×10-6ng/μL,共8個濃度,作為模板進行含IAC的多重實時熒光PCR擴增。從圖5可知,含IAC的實時熒光PCR對油菜莖基潰瘍病菌的檢測低限為1.6×10-4ng/μL;重復試驗發(fā)現(xiàn),當DNA濃度為6.9×10-5ng/μL時雖有擴增,但Ct值并不穩(wěn)定,因此本方法對十字花科細菌性黑斑病菌的檢測低限為6.9×10-4ng/μL。2種病菌同樣DNA濃度梯度,分別按照標準中熒光PCR與含IAC的多重實時熒光PCR擴增,檢測低限相同,證實在PCR體系中添加適宜濃度的IAC片段不會降低檢測靈敏度。

a和c分別為油菜莖基潰瘍病菌含IAC多重實時熒光PCR和單重實時熒光PCR的靈敏度測試結果;1～6:1.6×101～1.6×10-4 ng/μL的DNA濃度。b和d分別為十字花科細菌性黑斑病菌含IAC多重實時熒光PCR和單重實時熒光PCR的靈敏度測試結果;1～7:6.4×101 ～6.4×10-5 ng/μL的DNA濃度。IAC:含IAC的多重實時熒光PCR擴增結果;NC:陰性對照。a and c show the sensitivity test results of multiple real-time PCR and single real-time PCR containing IAC for L. maculans, respectively; 1-6:DNA concentration of 1.6×101-1.6×10-4 ng/μL.b and d show the sensitivity test results of multiple real-time PCR and single real-time PCR containing IAC for P. syringae pv.Maculicola, respectively.1-7:DNA concentration of 6.4×101-6.4×10-5 ng/μL;IAC:Real-time PCR amplification results of all IAC in the system;NC:Negative control.圖5 含IAC多重實時熒光PCR方法與單重實時熒光PCR方法檢測靈敏度比較Fig.5 Comparison of the sensitivity of multiple real-time PCR with IAC and single real-time PCR

2.6 含IAC多重實時熒光PCR檢測實際樣品

對進境的52批油菜籽和十字花科蔬菜種子分別提取DNA后,進行含IAC的多重實時熒光PCR擴增(表4),通過與人工添加十字花科細菌性黑斑病菌和油菜莖基潰瘍病菌的樣品和以無菌水為模板的12批陰性對照比較,62份樣品結果一致,編號10、39的2個樣品IAC沒有被擴增,表明PCR反應假陰性,需要重新檢測。2個樣品經過重新提取DNA,再次進行含IAC的多重實時熒光PCR檢測,其中編號10的樣品為十字花科細菌性黑斑病菌陽性,編號39的樣品為十字花科細菌性黑斑病菌與油菜莖基潰瘍病菌陰性。

表4 含IAC的多重實時熒光PCR方法的應用

3 討 論

本研究采用含有擴增內標的十字花科細菌性黑斑病菌和油菜莖基潰瘍病菌的多重實時熒光PCR方法,在20.0 μL體系中加入1.114×103拷貝數(shù)的IAC時,對十字花科細菌性黑斑病菌和油菜莖基潰瘍病菌的檢測靈敏度和實際樣品的擴增效率均不受影響,且能夠有效指示PCR反應的假陰性。

在反應過程中低同源性可以使PCR產物不會通過互補鏈的結合而交聯(lián)在一起,因此要求構建擴增內標時其與目的基因片段之間的同源性盡量低,從而降低IAC對檢測靈敏度的影響[23]。本研究人工構建一段隨機序列作為擴增內標,將其在NCBI中進行比對,沒有出現(xiàn)與之同源的DNA片段。另外,為獲得添加IAC的最佳反應體系,本研究設置了一系列梯度濃度的內標進行試驗分析,最終確定反應體系中添加內標的最佳拷貝數(shù)為1.114×103;當內標添加量較高時,即添加拷貝數(shù)高于1.114×104/μL時,PCR反應靈敏度降低,推測是在同一個PCR反應體系中,當內標添加量高時,由于PCR的偏好性,優(yōu)先與引物結合,導致目標基因擴增受抑制,從而降低PCR反應的靈敏度。通過與國家標準[25-26]推薦的單重實時熒光PCR方法的靈敏度比較表明,本研究對十字花科細菌性黑斑病菌和油菜莖基潰瘍病菌的檢測靈敏度分別為6.9×10-4和1.6×10-4ng/μL,均與單重實時熒光PCR方法的檢測靈敏度相當。

本研究還發(fā)現(xiàn),當目標菌濃度過高時,IAC受到抑制,沒有擴增,但此時目標菌濃度高,很容易被檢出,這種情況下IAC的擴增并不重要,因為只有在目標菌與IAC的擴增均受到抑制的情況下,才能判定檢測結果為假陰性。索標等[24]與李雪玲等[17]也在研究中觀察到了此類現(xiàn)象,體系中目標菌濃度過高時,由于偏好性會抑制IAC的擴增,但這種情況不能判定為假陰性。

對52批實際樣品進口油菜籽和十字花科蔬菜種子的檢測驗證中,本研究建立的多重實時熒光PCR方法與單重實時熒光PCR方法的結果一致。但是對編號10和編號39的樣品第一次檢測結果對靶標基因和IAC均為陰性,重復試驗檢測結果顯示,編號10的樣品十字花科細菌性黑斑病菌為陽性,因此,相比于單重實時熒光PCR方法,本研究建立的多重實時熒光PCR方法可以有效指示假陰性檢出結果,避免因核酸提取質量或人工操作失誤對試驗結果帶來的影響,有效提高了檢測結果的準確性。

4 結 論

本研究建立的含擴增內標的多重實時熒光PCR檢測方法滿足同時檢測上述細菌性黑斑病菌和油菜莖基潰瘍病菌的檢測需求,有效縮短檢測時間和檢測成本,且能夠同時指示假陰性,該方法特異性強、靈敏度高、重復性好、穩(wěn)定性強,能夠滿足快速、精準、穩(wěn)定的鑒定需求,為該病原菌的檢疫及防控提供有力支撐,對防控病菌傳入、保障引種安全具有重要意義。