許佳偉,羅 鳴,徐 榮,王明星,馬聰吉,苗玉煥,劉大會(huì)

(1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源中心,武漢 430065;2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所,昆明 650205)

【研究意義】半夏為天南星科植物半夏[Pinelliaternata(Thunb.)Breit.]的干燥塊莖,其味辛、溫,有毒,歸脾、胃、肺經(jīng),具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)等功效[1]。其為中國(guó)傳統(tǒng)大宗中藥材,至今已有兩千多年的用藥歷史。國(guó)家中醫(yī)藥管理局推薦的100個(gè)首批中藥經(jīng)典名方中,有17方含半夏,在中醫(yī)臨床使用頻次最高的588個(gè)中藥處方中半夏使用率位于第22位[2]?！盎瘽駭《旧ⅰ薄扒宸闻哦緶薄鞍胂暮駱銣钡戎兴幏絼┰诳箵簟靶鹿诜窝住?COVID-19)中發(fā)揮了重要作用,半夏是這些抗疫處方中不可缺少的中藥之一[2]。隨著市場(chǎng)需求量的增加,現(xiàn)野生半夏不斷減少,人工栽培已成必然趨勢(shì)。貴州、湖北、河北、甘肅已成為半夏主要生產(chǎn)區(qū)域,云南[3]、四川、安徽等地也有少量種植。然而,隨著種植規(guī)模的擴(kuò)大,軟腐病問題愈發(fā)嚴(yán)重,已威脅到半夏的產(chǎn)量和品質(zhì)。合理防治是提高半夏產(chǎn)量、獲得優(yōu)質(zhì)半夏的關(guān)鍵?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】軟腐病是植物在感染歐文氏桿菌屬細(xì)菌和根霉屬真菌后而引起的一種病害,目前關(guān)于植物細(xì)菌性軟腐病致病菌的報(bào)道主要包括果膠桿菌屬(Pectobacterium)和狄克氏菌屬(Dickeya)2個(gè)菌屬[4],已報(bào)道的半夏軟腐病病原菌主要包括D.chrysanthemi、D.fangzhongdai、P.carotovorum、Klebsiellaoxytoca[5-7]。該病害不僅發(fā)生在田間,還發(fā)生在運(yùn)輸過程和貯藏期間。軟腐病菌主要侵染植物多汁肥厚的器官,如果實(shí)、塊根、塊莖等部位。半夏軟腐病的主要癥狀為塊莖軟化腐爛、葉片和葉柄呈水漬樣軟腐,整株植物迅速死亡,其中半夏塊莖的腐爛比其它器官和組織更加嚴(yán)重。該病多發(fā)生在高溫多濕季節(jié),嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致整個(gè)栽培區(qū)絕收。軟腐病在半夏栽培區(qū)域普遍存在,且有逐年加重的趨勢(shì)。【本研究切入點(diǎn)】半夏不同產(chǎn)地環(huán)境差異較大,致病菌的種類不同,其致病力存在較大差異。前人僅對(duì)單一產(chǎn)地或單一菌株進(jìn)行零星報(bào)道,未對(duì)全國(guó)不同產(chǎn)地和不同半夏軟腐病優(yōu)勢(shì)菌株及其致病力進(jìn)行綜合全面的分析鑒定。而軟腐病致病因素復(fù)雜,很難通過一種藥劑對(duì)其進(jìn)行防治。生產(chǎn)中大部分藥劑僅針對(duì)一種致病菌進(jìn)行防治,導(dǎo)致藥農(nóng)常隨意采用混合藥劑對(duì)半夏軟腐病進(jìn)行防治,致使半夏中藥材農(nóng)藥殘留問題日趨嚴(yán)重?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過收集貴州、湖北、河北、甘肅四大主產(chǎn)區(qū)半夏軟腐病樣株,對(duì)其進(jìn)行分離鑒定、致病力和生理生化比較,明確各半夏主產(chǎn)地軟腐病優(yōu)勢(shì)致病菌及其生物學(xué)特性,并對(duì)半夏軟腐病主要病原菌進(jìn)行室內(nèi)藥劑篩選,以期得到針對(duì)不同病原菌的高效殺菌劑,為半夏軟腐病的防治提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2020年8月至2021年8月,從湖北省天門市汪場(chǎng)鎮(zhèn)(TM,30°57′72.89″ N、112°95′ E;海拔34.9 m)、湖北省潛江市王場(chǎng)鎮(zhèn)(QJ,30°44′0826″ N、112°82′6929″ E;海拔28.1 m)、河北省保定市博野縣南小王鎮(zhèn)(AG,38°34′1472″ N、115°48′5067″ E;海拔8.1 m)、甘肅清水縣(QS, 34°80′4834″ N、106°09′1560″ E;海拔1344.6 m)、甘肅西和縣何壩鎮(zhèn)(HB, 33°93′1814″ N、105°23′6561″ E;海拔1627.1 m)、貴州省畢節(jié)市赫章縣雙坪彝族苗族自治區(qū)(HZ, 27°07′6111″ N、104°44′9386″ E;海拔2116.4 m)4個(gè)半夏主產(chǎn)區(qū)的6個(gè)地點(diǎn)采集半夏軟腐病株以及當(dāng)?shù)匕胂姆N質(zhì)資源。樣品經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)劉大會(huì)教授鑒定為半夏(P.ternata)。

1.2 試劑

瓊脂粉(德國(guó)BioFroxx);瓊脂糖(西班牙Biowest);D(+)-無水葡萄糖、濃HCl和NaOH均為分析純,來源于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;50×TAE Buffer、Dured核酸染料、DNA Marker均來源于生工生物工程(上海)股份有限公司;2×T5 direct PCR MIX(Plant) Cat．No. TSE011(內(nèi)含Lysis Buffer A、Dilution Buffer B 和PCR Premix)來源于武漢擎科生物工程有限公司。16S rDNA引物fd1:5′-AAGAGTTTGATC(CA)TGGCTCAG-3′,rp:5′- TACGG(TC)TACCTTGTTACGACTT-3′、果膠桿菌蘋果酸脫氫酶基因mdh引物mdh-F: 5′-CCCAGCTTCCTTCAGGTTCAGA-3′,mdh-R: 5′-CTGCATTCTGAATACGTTTGGTCA-3′[8-9]、Buffer、dNTP、Taq酶來源于武漢擎科生物工程有限公司。供試殺菌劑見表1。

表1 供試殺菌劑

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)地病害調(diào)查 2020年8月至2021年8月,在4個(gè)半夏主產(chǎn)區(qū)的6個(gè)地點(diǎn)對(duì)半夏軟腐病發(fā)病情況、規(guī)律以及相關(guān)防治措施進(jìn)行調(diào)查,記錄并采集軟腐病病株。

1.3.2 病原菌分離 采用組織分離法分離病原菌,將發(fā)病的半夏植株用無菌水洗凈后拭干表面,經(jīng)75%乙醇消毒2 min后,漂洗3次。在無菌條件下切取塊莖病健交界處的組織于2 mL離心管中,碾碎,加1 mL無菌水制成細(xì)菌懸浮液。取適量懸浮液于LB固體培養(yǎng)基上劃線接種,在28 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h,反復(fù)純化菌株3～4次后,挑取單一菌落于LB液體培養(yǎng)基中,在28 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)24 h,取500 μL菌液和500 μL 70%稀甘油,混勻后作為菌種,-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 菌株的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定 將純化的菌株接種在LB培養(yǎng)基平板上,于28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)24 h,觀察菌落形態(tài)特征及革蘭氏染色結(jié)果。采用CTAB法提取菌株DNA,使用16S rDNA引物fd1/rp和果膠桿菌蘋果酸脫氫酶編碼基因特異引物mdh-F/mdh-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL PCR反應(yīng)體系:裂解產(chǎn)物1 μL、上下游引物各0.5 μL、dNTP 1 μL、buffer 5 μL和無菌水41.5 μL。擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,34個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。16S rDNA引物fd1/rp的延伸時(shí)間為1 min。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定、檢測(cè)后送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST對(duì)比,用MEGA 11軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定致病菌的種屬。

1.3.4 分離菌株的致病性測(cè)定 為明確菌株對(duì)半夏的致病性,本研究采用科赫氏法則,對(duì)分離純化的菌株進(jìn)行活體回接,在葉片上制造傷口,每處接種10 μL菌懸液(OD600= 1.0),對(duì)照組接種無菌水,對(duì)回接發(fā)病的葉片重復(fù)篩菌操作,鑒定與接種物是否一致。

1.3.5 病原菌致病力比較 采用離體葉片、塊莖對(duì)分離鑒定到的3種致病菌(P.carotovorum、P.aroidearum、D.fangzhongdai)進(jìn)行致病力比較,取健康半夏葉片及粒徑大小為1.4～1.6 cm的塊莖,每組兩片葉片,葉片不制造傷口。設(shè)置15、20、25、30 ℃不同溫度處理,各溫度設(shè)置葉片正面組和背面組,重復(fù)3次。每片葉片接種10 μL菌懸液,置于不同溫度下保濕培養(yǎng),每隔12 h進(jìn)行觀察,記錄各組葉片發(fā)病情況。塊莖致病力比較采用真空抽濾法[10],將洗凈消毒的塊莖浸泡3 h后置于抽濾瓶中,加入500 mL菌懸液抽濾30 min,每組10粒半夏,設(shè)置3組生物學(xué)重復(fù)。置于28 ℃恒溫保濕培養(yǎng),每隔12 h對(duì)塊莖進(jìn)行觀察,記錄發(fā)病情況。

1.3.6 軟腐病病原菌生物學(xué)特性測(cè)定 測(cè)定溫度、pH對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響,取1.3.2項(xiàng)中菌種10 μL,接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基,分別于5、15、25、30、35、40 ℃環(huán)境培養(yǎng);另取相同菌種10 μL分別接種于pH為2、4、6、7、8、9、10、12的LB培養(yǎng)基(pH調(diào)節(jié)劑為1 mol/mL HCl與1 mol/mL NaOH),于28 ℃環(huán)境培養(yǎng)。接種后,置于180 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h后取出,用紫外分光光度計(jì)測(cè)量菌液吸光度值,計(jì)算其生長(zhǎng)速率,每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3.7 室內(nèi)藥劑篩選 采用平板抑菌法[11-13]測(cè)定不同藥劑對(duì)3種致病菌(P.carotovorum、P.aroidearum、D.fangzhongdai)的抑制作用。首先對(duì)26種藥劑進(jìn)行初篩,將活化后的菌液和LB培養(yǎng)基按1∶20制成含菌培養(yǎng)皿(每50 mL LB培養(yǎng)基中加入2.5 mLOD= 1.0的菌液)。在含菌板上打取直徑為5 mm的孔徑,將26種藥劑參照表1推薦濃度配制成不同濃度的藥液,每孔加入80 μL藥液,以無菌水為空白對(duì)照,于28 ℃下培養(yǎng)24 h后觀察抑菌情況,重復(fù)3次。選取有效防治的藥劑,將3種致病菌接種于不同濃度梯度含藥培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)24 h后用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑,計(jì)算抑制率與毒力方程。

抑制率=[(處理組抑菌圈直徑-對(duì)照組抑菌圈直徑)/處理組抑菌圈直徑]×100%

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Excel、DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、Origin 2018和MEGA 11軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間病害調(diào)查

調(diào)查發(fā)現(xiàn)半夏軟腐病普遍始發(fā)于4月中下旬,且在雨后快速蔓延,6—7月梅雨季節(jié)更為嚴(yán)重,7—8月為半夏軟腐病的高發(fā)期。其中,湖北地區(qū)雨季較早,氣溫上升快,半夏軟腐病發(fā)病較早;河北和甘肅地區(qū)因雨季稍晚,氣溫上升慢,發(fā)病較晚;貴州地區(qū)海拔較高,氣溫較低,發(fā)病較晚。在高溫多雨環(huán)境下,其發(fā)病后蔓延速度快,感染后約2～4 d植株整株死亡,且在雨水多的田間,發(fā)病率高達(dá)75%以上。在軟腐病感染初期,植株葉片呈燙葉狀;發(fā)病中期,葉片則出現(xiàn)水漬樣并伴隨惡臭味,此時(shí)病情開始往下方莖稈塊莖處蔓延;發(fā)病后期,葉片、莖稈和塊莖腐爛,塊莖軟化出現(xiàn)白漿并伴有濃烈惡臭味,病株倒伏后通過直接接觸或隨雨水傳播的形式,進(jìn)而造成健康植株大面積感染。各產(chǎn)地田間發(fā)病情況見圖1。

A. 貴州半夏田間整體及半夏軟腐病發(fā)病細(xì)節(jié);B. 湖北半夏田間整體及半夏軟腐病發(fā)病細(xì)節(jié);C. 河北半夏田間整體及半夏軟腐病發(fā)病細(xì)節(jié);D. 甘肅半夏田間整體及半夏軟腐病發(fā)病細(xì)節(jié)。A. Overall field of P. ternata in Guizhou province and detailed condition of P. ternata soft rot disease incidence; B. Overall field of P. ternata in Hubei province and detailed condition of soft rot disease of P. ternata; C. Overall field of P. ternata in Hebei province and detailed condition of P. ternata soft rot disease incidence; D. Overall field of P. ternata in Gansu province and detailed condition of P. ternata soft rot incidence.圖1 半夏各產(chǎn)區(qū)田間生長(zhǎng)情況及田間軟腐病發(fā)病情況Fig.1 Field growth and incidence of soft rot of P. ternata in various producing areas

2.2 分離菌株分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)鑒定

2.2.1 病原菌分子鑒定 采集4大半夏主產(chǎn)區(qū)軟腐病樣,共分離得到49株致病菌,利用16S rDNA引物fd1/rp和特異引物mdh-F/mdh-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別得到約1500、460 bp的特異性片段,經(jīng)序列比對(duì),其中,貴州10株(P.aroidearum8株、P.carotovorum2株)、湖北9株(P.carotovorum2株、D.fangzhongdai7株)、河北9株(P.aroidearum1株、P.carotovorum8株)、甘肅21株(P.aroidearum4株、P.carotovorum17株)。不同地區(qū)優(yōu)勢(shì)致病菌存在差異,P.carotovorum菌株在4個(gè)產(chǎn)區(qū)均有分布,在貴州、甘肅、河北占比較大;P.aroidearum菌株在甘肅、河北地區(qū)有少量分布;D.fangzhongdai菌株只在湖北地區(qū)分布(圖2)。結(jié)合以上所述,P.carotovorum菌株為甘肅和河北地區(qū)優(yōu)勢(shì)致病菌,P.aroidearum為貴州地區(qū)優(yōu)勢(shì)致病菌,D.fangzhongdai菌株為湖北地區(qū)優(yōu)勢(shì)致病菌。

圖2 貴州、湖北、河北及甘肅產(chǎn)區(qū)田間半夏軟腐病分布Fig.2 Distribution of soft rot of P. ternata in fields in Guizhou, Hubei, Hebei and Gansu provinces

將分離得到的菌株分別命名為QS、AG、HZ、TM、QJ、HB。挑選代表菌株7株,分別基于16S rDNA基因和mdh基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。16S rDNA引物擴(kuò)增序列比對(duì)結(jié)果表明,HZ-3(登錄號(hào)OQ449569)與軟腐果膠桿菌P.carotovorum聚為一類,序列相似度為99.65%(登錄號(hào)KP187497.1); QS-3(登錄號(hào)OQ449570)與軟腐果膠桿菌P.carotovorum聚為一類,序列相似度為99.72%(GenBank登錄號(hào)KP187502.1);TM-1(登錄號(hào)OQ450317)與狄克氏菌D.fangzhongdai聚為一類,序列相似度為99.77%(GenBank登錄號(hào)MW332472.1);AG-1(登錄號(hào)OQ450318)與軟腐果膠桿菌P.aroidearum聚為一類,序列相似度為98.50%(登錄號(hào)MK875007.1);HB-5(登錄號(hào)OQ449450)與軟腐果膠桿菌P.aroidearum聚為一類,序列相似度為99.19%(登錄號(hào)MN922926);HZ-2(登錄號(hào)OQ449455)與軟腐果膠桿菌P.aroidearum聚為一類,序列相似度為97.17%(登錄號(hào)MT834965.1);QJ-1(登錄號(hào)OQ449660)與軟腐果膠桿菌P.aroidearum聚為一類,序列相似度為99.88%(登錄號(hào)KY446047.1)。基于16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3-A),結(jié)果表明,HZ-3和QS-3與標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān).carotovorumsubsp.carotovorumT聚為一類;AG-1、HB-5、HZ-2和QJ-1與標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān).aroidearumT聚為一類;TM-1與NCBI中與已報(bào)道的菌株D.fangzhongdai聚為一類。

A.基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的半夏致病菌系統(tǒng)發(fā)育樹;B. 基于mdh基因序列構(gòu)建的半夏致病菌系統(tǒng)發(fā)育樹。A.Phylogenetic tree of P. ternata pathogen based on 16S rDNA gene sequences; B. Phylogenetic tree of P. ternata pathogen constructed based on mdh gene sequences.圖3 基于16S rDNA和mdh基因構(gòu)建的半夏致病菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of P. ternata constructed by 16S rDNA and mdh gene

mdh引物擴(kuò)增序列比對(duì)結(jié)果表明,HZ-2與軟腐果膠桿菌P.aroidearum聚為一類,序列相似度為99.41%(登錄號(hào)OK340525.1);AG-1與軟腐果膠桿菌P.aroidearum聚為一類,序列相似度為99.60%(登錄號(hào)CP090597.1);HB-5與軟腐果膠桿菌P.aroidearum聚為一類,序列相似度為99.01%(登錄號(hào)MH507330.1);QJ-1與軟腐果膠桿菌P.aroidearum聚為一類,序列相似度為99.24%(登錄號(hào)CP090596.1);HZ-3與軟腐果膠桿菌P.carotovorum聚為一類,序列相似度為98.47%(登錄號(hào)CP045098.1);QS-3與軟腐果膠桿菌P.carotovorum聚為一類,序列相似度為98.12%(登錄號(hào)CP034236.1);TM-1與狄克氏菌D.fangzhongdai聚為一類,序列相似度為99.24%(登錄號(hào)CP080400.1)。基于mdh序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3-B),AG-1、HB-5、HZ-2和QJ-1與NCBI中已報(bào)道的菌株P(guān).aroidearum聚為一類;QS-3和HZ-3與菌株P(guān).carotovorum聚為一類;TM-1與NCBI中已報(bào)道的菌株D.fangzhongdai聚為一類。綜合16S rDNA和mdh分子鑒定,QS-3和HZ-3菌株鑒定為P.carotovorum,AG-1、HB-5、HZ-2和QJ-1菌株鑒定為P.aroidearum,TM-1菌株鑒定為D.fangzhongdai。

2.2.2 分離菌株形態(tài)學(xué)鑒定 從4大半夏主產(chǎn)區(qū)采集的半夏軟腐病樣株中分離得到的3種病原菌菌株形態(tài)基本相同。3種軟腐病致病菌在LB固體培養(yǎng)基上均形成圓形菌落,弧形突起,光滑,灰白略帶黃色(圖4)。

2.3 病原菌的致病性測(cè)定

2.3.1 活體回接 半夏在接種24 h后開始發(fā)病,初期接種植株葉片出現(xiàn)斑點(diǎn)狀燙葉,后斑點(diǎn)逐漸擴(kuò)大,葉片出現(xiàn)水漬樣。接種48 h后植株莖稈出現(xiàn)軟化傾斜,隨著病情的發(fā)展,植株整株倒伏,葉片腐爛,出現(xiàn)惡臭味,最后整株倒伏死亡,地下塊莖出現(xiàn)腐爛(圖5-A、5-B)。從以上活體回接的發(fā)病組織再次分離得到病原菌,經(jīng)形態(tài)鑒定,與田間發(fā)病植株分離的病原菌一致。

A. 半夏活體回接圖,依次為CK、D. fangzhongdai、P. aroidearum、P. carotovorum;B. 3種菌接種后塊莖發(fā)病率;C. 半夏3種菌侵染后塊莖切片。A. In vivo callback diagram of P. ternata: CK, D. fangzhongdai, P. aroidearum, P. carotovorum; B. Incidence of tuber after inoculation of the three bacteria; C. Tuber sections after infection with three species of P. ternata.圖5 不同半夏軟腐病致病菌致病性比較Fig.5 Comparison of pathogenicity of different P. ternata soft rot pathogens

2.3.2 病原菌致病力比較 在沒有對(duì)半夏葉片上創(chuàng)造傷口時(shí),將病原菌接種在半夏葉片正面上,觀察溫度對(duì)病原菌侵染效果的影響(圖6-A)。P.carotovorum在溫度為15～30 ℃時(shí)均有發(fā)病,其中15～20 ℃發(fā)病較緩慢,癥狀較輕,軟腐面積較小,25～30 ℃時(shí)發(fā)病較快,葉片出現(xiàn)深色軟腐狀態(tài),有明顯的惡臭味。表明30 ℃高溫條件與15 ℃低溫條件之間,P.carotovorum致病性具有顯著性差異。在溫度較低時(shí),軟腐菌的致病性較弱,隨著溫度升高,該病原菌的致病性慢慢增強(qiáng)。D.fangzhongdai在20 ℃以下不發(fā)病;在25 ℃時(shí)有發(fā)病現(xiàn)象,接種48 h后開始發(fā)病,發(fā)病后傳染速度較快;30 ℃時(shí),該病原菌的致病性達(dá)到最強(qiáng),12 h即感染,表現(xiàn)出不規(guī)則病斑。表明30 ℃高溫條件與15 ℃低溫條件之間,D.fangzhongdai致病性具有顯著差異。在溫度較低時(shí),軟腐菌沒有表現(xiàn)出致病性,隨著溫度升高,該病原菌的致病性明顯增強(qiáng)。P.carotovorum和D.fangzhongdai發(fā)病后病斑擴(kuò)散速度較快,相同時(shí)間內(nèi),背面接種發(fā)病后的侵染面積大于正面,25 ℃接種后84 h,整片葉片都呈現(xiàn)出病斑,正面葉片沒有出現(xiàn)該情況;D.fangzhongdai沒有表現(xiàn)出致病性(圖6-B)。

A. 不制造傷口的前提下,接種在半夏葉片正面時(shí),溫度對(duì)病原菌致病性的影響;B. 不制造傷口的前提下,半夏背面接種3種病原菌溫度對(duì)病原菌致病性的影響。A. The effect of temperature on the pathogenicity of pathogens when inoculated on the front of P. ternata leaves without creating wounds; B. The effect of temperature on the pathogenicity of three pathogenic bacteria inoculated on the back of P. ternata without creating wounds.圖6 不同溫度下3種病原菌對(duì)半夏葉片侵染程度比較Fig.6 Comparison of the infection degree of P. ternata leaves by three pathogens at different temperatures

P.carotovorum處理組半夏塊莖發(fā)病腐爛情況最嚴(yán)重,部分塊莖已完全腐爛成白色汁液,無法切片,惡臭味強(qiáng)烈;其次是D.fangzhongdai菌,大部分發(fā)病塊莖腐爛軟化嚴(yán)重;P.aroidearum菌處理組發(fā)病較輕,發(fā)病塊莖僅芽頭部分軟化腐爛(圖5-C)。上述結(jié)果表明,P.carotovorum的致病性最強(qiáng),D.fangzhongdai其次,P.aroidearum最弱;D.fangzhongdai的傳染能力最強(qiáng),其次是P.carotovorum。同時(shí)半夏葉片背面更易被半夏軟腐病病原菌侵染。

2.4 病原菌的生物學(xué)特性

2.4.1 溫度對(duì)3種病原菌生長(zhǎng)的影響 3種軟腐病病原菌在15～40 ℃均能生長(zhǎng)。在5～30 ℃,隨著溫度上升,3種病原菌生長(zhǎng)顯著增長(zhǎng),在30 ℃時(shí)生長(zhǎng)最快,5 ℃時(shí)生長(zhǎng)最慢,溫度到達(dá)35 ℃時(shí),3種軟腐病致病菌生長(zhǎng)快速減慢,35 ℃后,3種軟腐病致病菌吸光度逐步降低(圖7-A)。由此可知,高溫和低溫都不利于3種軟腐病致病菌生長(zhǎng),3種軟腐病致病菌的適宜生長(zhǎng)溫度在25～30 ℃。

A. 不同溫度對(duì)3種病原菌生長(zhǎng)的影響;B. 不同pH對(duì)3種病原菌生長(zhǎng)的影響。A. Effect of different temperature on the growth of three pathogens; B. Effects of different pH on the growth of three pathogenic bacteria.圖7 溫度、pH對(duì)3種病原菌的生長(zhǎng)影響Fig.7 Effects of temperature and pH on the growth of the three pathogens

2.4.2 不同pH對(duì)3種病原菌生長(zhǎng)的影響 如圖7-B所示,3種病原菌在pH 4～10均能生長(zhǎng),在pH 2和pH 12時(shí)不能生長(zhǎng),其中pH 8時(shí)生長(zhǎng)最快,當(dāng)pH高于8或低于8時(shí),病原菌的生長(zhǎng)速率均減慢,說明該病原菌在弱堿性環(huán)境下活力更高。對(duì)比3條曲線可以發(fā)現(xiàn),P.aroidearum的活力更旺盛,明顯高于其他兩類菌;P.carotovorum對(duì)堿性環(huán)境更敏感,在強(qiáng)堿性環(huán)境下,生長(zhǎng)速率較其他菌下降更明顯。

2.5 室內(nèi)藥劑篩選結(jié)果

化學(xué)藥劑噻霉酮、40%二氯異腈尿酸鈉和植物源殺菌劑乙蒜素對(duì)3種致病菌產(chǎn)生了較好的抑制效果(表2)。乙蒜素對(duì)D.fangzhongdai菌株的抑制效果最好,達(dá)66.40%;其次是噻霉酮,抑制率達(dá)65.21%;最后是二氯異氰尿酸鈉,其抑制率為48.98%;其余藥劑對(duì)D.fangzhongdai菌株的抑制率均小于48.98%。乙蒜素對(duì)P.aroidearum菌株的抑制效果最好,達(dá)77.83%;其次是噻霉酮,抑制率達(dá)63.09%;最后是二氯異氰尿酸鈉,其抑制率為54.99%;其余藥劑對(duì)P.aroidearum菌株的抑制率均小于54.99%。噻霉酮對(duì)P.carotovorum菌株的抑制效果最好,達(dá)90.41%;其次是乙蒜素,抑制率達(dá)86.81%;最后是二氯異氰尿酸鈉,其抑制率為80.44%;其余藥劑對(duì)P.carotovorum菌株的抑制率均小于80.44%。

表2 不同藥劑對(duì)3種軟腐菌的抑制效果

由表3可知,噻霉酮、二氯異氰尿酸鈉和乙蒜素對(duì)半夏軟腐病致病菌D.fangzhongdai菌株的EC50分別是4.11、2.83和1.51 μg/mL,對(duì)P.aroidearum菌株的EC50分別是4.58、1.65和1.67 μg/mL,對(duì)P.carotovorum菌株的EC50分別是4.12、3.15和1.85 μg/mL。3種供試藥劑對(duì)D.fangzhongdai菌株殺菌毒力依次為乙蒜素>二氯異氰尿酸鈉>噻霉酮,對(duì)P.aroidearum菌株殺菌毒力依次為二氯異氰尿酸鈉>乙蒜素>噻霉酮,對(duì)P.carotovorum菌株殺菌毒力依次為乙蒜素>二氯異氰尿酸鈉>噻霉酮。通過對(duì)毒力回歸方程進(jìn)行比較分析,D.fangzhongdai菌株對(duì)3種殺菌劑的敏感性依次為二氯異氰尿酸鈉>噻霉酮>乙蒜素,P.aroidearum菌株對(duì)3種殺菌劑的敏感性依次為二氯異氰尿酸鈉>噻霉酮>乙蒜素,P.carotovorum菌株對(duì)這3種殺菌劑的敏感性依次為噻霉酮>乙蒜素>二氯異氰尿酸鈉。綜上所述,植物源殺菌劑乙蒜素毒力最強(qiáng),化學(xué)殺菌劑二氯異氰尿酸鈉和噻霉酮毒力較強(qiáng)。

表3 3種供試藥劑對(duì)3種致病菌的毒力方程、EC50及相關(guān)系數(shù)

3 討 論

軟腐病是全球十大經(jīng)濟(jì)作物細(xì)菌病害之一,可隨雨水、土壤在田間傳播,傳播性強(qiáng)。該病是半夏種植生產(chǎn)過程中,導(dǎo)致半夏軟化腐爛的重要細(xì)菌病害,在我國(guó)多個(gè)半夏產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生,防控不及時(shí)會(huì)造成嚴(yán)重?fù)p失。軟腐病主要由果膠桿菌屬(Pectobacterium)和狄克氏菌屬(Dickeya)2個(gè)屬的病原菌株引起,據(jù)報(bào)道該2個(gè)屬病原菌能引起多種寄主植物產(chǎn)生嚴(yán)重的軟腐病,寄主范圍十分廣泛,包括農(nóng)作物、蔬菜、水果、觀賞植物等[14-15],近年來在中藥材上多次報(bào)道,如魔芋、金線蓮等[16-17]。造成細(xì)菌性軟腐病的3種病原菌中,P.carotovorum的寄主范圍最廣且為細(xì)菌性軟腐病主要病原菌,P.aroidearum對(duì)寄主具有特異性且易受到環(huán)境因素影響,更容易感染生長(zhǎng)在寒溫帶的植物,而Dickeya屬對(duì)熱帶和溫帶多種植物具有致病性[18]。本研究于2020年7月至2021年12月對(duì)全國(guó)4大半夏主產(chǎn)區(qū)半夏軟腐病病原菌進(jìn)行收集、分離、鑒定,根據(jù)常規(guī)組織分離法和柯赫氏法則,分離半夏軟腐病病原菌,經(jīng)菌落形態(tài)及16S rDNA序列分析,將半夏軟腐病致病菌鑒定為P.aroidearum、P.carotovorum、D.fangzhongdai。鑒定結(jié)果與已發(fā)表的半夏軟腐病種類及地區(qū)分布一致,其中貴州地區(qū)半夏軟腐病優(yōu)勢(shì)菌群為P.aroidearum[19]、湖北地區(qū)半夏軟腐病優(yōu)勢(shì)致病菌群為D.fangzhongdai[12]、甘肅和河北地區(qū)半夏軟腐病優(yōu)勢(shì)菌群為P.carotovorum。

周佳暖等[20]對(duì)軟腐病病原菌研究發(fā)現(xiàn),P.carotovorum的致病力較強(qiáng)且寄主范圍廣,D.fangzhongdai近年來在越來越多的植物上被發(fā)現(xiàn),該病原菌具有強(qiáng)致病力。Guttman等[21]發(fā)現(xiàn)馬蹄蓮葉片的光滑程度以及葉片構(gòu)造差異對(duì)細(xì)菌附著、定植和滲透有較大關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果同上述結(jié)果基本一致,即P.carotovorum的致病性最強(qiáng),D.fangzhongdai其次,P.aroidearum最弱。在3種病原菌致病力比較實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在未制造傷口時(shí),除P.aroidearum未表現(xiàn)出致病性外,其余P.carotovorum、D.fangzhongdai處理后半夏葉片背面發(fā)病較多,而正面發(fā)病較少,可能由于葉片背面有較多絨毛和氣孔更易附著病原菌,葉片正面則較光滑不易附著病原菌。本研究還發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)3種病原菌最適生長(zhǎng)溫度均為25～30 ℃,與3種病原菌致病力比較結(jié)果一致,P.carotovorum在15～30 ℃時(shí)均有發(fā)病,D.fangzhongdai在25～30 ℃時(shí)發(fā)病, 且2種致病菌均在25～30 ℃時(shí)發(fā)病最為嚴(yán)重。蔣小剛等[22]發(fā)現(xiàn)半夏生長(zhǎng)適宜pH范圍在6.0～7.5。3種病原菌在pH 4～10時(shí)均能生長(zhǎng),其中pH 8時(shí),3種病原菌活力最強(qiáng)?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)土壤pH來降低軟腐病菌活力,減少病害發(fā)生。

目前,半夏軟腐病對(duì)半夏產(chǎn)量和質(zhì)量危害嚴(yán)重,半夏軟腐病病原菌種類多,但市面上未見專門防治半夏軟腐病的藥劑,因此針對(duì)病原菌篩選出高效的防治藥劑對(duì)半夏人工栽培尤為重要。本研究通過多種藥劑的室內(nèi)篩選,發(fā)現(xiàn)化學(xué)殺菌劑中,二氯異氰尿酸鈉和噻霉酮對(duì)半夏軟腐病3種病原菌的EC50值均小于10 μg/mL,在生產(chǎn)上可推廣應(yīng)用。梁歡等[23]在11種殺菌劑對(duì)馬鈴薯軟腐病的防治效果研究結(jié)果表明,3%噻霉酮WP對(duì)馬鈴薯軟腐病的防效最高,為92.50%。植物源殺菌劑對(duì)3種病原菌抑制試驗(yàn)中,乙蒜素對(duì)3種半夏軟腐病病原菌具有顯著的抑制效果,且植物源殺菌劑較化學(xué)殺菌劑具有綠色、高效無殘留的優(yōu)點(diǎn),可作為半夏病害綠色防控使用藥劑。乙蒜素具有廣譜殺菌作用,可以與其他防治藥劑共同配施達(dá)到防治半夏軟腐病的效果,建議在軟腐病發(fā)生前中期與二氯異氰尿酸鈉和噻霉酮配合使用。

4 結(jié) 論

通過對(duì)全國(guó)4個(gè)半夏主產(chǎn)區(qū)的半夏軟腐病進(jìn)行調(diào)查,共鑒定出49株致病菌,隸屬于3種病原菌種類,分別為P.carotovorum、P.aroidearum、D.fangzhongdai。其中D.fangzhongdai菌株僅在湖北產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn),P.carotovorum菌株致病力最強(qiáng)且分布最廣,二氯異氰尿酸鈉、噻霉酮和乙蒜素可共同配施防治半夏軟腐病。本研究基于全國(guó)半夏主產(chǎn)區(qū)的半夏軟腐病調(diào)查,比較了各菌株在不同產(chǎn)地的分布和致病力強(qiáng)弱,篩選了不同致病菌的防治藥劑,并綜合全面地提供了全國(guó)半夏軟腐病菌的相關(guān)信息,為全國(guó)半夏生產(chǎn)提供軟腐病防治指導(dǎo)。