高學(xué)策,張 岱,魏笑薇,楊志輝,朱杰華,韓志校

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,河北 保定 071001;2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)有資產(chǎn)管理處,河北 保定 071001)

【研究意義】馬鈴薯是中國(guó)四大作物之一,因具有抗旱、抗貧瘠以及高用水效率而被廣泛種植。隨時(shí)間推移,由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)引起的馬鈴薯黑痣病發(fā)生逐年加重[1],對(duì)馬鈴薯的產(chǎn)量、品質(zhì)造成了極大影響[2],阻礙了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,甚至有些地區(qū)的發(fā)病率達(dá)70%～80%[3]。目前,化學(xué)防治仍然是最有效的預(yù)防措施,但過度使用化學(xué)藥劑會(huì)導(dǎo)致黑痣病菌抗藥性增加,造成大量的農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染[4]。因此,迫切需要尋求一種安全有效的防控方法。生物防治具有安全、高效、綠色、環(huán)保等特點(diǎn),應(yīng)用前景十分廣闊[5-6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】芽胞桿菌作為一種應(yīng)用廣泛的微生物資源,在研究中備受關(guān)注[7-8]。芽胞桿菌抗病機(jī)制多樣,其中,抗生作用作為最重要的抗病機(jī)制之一,芽胞桿菌通過分泌大量具有抗菌作用的次級(jí)代謝物來抑制多種病原菌的生長(zhǎng)。目前,關(guān)于芽胞桿菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究主要包括脂肽類化合物、抗菌蛋白和揮發(fā)性物質(zhì)等[9-11]。脂肽類化合物具有廣譜抗性,能與傳統(tǒng)抗生素協(xié)同作用[12]。姚博等[13]從解淀粉芽胞桿菌JK10發(fā)酵液檢測(cè)得到脂肽類化合物BacillomycinD和Fengycin、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素DivergolideD和聚酮類化合物Bacillaene,揭示了JK10防治藍(lán)莓根癌病的生防機(jī)制。揮發(fā)性有機(jī)物(Volatile organic compounds, VOCs)是微生物產(chǎn)生的一類分子量低(<300 Da)的化合物[14],是芽胞桿菌起拮抗作用的關(guān)鍵活性物質(zhì),目前已有很多關(guān)于VOCs抑菌作用及機(jī)制的報(bào)道。解淀粉芽胞桿菌XJ5釋放的VOCs能夠很好地拮抗蘋果褐腐病菌(Moniliniafructigena)等多種病原真菌,抑菌率為47.9%～84.8%[15]。梁艷瓊等[16]發(fā)現(xiàn)菌株Czk1釋放的VOCs能夠抑制橡膠樹炭疽病菌孢子萌發(fā),所產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)組分包括碳?xì)浠衔铩奉?、醇類、酮類?3種揮發(fā)性物質(zhì)。植物病原真菌細(xì)胞壁主要成分是幾丁質(zhì)、β-1,3-葡聚糖和纖維素,芽胞桿菌在生長(zhǎng)過程中可產(chǎn)生溶菌酶,溶解病原菌菌絲,使其菌絲斷裂、原生質(zhì)體凝結(jié)或細(xì)胞質(zhì)消解,從而抑制病原菌菌絲的生長(zhǎng)[17-18]。要雅倩等[19]篩選出一株對(duì)桃樹根腐病有拮抗效果的解淀粉芽胞桿菌T-6,該菌株具備產(chǎn)蛋白酶、幾丁質(zhì)酶與溶磷、解磷和解鉀的能力?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前,從抗菌肽、溶菌酶、揮發(fā)性物質(zhì)出發(fā),全面系統(tǒng)研究芽胞桿菌次級(jí)代謝物對(duì)黑痣病菌的影響相關(guān)報(bào)道較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以篩選得到的優(yōu)良生防菌株G32為研究對(duì)象,從芽胞桿菌分泌的多種次級(jí)代謝產(chǎn)物為切入點(diǎn),全面鑒定其所產(chǎn)生的抗菌肽、揮發(fā)性物質(zhì)和溶菌酶等抗菌活性,系統(tǒng)分析各次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)馬鈴薯黑痣病菌拮抗作用,豐富生防菌種資源,為新型生防菌劑的開發(fā)提供理論依據(jù),且系統(tǒng)明確了菌株G32 3種不同種類的抑菌物質(zhì)的活性成分,為抑菌物質(zhì)的協(xié)同增效作用提供了應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤 采自河北省保定市河北農(nóng)業(yè)大學(xué)三分廠試驗(yàn)基地(115.41604 E,38.809678 N)。

1.1.2 供試菌株 病原菌馬鈴薯黑痣病菌(R.solani)AG-3融合群,由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯病害實(shí)驗(yàn)室提供,芽胞桿菌菌株G32由本試驗(yàn)分離獲得。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 采用PDA、LB、LBA、酪蛋白、果膠、纖維素、幾丁質(zhì)和淀粉培養(yǎng)基[20]。

1.2 方法

1.2.1 芽胞桿菌的分離和篩選 使用五點(diǎn)取樣法采集馬鈴薯植株根際土壤,土壤稀釋法進(jìn)行菌株分離純化[21]。拮抗菌株發(fā)酵液的制備按照李揚(yáng)凡等[3]的方法制備種子液和發(fā)酵液。拮抗菌株的篩選采用生長(zhǎng)速率法[20]篩選出馬鈴薯黑痣病菌抑菌效果好的生防芽胞桿菌。

1.2.2 菌株G32鑒定菌株G32形態(tài)學(xué)鑒定 將G32菌液涂布于LB平板上,37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落的形態(tài)特征,使用革蘭氏染色法鑒定菌株類型[22]。gyrB序列測(cè)定及分析:以G32菌株基因組DNA為模板,選用引物gyrB-F(5’-TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT-3’)和gyrB-R(5’-TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC-3’)擴(kuò)增gyrB基因,將PCR產(chǎn)物送往上海生工測(cè)序。使用NCBI對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析,采用MEGA 6.0軟件使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株G32次級(jí)代謝產(chǎn)物抑菌活性測(cè)定 脂肽類物質(zhì):采用酸沉淀法提取脂肽粗提物,采用小杯法檢測(cè)脂肽類抑菌物質(zhì)對(duì)馬鈴薯黑痣病菌的抑菌作用,具體方法為:配制粗提液濃度為100、50、25、12.5 mg/mL,以甲醇為對(duì)照,加藥量為100 μL,25 ℃黑暗培養(yǎng)至對(duì)照長(zhǎng)滿全皿,測(cè)量抑菌帶寬度,使用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲形態(tài)并拍照。

揮發(fā)性化合物:采用雙皿對(duì)扣法測(cè)定揮發(fā)性氣體對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌作用[23]。用LB液將搖好的菌液稀釋成1×108、1×106和1×104cfu/mL,一組培養(yǎng)皿中倒入PDA培養(yǎng)基,另一組添加LB培養(yǎng)基。將打好的馬鈴薯黑痣病菌菌餅接入PDA板中央,LB板接不同濃度梯度的菌液,將PDA板與LB板對(duì)扣,封口膜密封,25 ℃培養(yǎng),重復(fù)3次,以無菌水為空白對(duì)照。當(dāng)對(duì)照組菌絲長(zhǎng)至全皿測(cè)量菌落直徑,光學(xué)顯微鏡下觀察馬鈴薯黑痣病菌絲形態(tài)。

1.2.4 菌株G32次級(jí)代謝產(chǎn)物的鑒定 菌株G32脂肽類物質(zhì)合成基因的擴(kuò)增:產(chǎn)脂肽基因合成sfp、ituA、fenB、bacD、mycB5個(gè)目的基因的引物(表1),以芽胞桿菌菌株G32的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增[20]。

表1 產(chǎn)脂肽目的基因的引物

關(guān)于菌株G32揮發(fā)性物質(zhì)的收集與GC-MS檢測(cè),樣品前處理:準(zhǔn)確量取 5.0 mL菌液于20 mL頂空瓶中,將DVB/CAR/PDMS萃取頭萃取,于50 ℃平衡30 min,萃取40 min,解析5 min。氣相色譜條件:一維色譜柱HP-innowax (30 m×0.25 mm×0.25 μm);二維色譜柱DB17-MS(1.2 m×0.18 mm×0.18 μm); 升溫程序:初溫50 ℃,4 ℃/min 升至240 ℃,240 ℃保持10 min; 進(jìn)樣口250 ℃,分流比40.0 mL/min。質(zhì)譜條件: EI 70 eV,離子源230 ℃。四級(jí)桿150 ℃。質(zhì)子掃描范圍(m/z)40～550。GC-MS所得質(zhì)譜圖經(jīng)NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析,選取相對(duì)峰面積大于1%及保留指數(shù)大于800的組分進(jìn)行成份動(dòng)態(tài)分析。

菌株G32蛋白酶類分析:取活化的G32菌液5 μL分別接種到生防因子測(cè)定培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)48 h,觀察是否有透明圈產(chǎn)生,重復(fù)3次,拍照并記錄[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選與鑒定

從采集的土樣中篩選得到50株菌株,其中,有11株芽胞桿菌對(duì)馬鈴薯黑痣病菌拮抗效果好,抑菌帶均>12.28 mm;其中,G32菌株對(duì)馬鈴薯黑痣病菌的抑菌作用最強(qiáng),抑菌帶為20.68 mm(圖1-A)。由圖1-B可知,菌株G32對(duì)黑痣病菌菌絲有致畸作用。對(duì)照組黑痣病菌絲形態(tài)表面光滑,呈直角分枝;發(fā)酵液處理后的菌絲畸形嚴(yán)重,菌絲節(jié)間變粗縮短,出現(xiàn)彎曲,局部腫大形成囊泡。

A. G32發(fā)酵液對(duì)黑痣病菌菌落生長(zhǎng)的影響;B. G32發(fā)酵液對(duì)黑痣病菌菌絲形態(tài)的影響。A. Effect of G32 fermentation broth on colony growth of R.solani; B. Effect of G32 fermentation broth on mycelial morphology of R.solani.圖1 對(duì)峙培養(yǎng)中G32發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯黑痣病菌的抑制作用Fig.1 Inhibition of G32 fermentation broth on R.solani in confrontation culture

在LB平板上培養(yǎng)24 h后,菌株G32形成近圓形且具有乳白色菌膜的菌落,菌落表面有凹陷的褶皺,邊緣不規(guī)則(圖2-A)。革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性菌(圖2-B)。

A. 菌落形態(tài);B. 革蘭氏染色形態(tài)特征。A. Colony morphology; B. Gram stain morphology.圖2 菌株G32菌落形態(tài)和革蘭氏染色形態(tài)Fig.2 Colony morphology and gram stain morphology of strain G32

對(duì)G32菌株的gyrB序列擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列比對(duì),gyrB序列與B.amyloliquefaciensstrain 3-5等聚為一支(圖3),相似度為99%,結(jié)合菌株G32的形態(tài)特征,將菌株G32鑒定為解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)。

圖3 基于gyrB序列構(gòu)建G32菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree for strain G32 based on gyrB gene sequences

2.2 菌株G32次級(jí)代謝產(chǎn)物的抑菌活性

2.2.1 脂肽類物質(zhì)的抑菌作用 利用酸沉淀法分理出脂肽類物質(zhì),并研究其對(duì)馬鈴薯黑痣病菌的拮抗作用。脂肽提取物濃度100、50、25、12.5 mg/mL,其抑菌圈直徑分別為10.72、9.89、8.38、8.05 mm(圖4-A)。光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),對(duì)照組中馬鈴薯黑痣病菌絲生長(zhǎng)正常,形態(tài)均勻,呈直角狀分枝(圖4-B);經(jīng)脂肽提取物處理后,菌絲出現(xiàn)畸形膨大、菌絲粘連等現(xiàn)象。

A. 不同濃度脂肽提取物對(duì)黑痣病菌菌落生長(zhǎng)的抑制;B. 脂肽類物質(zhì)對(duì)黑痣病菌菌絲的形態(tài)影響。A. Inhibition of colony growth of R.solani in different concentrations of lipopeptide extract; B. Mycelial micrographs of R.solani treated with lipopeptide extract.圖4 菌株G32脂肽提取物對(duì)黑痣病菌的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of strain G32 lipopeptide on R.solani

2.2.2 菌株G32揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)馬鈴薯黑痣病菌的拮抗作用 菌株G32產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)馬鈴薯黑痣病菌生長(zhǎng)有顯著的抑制作用(P<0.05)。當(dāng)菌液濃度分別為1×104、1×106、1×108cfu/mL時(shí),抑菌率分別為42.64%、56.78%、66.31%(圖5-A)。由圖5-B可知,對(duì)照組黑痣病菌絲生長(zhǎng)正常,形態(tài)均勻,直角分枝明顯;而經(jīng)G32產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)處理后,菌絲雜亂,局部膨大。

A. 不同濃度發(fā)酵液產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)黑痣病菌菌落生長(zhǎng)的抑制;B. 揮發(fā)性物質(zhì)處理后黑痣病菌的菌絲形態(tài)。A. Inhibition of volatiles produced by different concentrations of fermentation broth on the growth of colonies of R.solani; B. Mycelia micrographs of R.solani treated with volatiles.圖5 菌株G32揮發(fā)性氣體對(duì)馬鈴薯黑痣病菌的抑制作用Fig.5 Effect of volatiles produced by strain G32 on the growth of R.solani

2.3 菌株G32次級(jí)代謝產(chǎn)物的鑒定

2.3.1 菌株G32脂肽類物質(zhì)分析 使用PCR技術(shù)擴(kuò)增5個(gè)脂肽類合成基因,將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳,有4對(duì)引物分別擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶(圖6),分別是sfp(675 bp)、ituA(1150 bp)、bacD(540 bp)和mycB(2024 bp)基因,未擴(kuò)增到fenB的目的條帶。結(jié)果表明,G32可產(chǎn)生脂肽類物質(zhì)Sufactins、IturinA、BacillomycinD、Mycosubtilin。

泳道:M. DM2000 marker; 1. sfp;2. ituA;3. fenB;4. bacD;5. mycB。Track:M. DM2000 marker; 1. sfp;2. ituA;3. fenB;4. bacD;5. mycB.圖6 菌株G32脂肽合成基因的PCR產(chǎn)物電泳Fig.6 PCR product electrophoresis of strain G32 lipopeptide synthesis gene

2.3.2 菌株G32揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS鑒定 VOCs成分檢測(cè)結(jié)果表明,G32共產(chǎn)生13種揮發(fā)性物質(zhì)(圖7,表2),主要包括酮類4種、醇類5種、芳香族類2種、醚類1種和有機(jī)酸類1種,含量依次為69.73%、23.97%、2.95%、2.21%和1.14%。其中,酮類和醇類為其主要物質(zhì),3-羥基-2-丁酮含量最高,為48.90%,其次是2-壬酮(11.33%)和正辛醇(10.84%)。

A. 5類揮發(fā)性有機(jī)化合物的峰值面積;B. 各揮發(fā)性有機(jī)化合物的相對(duì)含量。A. Peak area of five identified classes of VOCs from G32; B. The relative content of volatile organic compounds released by strain G32.圖7 基于GC-MS數(shù)據(jù)峰面積的菌株G32釋放的揮發(fā)性有機(jī)化合物的相對(duì)含量Fig.7 The relative content of identified volatile organic compounds released by strain G32 based on the peak area of GC-MS data

表2 菌株G32釋放的揮發(fā)性有機(jī)化合物

2.3.3 菌株G32產(chǎn)細(xì)胞壁水解酶活性 采用透明圈法,測(cè)定菌株G32胞外酶活性,如圖8所示,在剛果紅纖維素培養(yǎng)基上接種G32后能看見邊緣清晰的酶解圈,說明菌株G32具有降解纖維素的能力,可產(chǎn)生纖維素酶,無產(chǎn)蛋白酶、果膠酶、幾丁質(zhì)酶作用。

A. 蛋白酶;B. 纖維素酶;C. 果膠酶;D. 幾丁質(zhì)酶。A. Protease; B. Cellulase; C. Pectinase; D. Chitinase.圖8 菌株G32產(chǎn)酶活性分析Fig.8 Analysis of enzyme production activity of strain G32

3 討 論

國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)芽胞桿菌拮抗植物病原真菌的主要機(jī)制之一為抗生作用[25],芽胞桿菌可產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物起抑菌作用,從而達(dá)到生防目的[26]。其中,脂肽類抗生素是芽胞桿菌產(chǎn)生的一種重要的抑菌活性物質(zhì)。本研究在篩選到的生防枯草芽胞桿菌G32中,檢測(cè)到sfp、ituA、mycB、bacD等脂肽合成基因,說明生防菌G32可產(chǎn)生多種抗菌肽發(fā)揮其生防效果,如Sufactins、IturinA、BacillomycinD、Mycosubtilin。這些脂肽類抗生素已在多項(xiàng)研究中報(bào)道其抑菌活性,萎縮芽胞桿菌QHZ-3菌株可分泌Surfactin、Iturin和Fengycin 3種脂肽類抗生素,能夠顯著降低土壤中立枯絲核菌的含量[27]。解淀粉芽胞桿菌fqhm-13主要抑菌物質(zhì)為SurfactinA和IturinA[28]。

利用微生物產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物進(jìn)行生物熏蒸防治病害,具有廣泛的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。已有相關(guān)研究表明芽胞桿菌可產(chǎn)生多種mVOCs,且抑菌譜非常廣[29],B.amyloliquefaciensL3可以產(chǎn)生多種VOCs,其中,2-庚酮、2-乙基-1-己烷和2-壬酮完全抑制西瓜枯萎病的生長(zhǎng)[30]?？莶菅堪麠U菌Y13產(chǎn)生VOCs對(duì)果生炭疽菌(Colletotrichumfructicola)等10種植物病原菌具有抑菌活性,抑菌率在19.2%～83.9%[31]。本研究采用全二維相色譜質(zhì)譜法對(duì)G32菌株揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定,可獲得更高的靈敏度和分辨率,對(duì)于復(fù)雜樣品例如同分異構(gòu)體和雜化物的分離也有更好的效果[32],其產(chǎn)生的VOCs類型為酮類、醇類、芳香族類等,其中2-壬酮、苯乙酮等已被證實(shí)有抑菌活性。由解淀粉芽胞桿菌JB68株產(chǎn)生2-壬酮對(duì)茶炭疽病抑菌率為84.51%[33],貝萊斯芽胞桿菌C16產(chǎn)生苯乙酮可完全抑制對(duì)早疫病菌生長(zhǎng)[34]。

此外,芽胞桿菌還可以通過生防因子來抑制病原菌,B.subtilisXC-1菌株具有產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶的能力,酶能降解病原菌細(xì)胞壁,破壞菌絲結(jié)構(gòu),從而降低病原菌存活率[35];B.subtilisBS193分泌的蛋白酶和纖維素酶可以破壞疫霉菌的細(xì)胞壁,抑制菌絲生長(zhǎng)和游動(dòng)孢子產(chǎn)生[36]。本研究分離得到的解淀粉芽胞桿菌G32菌株具有產(chǎn)生纖維素的能力,破壞菌絲形態(tài),與上述研究結(jié)果一致。

本研究分離得到的解淀粉芽胞桿菌G32在馬鈴薯黑痣病生物防治中具有開發(fā)利用潛力,但有關(guān)其生防機(jī)制和抑菌機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究篩選獲得了對(duì)馬鈴薯黑痣病具有良好拮抗效果的解淀粉芽胞桿菌G32,其可分泌多種次級(jí)代謝產(chǎn)物,包括抗菌肽、揮發(fā)性有機(jī)物和溶菌酶。脂肽類粗提物和揮發(fā)性有機(jī)物均能夠抑制黑痣病菌生長(zhǎng),且使菌絲產(chǎn)生畸形;對(duì)菌株G32次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定,該菌株主要產(chǎn)生Sufactins、IturinA、BacillomycinD、Mycosubtilin 4種脂肽類抗生素,產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物包括酮類、醇類、芳香族類、醚類、有機(jī)酸類等5類13種,其中3-羥基-2-丁酮、2-壬酮和正辛醇為其主要成分,占比48.90%、11.33%和10.84%;該菌株可分泌纖維素酶,能夠破壞病原菌細(xì)胞壁,達(dá)到抑制菌絲生長(zhǎng)的效果。