徐志婷,許玲玲, 2,薛龍海

(1. 蘭州大學(xué)草地微生物研究中心,蘭州 730000;2. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院,北京 100080)

【研究意義】多花黑麥草(Loliummultiflorum)是禾本科黑麥草屬的一種優(yōu)良牧草,我國(guó)主要種植在長(zhǎng)江流域以南的地區(qū)。其產(chǎn)量高、適口性好、生長(zhǎng)速度快,因此作為南方畜牧業(yè)首選的牧草之一[1]。除此之外,多花黑麥草也可進(jìn)行青貯,彌補(bǔ)我國(guó)南方冬春季青飼草的不足[2]。附球菌屬(Epicoccum)是重要的植物病原真菌,其歸屬于子囊菌門(Ascomycota)、亞隔孢殼科(Didymellaceae),可侵染農(nóng)作物、林木、經(jīng)濟(jì)作物等,造成植物葉斑、幼苗和果實(shí)腐爛[3-8],發(fā)病嚴(yán)重時(shí),可造成作物產(chǎn)量下降20%～35%[3]。【前人研究進(jìn)展】Epicoccum的寄主范圍很廣泛,可引發(fā)多種植物病癥。其屬內(nèi)的黑附球菌(E.nigrum) 對(duì)小麥(Triticumaestivum)[9]、甜瓜(Cucumismelo)[10-11]和玉米(Zeamays)[12]等植物都表現(xiàn)出一定的致病力。 據(jù)報(bào)道,黑附球菌在津巴布韋引起棉花(Gossypiumhirsutum)[13]病害,在日本造成水稻穎殼上的病斑[14];冬青被黑附球菌侵染后,會(huì)造成葉片脫落、果實(shí)腐爛和變小,最終壞死。Gupta等[15]報(bào)道了一種附球菌,引起了重要的豆科栽培牧草埃及車軸草(Trifoliumalexandrinum)的葉斑病。在我國(guó),也從茶樹(Camelliasinensis)上分離得到了3種不同的附球菌(E.camelliae、E.layuense和E.sorghinum),葉部病害的發(fā)生嚴(yán)重影響了茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[4,16]。附球菌在多花黑麥草上普遍發(fā)生,但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)多花黑麥草上的附球菌屬病原真菌研究極少,僅在部分禾草上有相關(guān)研究。Wiewióra等[17]曾從黑麥草種子中分離到黑附球菌E.nigrum,在巴西曾報(bào)道過E.sorghinum引起雀稗屬(Paspalumguenoarum)植物葉斑病,導(dǎo)致50%葉面積被病斑覆蓋[18];在美國(guó),從鴨茅(Dactylisglomerata)種子中分離到E.nigrum[19];E.plurivorum自新西蘭狗尾草(Setariasp.)分離得到[20];在澳大利亞發(fā)現(xiàn)E.viticis會(huì)對(duì)澳大利亞的非洲須芒草(Andropogongayanus)造成一定程度的危害[4]。在我國(guó),由E.sorghinum引起的馬唐(Digitariasanguinalis)褐斑病的田間葉片發(fā)病率高達(dá)70%以上[21];燕麥(Avenasativa)作為飼用作物在我國(guó)北方地區(qū)和西北地區(qū)大面積種植,由E.layuense引發(fā)褐斑病的發(fā)生極大地影響了其產(chǎn)量和品質(zhì)[8]。分子標(biāo)記技術(shù)根據(jù)DNA序列差異直觀地反映遺傳多樣性,包括以Southern雜交技術(shù)為核心的分子標(biāo)記技術(shù)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、以PCR技術(shù)為核心的標(biāo)記技術(shù),如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間(ISSR)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)、序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)以及DNA芯片為核心的三代分子標(biāo)記技術(shù)[22]。其中,ISSR標(biāo)記操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、多態(tài)性強(qiáng),因此在植物病原菌的分類、親緣關(guān)系和遺傳多樣性等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。比如煙草鐮刀菌根腐病菌[23]、蘋果腐爛病[24]、煙草赤星病[25]、桑褐斑殼豐孢菌[26]和桑毛色二孢根腐病[27]。【本研究切入點(diǎn)】很多研究已表明附球菌可以導(dǎo)致多種作物病害,但國(guó)內(nèi)外對(duì)附球菌遺傳多樣性的相關(guān)研究相對(duì)匱乏,尤其是多花黑麥草上的病原附球菌。本研究基于ISSR標(biāo)記研究多花黑麥草附球菌遺傳多樣性,為多花黑麥草附球菌病害的病原多樣性研究提供理論意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以貴州、云南、重慶和四川等地的黑麥草葉片上分離的37株附球菌為研究對(duì)象,通過采用ISSR分子標(biāo)記分析5個(gè)不同地理來源Epicoccum菌株的遺傳多樣性,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育聚類圖并進(jìn)行主成分分析,探究病原菌菌株的遺傳分化規(guī)律是否與菌株的地理來源有關(guān),以期從分子水平解析附球菌屬真菌的種內(nèi)是否存在與地理相關(guān)的遺傳分化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 2021—2022年從貴州花溪、云南曲靖、四川崇州和重慶南川、合川5個(gè)地區(qū)采集典型多花黑麥草葉斑病病樣,經(jīng)分離和純化后,進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和DNA測(cè)序,通過引物ITS、TUB2、RPB2和LSU,篩選了93株附球菌菌株,從中選出37株代表性菌株,菌株的詳細(xì)信息見表1。

表1 供試菌株信息

1.2 方法

1.2.1 附球菌的分離 采用組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離。采集發(fā)病的多花黑麥草葉片,在病健交界處用無菌剪刀剪取5 mm×5 mm的小塊,先在75%酒精中消毒30 s,再用無菌水沖洗3次,置于滅菌濾紙上風(fēng)干后,平鋪至PDA培養(yǎng)基,置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。待葉片組織長(zhǎng)出少量菌絲時(shí),挑取菌落邊緣的菌絲至PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行多次純化。

1.2.2 DNA提取 采用Omega真菌 DNA 提取試劑盒提取病原真菌DNA,提取具體方法參照試劑盒說明書進(jìn)行,DNA濃度的檢測(cè)通過Promega-NanoDrop超微量分光光度計(jì)(Thermo公司,美國(guó))進(jìn)行,使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查質(zhì)量,合格的DNA(>30 ηg/μL)進(jìn)行稀釋后置于-20 ℃條件下備用。

1.2.3 ISSR-PCR反應(yīng) 35條引物選自加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的100條ISSR引物序列,合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。初步的篩選主要是使用35條引物對(duì)不同地區(qū)的8株菌株DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增,以篩選出條帶多。多態(tài)性及重復(fù)性好的引物,再用得到的引物對(duì)37株附球菌菌株進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增分析。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括:12.5 μL 2×SanTaqPCR Mix, 9.5 μL ddH2O,上下引物各1 μL (10 μmol/L), DNA模板1～2 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,退火溫度50～60 ℃(退火溫度根據(jù)引物設(shè)定),退火時(shí)間30 s,72 ℃延伸50 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)之后,利用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.4 ISSR數(shù)據(jù)分析 從加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的ISSR引物序列中隨機(jī)選擇35條引物先對(duì)8株菌株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,從中選擇擴(kuò)增條帶數(shù)量多、條帶清晰的引物,之后對(duì)所有供試菌株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,對(duì)特定大小的擴(kuò)增片段,根據(jù)條帶的有無分別記為1和0,對(duì)所得二進(jìn)制矩陣進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用NTSYSpc(Version 2.10e)對(duì)不同菌株之間遺傳相似系數(shù)進(jìn)行計(jì)算,通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育聚類圖進(jìn)行聚類相關(guān)分析;利用PopGene(Version 1.32)對(duì)不同地理來源菌株的遺傳分化水平進(jìn)行分析[25];將二進(jìn)制矩陣整理成GenAIEx6.51軟件可識(shí)別數(shù)據(jù)格式,計(jì)算遺傳距離,基于遺傳距離進(jìn)行主成分分析(PCoA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選和ISSR擴(kuò)增

通過使用35條ISSR引物對(duì)8個(gè)DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增,篩選出12條引物,這些引物具有較好的多態(tài)性。進(jìn)一步篩選后,得到6條重復(fù)性較好。多態(tài)性條帶較多的引物(表2)。篩選出的6條引物共擴(kuò)增出62條譜帶,各引物的擴(kuò)增條帶數(shù)為8～15,擴(kuò)增片段大小為 250～1000 bp,所有引物均表現(xiàn)出較高的擴(kuò)增多態(tài)性,引物ISSR4擴(kuò)增的條帶數(shù)最多(圖1)。

M:DNA標(biāo)記;1:92-31;2:chuan18;3:chuanhei4;4:chuanhei7;5:ch1-12;6:chuanhei3;7:chuan17;8:CQ-5;9:cd-3;10:ch2-13;11:KM34;12:ch2-8;13:chuan16;14:92-30;15:91-15;16:ch1p-3;17:KM37;18:KM24;19:KM41;20:KM39;21:KM27;22:KM28;23:ch2-7;24:ch1-7;25:chuanhei5;26:91-10;27:KM53;28:ch2-12;29:KM52;30:91-12;31:KM33;32:ch2-11;33:ch2-10;34:chuan14;35:chuanhei9;36:chuan13;37:ch1p-6。圖1 引物ISSR4的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplifying result of the primer ISSR4

表2 6條ISSR引物擴(kuò)增的條帶數(shù)

2.2 ISSR標(biāo)記的菌株聚類分析

由圖2可知,不同地理來源的附球菌菌株遺傳相似系數(shù)在0.3100～0.9300。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為 0.4180時(shí),37株附球菌被劃分為5個(gè)類群,這5個(gè)類群分別代表不同的附球菌菌種,說明ISSR類群劃分與菌種分類之間存在一定的相關(guān)性。其次除E.plurivorum種群之外,E.layuense、E.mackenziei、E.draconis和E.endophyticum種群包含來自不同地理來源的菌株。E.layuense菌株在重慶、貴州、云南和成都4個(gè)地區(qū)都有分布,E.plurivorum菌株主要來自云南地區(qū)。聚類分析結(jié)果顯示,E.endophyticum菌群和E.mackenziei菌群親緣關(guān)系較近,E.layuense菌群、E.draconis菌群和E.plurivorum菌群親緣關(guān)系較近。E.layuense種群內(nèi)的遺傳分化與地理來源未發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)性。

圖2 37株菌株的UPGMA聚類分析Fig.2 UPGMA cluster analysis of 37 Epicoccum isolates

2.3 ISSR標(biāo)記的菌株居群遺傳分化

利用PopGene進(jìn)行計(jì)算,得出各居群的遺傳距離(D)和Neis遺傳一致度(IN)。研究結(jié)果(表3)表明,5個(gè)居群的遺傳一致度介于0.8863～0.9478,平均值為0.9168;遺傳距離在0. 0536～0.1207,平均0.0871。5個(gè)居群中,曲靖居群(KM-)的Epicoccum菌株群體和合川居群(ch1-)的Epicoccum菌株群體的遺傳距離最長(zhǎng)(D為0.1207),遺傳一致度最低(IN為0.8863),表示這2個(gè)居群間的遺傳分化程度最高,親緣關(guān)系較遠(yuǎn);而花溪(91-;92-)居群的Epicoccum菌株群體和崇州居群(川-;川黑-)的Epicoccum菌株群體遺傳一致度最高(IN為0.9478),遺傳距離最短(D為 0.0536),表示這2個(gè)居群間的遺傳分化程度最低,親緣關(guān)系較近。

表3 Epicoccum菌株5個(gè)居群的Neis遺傳一致度和遺傳距離

2.4 ISSR標(biāo)記的菌株群體多樣性

由表4可知,通過PopGene計(jì)算5個(gè)群體的遺傳多樣性參數(shù),得出5個(gè)居群的平均多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(Pl)為51.00個(gè),平均多態(tài)位點(diǎn)百分率(Ppl)為80.95%,平均觀察等位基因數(shù)(Na)為1.8095,平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.5407,平均基因多樣性指數(shù)(H)為0.3121,平均Shannon’s 信息指數(shù)(I)為0.4606。具體而言,崇州居群的Pl最多,至58.00個(gè),Ppl為92.06%;合川居群和曲靖居群的Pl和Ppl最低。居群內(nèi)的遺傳多樣性以崇州居群的菌株最高,其I為0.5306,曲靖居群的I最低,為0.4293。

表4 Epicoccum菌株5個(gè)居群的遺傳多樣性水平

由表5可知,37株供試菌株在種水平上的Na為2.0000,Ne為1.6305,H為0.3628,I為0.5388,菌株的總雜合度Ht平均為0.3583,種水平遺傳雜合度Hs為0.3121,遺傳分化系數(shù)Gst為0.1289,基因流Nm為3.3794。通過分析表4～5的結(jié)果可知,居群間的H和I低于居群內(nèi)的H和I,表明居群內(nèi)的遺傳分化程度相較于居群間較高。

表5 37株Epicoccum菌株的遺傳多樣性水平

2.5 PCoA分析

PCoA分析是基于ISSR數(shù)據(jù)獲得的遺傳距離得出。在PCoA分析中,不同地理來源的菌株隨機(jī)分布(圖3),未觀察到個(gè)體的分組,居群(pop1和pop4)相交但又有差異,在遺傳多樣性和菌株的地理起源之間沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。

pop1:貴州花溪;pop2:重慶合川;pop3:云南曲靖;pop4:重慶南川;pop5:四川崇州。pop1:Huaxi;pop2:Hechuan;pop3:Qujing;pop4:Nanchuan;pop5:Chongzhou.圖3 基于ISSR顯示Epicoccum分布的主成分分析(PCoA)Fig.3 Distribution of Epicoccum isolates revealed by principal coordinates analysis (PCoA) based on ISSR

3 討 論

DNA分析技術(shù)在真菌的遺傳多樣性方面被廣泛應(yīng)用,其中ISSR分子標(biāo)記技術(shù)穩(wěn)定性高、多態(tài)性豐富,在Fusarium、Valsa、Alternata、Phloeospora和Lasiodiplodia等病原菌的遺傳多樣性研究中具有顯著優(yōu)勢(shì)。本文基于ISSR標(biāo)記方法分析5個(gè)不同地理來源的群體遺傳多樣性,擴(kuò)增得到多態(tài)性條帶63條,多態(tài)率達(dá)100%。

研究發(fā)現(xiàn),部分真菌菌株的遺傳多樣性與菌株的地理來源有一定聯(lián)系,但大部分真菌的遺傳多樣性與菌株的地理來源間不具相關(guān)性。例如,龍瓏[28]以葉點(diǎn)霉屬和莖點(diǎn)霉屬30個(gè)分離菌株為供試材料,應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記手段對(duì)兩屬真菌進(jìn)行系統(tǒng)分類學(xué)研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉點(diǎn)霉屬的分類與地理來源之間未表現(xiàn)出相關(guān)性;王興紅[29]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析來自國(guó)內(nèi)柑橘主產(chǎn)區(qū)和國(guó)外收集的135株葉點(diǎn)霉屬(Phyllostictaspp.)菌株的遺傳多樣性,未發(fā)現(xiàn)葉點(diǎn)霉的遺傳變異與地理分布明顯相關(guān)。在本研究中,曲靖類群和合川類群的地理距離最遠(yuǎn),遺傳一致度最低,E.plurivorum類群的地理來源相同,聚類分析中菌株聚在同一分支,但不同地理來源的E.layuense菌株聚在一支,即同一地區(qū)的菌株可聚到不同的分支。來源于西南4省的37株附球菌菌株被劃分為5個(gè)居群,PCoA結(jié)果顯示,菌株的劃分與地理來源無關(guān),不同地理來源的菌株沒有分組,結(jié)果表明菌株的遺傳分化水平與地理來源沒有顯著相關(guān)性,這與上述研究結(jié)果相似。

本研究ISSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)顯示菌株間的遺傳分化水平顯著低于居群間的遺傳分化水平,這可能與不同地區(qū)的地理、生態(tài)和氣候環(huán)境有關(guān),崇州居群的遺傳多樣性最高,可能與該地種植品種較多有關(guān),主要有川農(nóng)1號(hào)、安第斯、杰威、長(zhǎng)江2號(hào)等。當(dāng)遺傳變異數(shù)(Gst)值低于0.15時(shí),遺傳分化主要體現(xiàn)在群體間[20],基因交流值(Nm)為3.3794,進(jìn)一步說明群體間的遺傳變異程度相較于群體內(nèi)高。雖然PopGene結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)不同居群間遺傳變異程度較高,但總體而言,群體間的遺傳相似度較高,這可能是由于5個(gè)地區(qū)種植的多花黑麥草品種較為相似。由于本研究中分離到的菌株數(shù)量有限,可能無法全面反映多花黑麥草上附球菌種群內(nèi)的遺傳變異,因此需進(jìn)一步收集大量菌株,以研究其種群內(nèi)的遺傳變異情況,為多花黑麥草葉斑病的防控提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

多花黑麥草上分離到的附球菌菌株多態(tài)性高,ISSR類群劃分與菌種分類結(jié)果一致,居群間的遺傳多樣性高于菌株間的遺傳多樣性,菌株的地理來源與其遺傳多樣性之間不存在相關(guān)性。