黃 娟,高利軍,李經(jīng)成,周維永,鄧國富,潘英華,卿冬進(jìn),陳韋韋,伍 豪,戴高興

(1. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/廣西水稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530007; 2. 廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,南寧 530007;3. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 南寧 530007)

【研究意義】水稻粒型不僅影響稻谷產(chǎn)量,而且影響稻米品質(zhì),對水稻產(chǎn)量和品質(zhì)形成均具有重要作用[1-2]。粒型包括粒長、粒寬和粒厚,與水稻的堊白度、堊白粒率和透明度等外觀品質(zhì)關(guān)系密切[3]。隨著人們消費(fèi)水平的提高,對稻米品質(zhì)的要求也越來越高,特別是高端米市場對稻米外觀品質(zhì)要求嚴(yán)格,粒型細(xì)長、無心腹白和晶瑩剔透是優(yōu)質(zhì)稻米的典型外觀特征,因此,絲苗型稻米(糙米長≥6.5 mm,糙米長寬比≥3.5,T/GDSMM 001—2019)在市場上廣受歡迎[4]。雜交稻品種的雜種優(yōu)勢能提高稻谷產(chǎn)量,但其品質(zhì)提高上一直落后于常規(guī)稻[5]。雜交稻的品質(zhì)由恢復(fù)系與不育系共同決定[6-7],當(dāng)前恢復(fù)系選育仍以高產(chǎn)、恢復(fù)力強(qiáng)、配合力高和抗性強(qiáng)等為主要標(biāo)準(zhǔn),存在堊白度和堊白粒率高的現(xiàn)象,利于雜交稻外觀品質(zhì)提高[8-9]。三系雜交稻的保持系、不育系和恢復(fù)系之間具有嚴(yán)格的恢保關(guān)系,傳統(tǒng)育種過程通過雜交方式引入外源基因,有降低恢復(fù)系恢復(fù)強(qiáng)度的風(fēng)險,極大降低了育種效率[10]。因此,借助基因編輯手段,加強(qiáng)親本的粒型選擇,是提高三系雜交稻外觀品質(zhì)的有效途徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】水稻的外觀品質(zhì)包括米粒長、米粒寬、米粒長寬比、堊白粒率、堊白度和透明度等。堊白為稻米胚乳中白色不透明部分,是影響稻米品質(zhì)的重要因素,決定著稻米的商品價值[11-12]。研究結(jié)果顯示,堊白率和堊白度與粒寬和粒厚呈顯著正相關(guān),與粒長和長寬比呈極顯著負(fù)相關(guān)[3],因此,粒型調(diào)控對堊白的形成有不可忽略的影響[13-18]。目前已有超過60個粒型相關(guān)基因被克隆[19-20],這些克隆的基因中,GS3和TGW3基因負(fù)責(zé)調(diào)控水稻籽粒的粒長和粒重,GW8基因正向調(diào)控水稻粒寬,是生產(chǎn)上重要的粒型調(diào)控基因[15,21-22]。傳統(tǒng)雜交育種方式周期長,效率低下;粒型作為數(shù)量性狀,增加了品種選育難度[23]?；蚓庉嫾夹g(shù)可定向改造目的基因,為水稻的品種改良帶來了契機(jī)[24]。Zhou等[25]利用CRISPR/Cas9技術(shù),在秈稻溫敏核不育系龍科638S中同時編輯3個廣譜抗稻瘟病基因Bsr-d1、Pi21和ERF922,在T1代獲得了無轉(zhuǎn)基因純合的單基因或三基因突變體,與野生型相比,所有突變體都對稻瘟病表現(xiàn)出更強(qiáng)抗性;Hui等[26]利用CRISPR/Cas9技術(shù),在粳稻寧粳1號和秈稻黃華占中獲得具有香味的BADH2等位基因;徐善斌等[27]利用CRISPR/Cas9技術(shù)在龍粳11中同時敲除GS3及GS9基因,T2代突變體粒長增加26.43%～27.01%,單株產(chǎn)量增加10.82%～12.11%,千粒重增加 18.34%～41.36%;韓政宏等[28]在多個粳稻品種中同時敲除GS3和GS9基因,T2代獲得了籽粒細(xì)長和千粒重顯著增加的突變體;趙春芳等[29]在南粳5055中敲除GS3和qGL3基因,獲得了一系列大粒水稻新種質(zhì);谷玉娟等[30]創(chuàng)制了僅編碼GS3基因 C 端功能結(jié)構(gòu)域的突變類型,該類型的籽粒長度和千粒重有所增加;Wang等[31]利用CRISPR/Cas9對GS2基因的miR396識別位點(diǎn)進(jìn)行編輯,突變體GS2E植株的千粒重和單株產(chǎn)量分別提高了23.5%和10.4%;Chen等[20]在日本晴中單獨(dú)敲除GS3基因,突變單株的千粒重?zé)o顯著差異,GS3及GL3.1(TGW3)的同時敲除使千粒重得到顯著提高;Huang[32]等在秈稻保持系Mei1B中敲除GS3基因,gs3突變體及其測配組合(gs3/gs3)的千粒重比野生型以及雜合狀態(tài)均得到顯著提高?；蚓庉嫾夹g(shù)在水稻產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等改良上均取得顯著效果。【本研究切入點(diǎn)】廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所雜交水稻遺傳育種課題組自主選育的秈稻廣親和強(qiáng)恢復(fù)系桂恢582 (GH582)配組的超級稻組合桂兩優(yōu)2號為早晚兼用型超級稻品種,能適應(yīng)華南稻區(qū)復(fù)雜的氣候,早晚稻種植均能高產(chǎn)[33]。該品種的恢復(fù)系籽粒長約8.40 mm,寬約2.81 mm,籽粒短圓,在外觀品質(zhì)上與優(yōu)質(zhì)米有較大差距。針對恢復(fù)系的育種需求,本研究從粒型改良出發(fā),快速獲得外觀品質(zhì)提升的新恢復(fù)系?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用CRISPR/Cas9技術(shù),在GH582中定點(diǎn)敲除3個重要粒型調(diào)控基因GS3、TGW3和GW8,降低其籽粒寬度,提高籽粒長度,為快速提高三系雜交水稻的外觀品質(zhì)育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所水稻遺傳育種課題組自主選育的秈稻廣親和強(qiáng)恢復(fù)系桂恢582 (GH582)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 靶標(biāo)設(shè)計 在粒型改良提高水稻品質(zhì)的育種理念支持下,將增加供試品種粒長的同時減少籽粒寬度作為改良方案,選擇粒長基因GS3和TGW3、粒寬基因GW8為目標(biāo)基因。在NCBI數(shù)據(jù)庫上查找序列并設(shè)計靶標(biāo),GS3基因的靶標(biāo)為第一外顯子上的靶標(biāo)GS3-y1 cctcgaggaatccgatctcgcgg[32];GW8基因的靶標(biāo)設(shè)計在第3外顯子GW8-B1 agaccggaggcaagctggacagg;TGW3基因的靶標(biāo)則設(shè)計在第1外顯子TGW3-S1 gaatccatgtcccggccgagagg。

1.2.2 中間載體構(gòu)建 根據(jù)靶標(biāo)位點(diǎn)序列,分別合成帶Eco31I酶切位點(diǎn)的引物(表1),然后將正向引物與反向引物等量混合,進(jìn)行變性退火。反應(yīng)程序:95 ℃變性10 min,55 ℃退火10 min,14 ℃延伸5 min。將獲得攜帶Eco31I酶切位點(diǎn)的gRNA片段利用酶切連接方法分別連接到空載體上,操作程序:配置酶切連接體系10.0 μL,其中g(shù)RNA片段2.0 μL,空載體1.5 μL,Eco31I酶0.5 μL,T4-ligase 0.5 μL,T4-buffer 1.0 μL,H2O 4.5 μL,將配置好的體系放置于37 ℃培養(yǎng)箱2 h。然后利用酶切連接方法將3個構(gòu)建的載體中包含編輯元件和雙元載體部分進(jìn)行重組,獲得重組質(zhì)粒CRISPR-Cas9-GS3-GW8-TGW3(圖1)。

1.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 利用載體引物Yl-R+和Pbw2-(表1)對重組質(zhì)粒中1100 bp的編輯元件進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序驗(yàn)證,確認(rèn)無誤后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中[34],并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化到水稻恢復(fù)系GH582的愈傷組織,用潮霉素篩選獲得轉(zhuǎn)基因T0代植株。

1.2.4 陽性植株靶位點(diǎn)突變及粒型變異分析 利用抗潮霉素引物Hyg-F/Hyg-R篩選陽性植株。以引物GS3-F1/R1、GW8-F2/R2和TGW3-F/R檢測GH582材料獲得的陽性植株的突變位點(diǎn)序列。將獲得的陽性水稻苗與同時期野生型材料進(jìn)行種植,成熟期采集籽粒,每個單株挑選10粒飽滿度一致的籽粒,置于萬深考種儀測量其長度,同時與野生型籽粒進(jìn)行比對。

1.2.5 粒型突變新恢復(fù)系的獲得及農(nóng)藝性狀考察 由于對恢復(fù)系GH582進(jìn)行了多個基因、多個位點(diǎn)的編輯,T0代突變純合單株的選擇難度增大,可將T0代單株種子收獲后擴(kuò)大種植數(shù)量,在T1代或T2代選擇突變位點(diǎn)純合無標(biāo)記基因且符合預(yù)期目標(biāo)的單株鑒定為新恢復(fù)系?？疾炝Ｐ屯蛔冃虏挥档霓r(nóng)藝性狀,考察內(nèi)容包括株高、有效分蘗、穗長、籽粒長、籽粒寬、籽粒長寬比、穗粒數(shù)、實(shí)粒數(shù)、千粒重、結(jié)實(shí)率、單株重量等。

插入片段區(qū)域包括U3啟動子激活的具有敲除靶點(diǎn)的sgRNA表達(dá)盒,泛素啟動子激活的Cas9基因和35S啟動子激活的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。LB:T-DNA左邊緣序列;RB:T-DNA右邊緣序列。The inserted fragment region included sgRNA expression cassettes with knockout targets activated by U3 promoter, Cas9 gene activated by ubiquitin promoter and hygromycin phosphotransferase gene activated by 35S promoter. LB: T-DNA left border sequence; RB: T-DNA right border sequence.圖1 重組質(zhì)粒示意圖Fig.1 Schematic map of the recombinant plasmid

1.2.6 粒型突變新恢復(fù)系的米質(zhì)分析 對鑒定的新恢復(fù)系進(jìn)行米質(zhì)分析,包括整精米率、米粒長、米粒寬、米粒長寬比、透明度、堊白度、堊白粒率、膠稠度、堿硝值和直鏈淀粉含量等。

1.3 統(tǒng)計分析

利用GraphPad Prism 8對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 恢復(fù)系GH582陽性植株篩選及突變分析

潮霉素基因引物篩選獲得供試材料的T0代陽性植株28株。由于GH582材料突變位點(diǎn)較多,在T0代較難找到多個位點(diǎn)都純合且粒型符合需求的單株,將T0代收獲的28個單株的籽粒按照10株/行×2行播種成為T1代植株,并用引物Hyg-F/R檢測各單株的標(biāo)記基因狀況。選擇無標(biāo)記基因、有籽粒長和籽粒寬顯著變化的80個單株進(jìn)行突變位點(diǎn)測序分析。剔除測序結(jié)果為雜合狀態(tài)的單株,獲得突變穩(wěn)定的21個單株進(jìn)行基因突變分析和粒型檢測。

2.2 基因突變類型分析

21個單株中GS3發(fā)生突變的類型為單堿基插入(A、C、T、A),GW8發(fā)生突變的類型為單堿基插入(A、T)及單堿基缺失,TGW3發(fā)生突變的類型為單堿基插入(G)、單堿基缺失和17個堿基缺失(圖2)。這些突變類型都使得終止密碼子提前出現(xiàn),形成截斷蛋白,導(dǎo)致籽粒變窄或變長。

靶標(biāo)序列用藍(lán)色標(biāo)注,堿基插入用紅色小寫字母表示,堿基缺失用藍(lán)色連字符表示。The targeted sequence was highlighted in blue, mutations with insertion were marked with red lowercase letters and the deleted sequences were presented by blue hyphens.圖2 突變基因的測序分析Fig.2 Sequencing analysis of mutant genes

2.3 粒型基因突變組合分析

對GH582多個不同粒型突變單株的3個突變基因位點(diǎn)進(jìn)行測序分析,結(jié)合粒型突變結(jié)果比對,最終得到3種基因型的4種不同突變組合,分別為GW8tgw3GS3、GW8TGW3gs3、gw8TGW3gs3和gw8tgw3gs3,對應(yīng)的籽粒長和籽粒寬表型見圖3。

不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Different uppercase letters indicated significant difference(P<0.05).圖3 GH582不同突變體籽粒長和籽粒寬差異比較Fig.3 Comparison of grain length and width of different mutants in GH582

由粒型突變及顯著性差異分析可知,gs3和tgw3基因的單獨(dú)突變(GW8TGW3gs3、GW8tgw3GS3)都顯著增加了籽粒長(P<0.05,下同),且對籽粒長的貢獻(xiàn)相當(dāng),而對籽粒寬無顯著影響(P>0.05,下同);籽粒寬的顯著下降主要來自gw8突變;相比gs3的單獨(dú)突變,gw8和gs3同時突變(gw8TGW3gs3)使籽粒長度顯著增加;三者同時突變(gw8tgw3gs3)時,籽粒長相比gw8和gs3同時突變(gw8TGW3gs3)顯著增加,籽粒寬也顯著下降。3個粒型基因?qū)ψ蚜ｉL的增加有疊加效應(yīng),在gw8突變的情況下對籽粒寬的影響也有一定的疊加效應(yīng)。

2.4 粒型突變新恢復(fù)系選育及農(nóng)藝性狀測定

綜合各突變類型的籽粒突變狀態(tài)及植株整體表現(xiàn),3基因突變體gw8tgw3gs3籽粒顯著變窄變長,最符合育種目標(biāo)要求,在T2代選擇無標(biāo)記基因的突變單株種子收獲擴(kuò)大繁殖,暫命名為恢復(fù)系GH582E。農(nóng)藝性狀統(tǒng)計顯示,GH582E相較GH582,籽粒長度由8.62 mm增加至10.21 mm,增加18.4%,粒長極顯著增加(P<0.01,下同);籽粒寬度由2.82 mm下降至2.45 mm,下降13.1%,籽粒寬極顯著下降;籽粒長寬比由3.06增加至4.16,增加35.9%(圖4)。除粒型變化外,其他農(nóng)藝性狀無顯著差異,特別是千粒重、單株重等影響產(chǎn)量的性狀無顯著差異,說明3個基因的同時突變僅對恢復(fù)系GH582的粒型性狀產(chǎn)生重要影響。

**表示各處理間差異極顯著(P<0.01)。** indicated extremely significant difference among treatments(P<0.01).圖4 粒型突變新恢復(fù)系GH582E與GH582的主要農(nóng)藝性狀對比(n=10)Fig.4 Comparison of main agronomic traits between the new restorer line GH582E and GH582(n=10)

2.5 粒型突變新恢復(fù)系的米質(zhì)分析

米質(zhì)分析結(jié)果(圖5)顯示,GH582E (gw8tgw3gs3) 相較GH582,米粒長從5.97 mm增加到6.46 mm,增加8.2%,米粒寬從2.37 mm減少到1.99 mm,減少16.0%,米粒長比從2.52增加到3.25,增加29.0%,變化均達(dá)極顯著水平。透明度數(shù)值由4降低2,堊白粒率和堊白度極顯著下降,整精米率由于米粒的增加而有所下降,其他米質(zhì)相關(guān)性狀沒有明顯變化,外觀品質(zhì)得到明顯提升。由于外觀品質(zhì)的提升,該品種米質(zhì)由原來的等外米提高到部頒優(yōu)質(zhì)米標(biāo)準(zhǔn)3級以上,商品價值得到提升。

米粒長、米粒寬及米粒長寬比,n=10,其他性狀n=3。*表示各處理間差異顯著(P<0.05), **表示各處理間差異極顯著(P<0.01)。n=10 for brown rice length, brown rice width and ratio of rice length to width and n=3 for the other traits.* indicated significant difference among treatments(P<0.05),and ** indicated extremely significant difference among treatments(P<0.01).圖5 粒型突變新恢復(fù)系CH582和CH582E的米質(zhì)分析Fig.5 Analysis of rice quality of new restorer line CH582 and CH582E

3 討 論

傳統(tǒng)水稻品種培育主要利用基因重組和突變等方法,經(jīng)過多次選擇來培育新品種,耗時長,工作量大;分子標(biāo)記輔助育種 (MAS) 會因?yàn)槎啻亟患斑B鎖累贅的問題而導(dǎo)致標(biāo)記丟失,影響作物育種進(jìn)程[35]。水稻粒型作為數(shù)量性狀受到生育時期及栽培環(huán)境的影響,增加了其選育難度[23]。由于三系雜交稻恢復(fù)系和不育系之間的嚴(yán)格關(guān)系,傳統(tǒng)雜交選育方式增加了外來基因滲入的風(fēng)險[10]。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以快速精確地獲得期望性狀,打破了傳統(tǒng)育種方法的局限性,開創(chuàng)了作物改良新時代[35-36]?；蚓庉嫾夹g(shù)在水稻粒型改良上的成功應(yīng)用,創(chuàng)制了不同需求的水稻粒型種質(zhì)資源[20, 26, 32, 37-39]。本試驗(yàn)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),對短圓粒三系雜交稻恢復(fù)系GH582的多個粒型基因同時編輯,T2代即可選擇符合目標(biāo)性狀,無轉(zhuǎn)基因成分且突變位點(diǎn)純合的植株,獲得新恢復(fù)系GH582E(gw8tgw3gs3)。GH582E相比較GH582,除籽粒變得細(xì)長外,千粒重、單株重量等重要產(chǎn)量性狀及其他主要農(nóng)藝性狀無顯著差別。籽粒長度增加可提高千粒重,而千粒重的減少主要來自寬度的降低[40]。本研究選用GW8基因[15]為目的基因進(jìn)行敲除以降低籽粒寬度,利用gs3和tgw3突變使籽粒長度增加[21-22],獲得理想粒型突變的同時保證了新恢復(fù)系GH582E(gw8tgw3gs3)產(chǎn)量。

堊白是影響水稻外觀品質(zhì)的重要性狀,其形成受多基因控制[42-44]。在復(fù)雜的調(diào)控路徑中,籽粒外形對堊白形成有不可忽略的影響。粒寬基因GW2編碼具有E3泛素連接酶活性的環(huán)型蛋白,基因功能的喪失提高了籽粒寬度和重量,同時堊白也顯著增加[13]。水稻直鏈淀粉含量基因FLO2在過量表達(dá)的情況下,導(dǎo)致稻谷籽粒增大,并呈現(xiàn)堊白狀和面粉狀,品質(zhì)下降[14]。GW8基因的缺失變異使籽粒變細(xì),堊白出現(xiàn)頻率大大降低,稻米外觀品質(zhì)得到改善[15]。粒形基因GW7通過促進(jìn)縱向細(xì)胞分裂、減少橫向細(xì)胞分裂產(chǎn)生細(xì)長籽粒,同時增加了胚乳發(fā)育時幾種淀粉合成基因的轉(zhuǎn)化水平,降低堊白,提高籽粒外觀品質(zhì)[16]。qLGY3基因的選擇性剪接蛋白OsMADS1lgy3會產(chǎn)生細(xì)長粒的水稻品種,籽粒透明度增加而堊白減少[17]。Zhao等[18]利用CRISPR/Cas9技術(shù)在鹽稻8號中獲得GS9基因的缺失突變體gs9使水稻品種獲得細(xì)長籽粒,堊白降低;Chen等[20]在日本晴中敲除基因GS3,獲得的gs3突變體籽粒變長,堊白度及堊白粒率降低,外觀品質(zhì)提升;Huang等[32]在保持系Mei1B中敲除GS3基因,獲得的新保持系Mei2B(gs3)籽粒增長,產(chǎn)量增加,品質(zhì)也得到相應(yīng)提升。本研究中GH582E相較GH582,由于籽粒顯著變長變細(xì),籽粒長寬比增加,米質(zhì)分析顯示其堊白度及堊白粒率顯著下降,外觀品質(zhì)得到顯著提高,而影響產(chǎn)量的千粒重、單株產(chǎn)量等性狀無顯著差異,說明3個粒型基因的同時突變影響了粒型和品質(zhì),對產(chǎn)量變化無顯著影響。水稻粒型與產(chǎn)量相關(guān),以往研究認(rèn)為在水稻品質(zhì)育種過程中,特別強(qiáng)調(diào)細(xì)長粒型會影響粒重和單株重,導(dǎo)致所育成的優(yōu)質(zhì)米品種產(chǎn)量偏低[40]。從本研究及相關(guān)粒型基因編輯文獻(xiàn)的報道可知,選擇適當(dāng)?shù)牧Ｐ突驅(qū)λ酒贩N進(jìn)行改良,可獲得理想的類型突變,滿足生產(chǎn)需要。

4 結(jié) 論

利用CRISPR/Cas9技術(shù)改良水稻恢復(fù)系的粒型快速有效,并且僅通過粒型的改變就可顯著提高水稻外觀品質(zhì),獲得產(chǎn)量和品質(zhì)兼顧的水稻新品種,促進(jìn)現(xiàn)有資源有效利用,提高雜交稻親本的育種效率。