王潁源 方盼盼 陳蒙蒙 郭 靜 劉大鵬 康文清

鄭州大學附屬兒童醫(yī)院 1.新生兒重癥監(jiān)護室，2.鄭州市兒童感染與免疫重點實驗室（河南鄭州 450018）

CHARGE 綜合征（OMIM:214800）是一種罕見的先天性常染色體顯性遺傳疾病[1]，發(fā)病率約為1/17000～1/15000，30%患者在5歲前死亡[2]。研究發(fā)現(xiàn)，CHD 7基因變異是導致CHARGE 綜合征的主要遺傳學病因[3]。目前國內(nèi)CHARGE 綜合征報道相對較少，新生兒期診斷的報道更少。本研究應用高通量測序技術(shù)和Sanger測序技術(shù)等對5個新生兒期CHARGE 綜合征家系進行基因檢查，總結(jié)其臨床特征、診治經(jīng)過、轉(zhuǎn)歸，通過家系分析為其提供遺傳咨詢。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2018年1月至2020年12月在鄭州大學附屬兒童醫(yī)院就診的5 例CHARGE 綜合征患兒樣本及家系資料圖（圖1），男4例、女1例，均為新生兒期發(fā)病。5例患兒均經(jīng)監(jiān)護人簽字同意，接受醫(yī)學全外顯子基因分析及家系驗證。本研究經(jīng)河南省兒童醫(yī)院倫理委員會審查批準（No.2021-K-076）。

圖1 5 例患兒家系圖及耳、眼部表現(xiàn)

1.2 方法

1.2.1 診斷依據(jù) 依據(jù)2016年Hale等[4]提出的CHARGE 綜合征的診斷標準，主要指標：①眼部缺損；②鼻后孔閉鎖或腭裂；③外耳、中耳或內(nèi)耳發(fā)育異常，包括半規(guī)管發(fā)育不全；④致病性的CHD7變體。次要指標：①顱神經(jīng)功能障礙包括聽力喪失；②吞咽困難或喂養(yǎng)困難；③腦結(jié)構(gòu)異常；④生長發(fā)育遲緩/自閉癥；⑤下丘腦-垂體功能異常(包括生長激素和促性腺素不足)或生殖器發(fā)育不良；⑥心臟、食管等縱膈氣管畸形；⑦腎臟異常，骨骼或四肢發(fā)育異常。滿足2項主要標準+任意1項次要標準即可診斷CHARGE綜合征。

1.2.2 臨床資料收集 收集5例患兒的主要表觀畸形、臨床特征、重要的輔助檢查結(jié)果等，總結(jié)其臨床特征及診治經(jīng)過。

1.2.3 基因測序 抽取患兒及父母靜脈血3 mL，EDTA 抗凝，送至復旦大學附屬兒科醫(yī)院兒科研究所，采用全外顯子組基因進行Illumina HiSeq2500高通量測序。去除接頭及低質(zhì)量序列，采用BWA 軟件將其定位到人類基因組的參考序列（UCSU 19）上進行比對。針對篩選出的可疑致病位點，用Primer 5.0 設計引物進行擴增及Sanger 測序分析。采用Chromas2進行測序結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 患兒臨床特征

5 例患兒均在新生兒期發(fā)病，其中4例存在反應差、呼吸困難，均接受機械通氣治療，1 例不明原因發(fā)生呼吸心跳驟停，3 例多次撤離呼吸機均失敗，1例接受心臟手術(shù)，1 例圍手術(shù)期死亡。5 例患兒均存在不同程度耳部畸形，3 例有眼底病變脈絡膜或虹膜缺損?；純号R床特征見圖1、表1。

表1 5例新生兒CHARGE綜合征患兒臨床特征

2.2 基因檢測結(jié)果

家系1為CHD7基因c.478del（Y160Tfs*51）雜合移碼變異，家系2為CHD7基因c.5428C＞T(P.R 1810*)雜合無義變異，家系3 為CHD 7基因c.6292 C＞T(P.R 2098*)雜合無義變異，家系4 為CHD7基因c.4317delA（p.Q1440S fs*3）雜合移碼變異，家系5為CHD7基因c.469C＞T(P.R157*)雜合無義變異（表2）。家系4 為未報道變異，其變異經(jīng)Sanger 測序驗證確認（圖2）。Sanger 測序顯示5個先證者的父母均未發(fā)現(xiàn)上述變異。5 例患兒基因變異致病性分析見表3。

表2 5例新生兒CHARGE綜合征患兒CHD7基因變異檢測結(jié)果

表3 5例患兒基因變異致病性分析

圖2 例4 患兒及父母CHD7 基因Sanger 測序結(jié)果

2.3 臨床轉(zhuǎn)歸及預后

病例1、5 因反復撤離呼吸機失敗，家屬放棄治療后當天死亡。病例2 因PDA，動脈導管直徑大，術(shù)前死于感染性休克。病例3 因吞咽障礙，喂養(yǎng)困難，家屬放棄治療后死于家中。病例4 接受心臟手術(shù)后控制感染逐漸脫離呼吸機，臨床治愈出院，早期曾予以鼻飼奶喂養(yǎng)，情況好轉(zhuǎn)后改口服，現(xiàn)患兒2歲5個月，身高82 cm，體重10 kg（低于同齡同性別正常兒童2 個標準差），目前仍不能獨立行走，僅可說“媽媽”。

3 討論

CHD 7 是哺乳動物細胞中ATP 依賴性染色質(zhì)域解旋酶DNA 結(jié)合蛋白家族的九個成員之一，人類CHD7基因位于8q12.1，基因組全長188 kb，其蛋白包含2 997個氨基酸[4]，廣泛表達于胚胎和成體多種組織，其變異所產(chǎn)生的影響可存在于整個孕期，尤其是孕早期的3 個月（3～9 周），不僅影響神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)發(fā)育，還影響嗅覺、耳、心臟、骨骼等器官的發(fā)育，故CHARGE 綜合征患者的表型具有異質(zhì)性與復雜性[9]。1998年Blake等[10]首先提出本病的診斷標準，認為CHARGE 綜合征的診斷應包含4 個主要指標和7個次要指標，主要指標：①眼組織缺損、小眼畸形，②后鼻孔閉鎖或狹窄，③耳形態(tài)異?；蚨@，④顱神經(jīng)功能障礙；次要指標：①心臟畸形，②氣管食管畸形，③生殖器發(fā)育不良或青春期發(fā)育遲緩，④唇裂和/或腭裂，⑤發(fā)育遲緩，⑥生長遲緩，⑦特征性面容。典型的CHARGE 綜合征為符合4 項主要指標或3項主要指標+3項次要指標。后隨著研究的深入，CHD 7基因被確定為CHARGE 綜合征主要的致病基因[3]。2005年Verloes[11]提出了新的診斷標準，將顱神經(jīng)功能障礙歸于次要指標，同時次要指標去除了“唇裂及腭裂”和“特征性面容”，但由于其具有臨床表現(xiàn)多樣、病情輕重程度不等、異質(zhì)性強等特點，漏診誤診十分常見。2016年Hale等[4]在基因研究的基礎上提出了CHARGE 綜合征的新的診斷標準，在Verloes診斷標準的基礎上主要指標增加了致病性CHD7變體，次要指標上增加了“吞咽困難或喂養(yǎng)困難”和“腎臟異常、骨骼或四肢發(fā)育異?！薄Ｒ罁?jù)Verloes標準，與兒童及成人相比，在新生兒期典型的CHARGE 綜合征臨床診斷并無困難，但非典型CHARGE 相應的畸形無特異性，診斷難度較大，可能漏診一些癥狀輕或不典型患兒，可疑該病的患兒建議按照診斷標準積極完善相關影像學檢查，同時行相關基因檢測提高診斷率，避免漏診，尤其是不完全符合Verloes 標準者，亦不能排除CHARGE 綜合征的診斷[12]。按最新的Hale標準，在本組5例患兒明確合并CHD 7基因變異之后，所有患兒均符合CHARGE綜合征的診斷。

本研究5 例患兒均為早期新生兒，發(fā)病均以多發(fā)畸形、呼吸困難為共同特點，且均合并鼻腔狹窄，后者是其呼吸困難的主要病因，考慮該畸形是本組患兒住院治療效果差的主要原因，但本組無鼻后孔閉鎖的病例，所以鼻后孔閉鎖可能不是該類患兒必須存在的畸形。另外本研究發(fā)現(xiàn)鼻腔狹窄或上氣道塌陷等是本組患兒上氣道的主要畸形類型。心臟畸形是CHARGE 綜合征和具有致病性CHD 7變異患者的主要特征。與非綜合征性心臟畸形相比，CHD7致病變異患者更常見PDA 及ASD，本組5 例患兒均有ASD 及PDA[13]。例1 及例5 患兒存在歪嘴哭表現(xiàn)，主要表現(xiàn)為哭鬧時口角歪向一側(cè)，上下唇不對稱，該體征在新生兒期并不罕見，主要在22q11.2微缺失綜合征患者中存在，但多項報道指出歪嘴哭可能為該病的臨床表現(xiàn)之一[14-16]。本組患兒均存在不同程度的喂養(yǎng)困難，具體表現(xiàn)為以喂養(yǎng)困難就診，或臨床診治過程中發(fā)現(xiàn)患兒口腔分泌物多，吞咽功能差，與相關研究報道的12 例CHARGE 綜合征患兒共同臨床表現(xiàn)為喂養(yǎng)困難的結(jié)論一致，其提出喂養(yǎng)困難同時合并多發(fā)畸形需考慮CHAEGE 綜合征的可能[16]。此外例3 在喂養(yǎng)困難的基礎上，合并小口畸形，與文獻報道的CHARGE 綜合征患兒合并T 細胞功能障礙導致原發(fā)性免疫缺陷癥[17]有關，但本組病例因入院年齡較小均未行相關免疫功能檢測。例1、3、5 均合并不同程度眼部畸形。4 例男性患兒合并小陰莖及隱睪，主要是因為CHD 7在胚胎期高表達于嗅球嗅束、垂體前葉、中葉細胞，CHD7變異將導致性激素神經(jīng)元不能正確遷移以及嗅球發(fā)育不良，文獻報道大約有60%～80%的CHARGE 綜合征患者合并有低促性腺激素及性腺功能減退[18]。新生兒的嗅覺判斷尤其是危重新生兒嗅覺判斷目前尚無特定方法，故本組患兒不能確定是否合并嗅覺障礙。

消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)疾病是CHARGE 綜合征生后死亡的主要原因[19]。本組最終4 例患兒死亡，其中例1和例5主要是因住院時間長，反復撤機失敗死亡，考慮原因為鼻腔嚴重狹窄，上氣道塌陷，黏膜水腫明顯，呼吸道分泌物多，后死于呼吸衰竭；例2亦不能撤離呼吸支持手段，彩色多普勒超聲心動圖提示動脈導管粗大，準備手術(shù)過程中死于嚴重的圍手術(shù)期感染；例3患兒雖僅為鼻導管吸氧，存在喂養(yǎng)困難，家屬考慮預后可能不良放棄治療后死于家中，隨訪過程中發(fā)現(xiàn)該患兒死亡原因可能為呼吸困難（衰竭）及喂養(yǎng)不足，最終導致全身衰竭。只有例4臨床外觀畸形相對較輕，無明顯氣道發(fā)育畸形存在，但需管飼喂養(yǎng)，現(xiàn)生命體征尚平穩(wěn)，但發(fā)育較同齡兒落后。故新生兒合并上氣道畸形尤其是診斷CHARGE綜合征的患兒要優(yōu)化呼吸道管理策略，積極防治感染，同時聯(lián)合眼科、耳鼻喉、口腔等學科盡早介入，開展相應治療手段早期去除威脅患兒生存的畸形（如合并上氣道塌陷綜合征的患兒是否可開展相關手術(shù)擴大咽腔空間），以提高患兒生存率。

國內(nèi)有關CHARGE 綜合征病例的報道較少。本研究5 例患兒CHD 7基因變異位點中有3 例無義變異、2 例移碼變異，變異類型與之前報道基本一致[20]。本組患兒表現(xiàn)出與既往報道患者不同的表型如鼻腔狹窄、上氣道塌陷綜合征及吞咽或喂養(yǎng)困難等表明，CHARGE 綜合征是一種高度異質(zhì)性疾病，此類患兒易合并其他疾病[21]，CHD7基因分析對于全面評估很重要[22]。對于具有CHD 7致病變異的CHARGE 綜合征患者，基因型和表型之間的關系尚不清楚[23]，文獻報道雜合錯義變異患者表型相對較輕，無義變異者表型較重，本研究發(fā)生無義變異的3例患兒均死亡，另外2例移碼變異患兒死亡1例，存活1例，結(jié)果與文獻報道一致[24]。

綜上所述，本研究明確了5 例患兒多發(fā)畸形的遺傳學病因，并認定CHD 7基因變異為4 例患兒死亡的遺傳學病因，豐富了CHD7基因變異的數(shù)據(jù)庫，并為家系遺傳咨詢提供了重要依據(jù)。