付海燕 馬 莉 石偉娜 白革蘭 孫 敏 劉亞麗 程麗娟 賈霄云 李桂桂趙世光 李曉雷 夏耀芳 趙瑞芹

河北省兒童醫(yī)院 1.消化科，2.新生兒科（河北石家莊 050031）

A20單倍劑量不足（haploinsufficiency of A20，HA 20）是由腫瘤壞死因子α 誘導(dǎo)蛋白3（tumor necrosis factor alpha-induced protein 3，TNFAIP3）基因變異引起的常染色體顯性遺傳病，由于腫瘤壞死因子α 誘導(dǎo)蛋白3（又稱為A 20）不足導(dǎo)致核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路的負(fù)反饋受到抑制，呈現(xiàn)自身炎癥性疾病的特征[1]。

圖1 例1 消化內(nèi)鏡鏡下表現(xiàn)

A 20 由TNFAIP 3基因編碼，是NF-κB 信號(hào)通路的重要負(fù)調(diào)控因子[2]。TNFAIP3基因發(fā)生變異可導(dǎo)致A 20 功能缺失，NF-κB 活性抑制受到影響，核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白（NLRP 3）炎癥小體出現(xiàn)激活增強(qiáng)，兩者共同作用，導(dǎo)致白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-18和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子過量產(chǎn)生，出現(xiàn)免疫失調(diào)，以反復(fù)發(fā)熱、口腔潰瘍、肛周病變等表現(xiàn)為著[3]。本研究對(duì)3例以難治性腹瀉為主要表現(xiàn)的兒童期HA20患者的臨床特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)室、影像學(xué)檢查結(jié)果，內(nèi)鏡下改變及致病基因變異進(jìn)行分析，為該病的臨床診治提供線索。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性分析3 例因難治性腹瀉在河北省兒童醫(yī)院就診，存在TNFAIP 3基因致病性變異患兒的臨床資料。本研究通過患兒監(jiān)護(hù)人知情同意，并經(jīng)河北省兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（醫(yī)研倫審號(hào)：2020-13）。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料 收集患者一般情況，包括年齡、性別、家族史、發(fā)病情況、生化指標(biāo)、胃鏡、結(jié)腸鏡及膠囊內(nèi)鏡鏡下表現(xiàn)、胃腸道組織病理、基因變異、診療、隨訪等資料；入院次日收集患兒晨起血、尿、糞便等標(biāo)本進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.2.2 基因檢測(cè) 收集患兒及父母外周血各2 mL，EDTA 抗凝，用QIAamp 全血DNA 提取試劑盒（德國Qiagen 公司）按說明書提取基因組DNA。取起始量3μg DNA，稀釋后，采用Covaris S2超聲儀（Covaris公司，美國）進(jìn)行超聲片段化，大小約150～200 bp。用NEB Next DNA文庫制備試劑盒-Illumina（NEB公司，美國）制備全基因組文庫。用Nanodrop 2000樣本定量檢測(cè)儀（Thermo Fisher科技有限公司，美國）和Agilenl 2100生物分析儀（安捷倫科技公司，美國）進(jìn)行質(zhì)控。

應(yīng)用全外顯子測(cè)序WES 試劑盒（myGenomics，美國）對(duì)患兒和父母的基因外顯子區(qū)域及其上下游50 bp區(qū)域進(jìn)行捕獲，先證者1采用Illumina HiSeq X ten高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)捕獲到的區(qū)域進(jìn)行雙端測(cè)序，讀長為150 bp，先證者2 采用DNBSEQ-T 7 高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)捕獲區(qū)域進(jìn)行測(cè)序。目標(biāo)區(qū)域測(cè)序后，去除測(cè)序數(shù)據(jù)中的接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)。運(yùn)用BWA軟件（http://bio-bwa.sourceforge.net/）比對(duì)到參考基因組上（hg 19 版本），對(duì)測(cè)序深度、均一性、探針特異性等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用GATK軟件（https://software.broadinstitute.org/gatk/）對(duì)樣本的比對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)，對(duì)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotidepolymorphisms，SNPs）和插入缺失變異（indels）等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，通過ANNOVAR 軟件（http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/）注釋所有的SNPs和indels。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

例1，女，5歲10個(gè)月，因“間斷嘔吐、腹痛、腹瀉2年余”于2019年5月就診。入院時(shí)查體：身高106cm（P3），體重15kg（P7），體質(zhì)指數(shù)13.3 kg/m2（P3），口腔黏膜光滑，腹部平軟，中上腹及臍周壓痛，全腹未觸及包塊，肛周未見異常。糞便常規(guī)：白細(xì)胞1～3個(gè)/HP，潛血陽性；血EB 病毒、巨細(xì)胞病毒抗體及DNA檢測(cè)陰性；結(jié)核桿菌斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT）陰性；血腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)陰性；糞便細(xì)菌、真菌、寄生蟲、艱難梭菌等檢查未見異常；糞便鈣衛(wèi)蛋白及血常規(guī)見表1。腹部超聲示回盲部腸管壁及部分乙狀結(jié)腸壁增厚，回聲減低；胃鏡示胃竇黏膜可見片狀充血及陳舊出血斑，十二指腸球部及十二指腸降部見霜斑樣潰瘍，膠囊內(nèi)鏡可見空腸及回腸下段多發(fā)潰瘍；結(jié)腸鏡示回盲部充血（圖1）。胃鏡病理示胃竇局部微膿腫形成，可見隱窩膿腫；腸鏡病理示末段回腸可見隱窩炎，回盲部、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸及直腸可見灶狀淋巴細(xì)胞聚集。予患兒腸內(nèi)營養(yǎng)8周，繼予甲基潑尼松龍15 mg/d治療2周后，逐漸減至8 mg/d治療2個(gè)月，患兒仍有間斷發(fā)熱、嘔吐、腹痛，排黏液血便，進(jìn)一步完善基因檢查，診斷為HA 20，改用英夫利昔單抗（5 mg/kg）治療2次后，大便次數(shù)及性狀正常。之后以英夫利昔單抗（5 mg/kg）維持治療，于9 歲時(shí)測(cè)量身高為134 cm（P55）、體重30 kg（P55）、體質(zhì)指數(shù)16.7 kg/m2（P57）。

例2，女，8 歲，因“間斷腹痛、腹瀉3 月余”于2020年3月入院，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院間斷予抗生素治療，效果不佳。入院時(shí)查體：身高120 cm（P8），體重20 kg（P9），體質(zhì)指數(shù)14.0 kg/m2（P9），口腔多發(fā)潰瘍，腹部平軟，臍周壓痛，全腹未觸及包塊，肛周未見異常。入院后查糞便常規(guī)：酵母樣真菌55～65/HP，糞便真菌培養(yǎng)：熱帶念珠菌，給予氟康唑抗真菌治療。結(jié)腸鏡檢查示多個(gè)腸段潰瘍；腸鏡病理為輕度慢性腸炎，未見肉芽腫及隱窩膿腫。經(jīng)抗真菌治療，患者腹痛緩解，大便成形。2個(gè)月后患兒再次出現(xiàn)發(fā)熱、腹痛、腹瀉，伴有口腔潰瘍，查體外陰可見潰瘍。復(fù)查腸鏡提示回盲部及回盲瓣可見潰瘍（圖2A），升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸黏膜光滑，血管紋理清晰；病理：回腸末端、回盲部輕度活動(dòng)性炎癥。膠囊內(nèi)鏡示：回盲部可見潰瘍（圖2B）。進(jìn)一步完善基因檢查，存在TNFAIP3基因變異。追問病史，患者母親自26歲開始出現(xiàn)反復(fù)口腔潰瘍、外陰潰瘍，偶有腹痛，無腹瀉，無黏液血便；無反復(fù)發(fā)熱及皮膚病變，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院診斷為“白塞病”，口服秋水仙堿治療，口腔潰瘍和外陰潰瘍間斷出現(xiàn)，發(fā)作不頻繁。根據(jù)患兒臨床癥狀，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、內(nèi)鏡下表現(xiàn)以及基因檢測(cè)結(jié)果，診斷為HA20，給予甲基潑尼松龍2 mg/(kg·d)誘導(dǎo)緩解后，采用阿達(dá)木單抗繼續(xù)治療（首次應(yīng)用80 mg，2周后40 mg，之后每隔2周給藥20 mg維持緩解）。于患者9 歲時(shí)隨訪，體溫未再波動(dòng)，口腔潰瘍愈合，無黏液血便及肛周病變，身高128 cm（P20），體重27 kg（P33），BMI 16.6 kg/m2（P53）。

例3，女，于13日齡開始排綠色黏液便，伴有間斷發(fā)熱，于2022年4月（22日齡）入院?；?yàn)大便常規(guī)未見異常，給予抗感染及對(duì)癥治療，大便性狀好轉(zhuǎn)出院。于1.3 月齡時(shí)患兒再次出現(xiàn)腹瀉，大便10 余次/d，為黃色稀水便，不含黏液及血絲，伴有發(fā)熱。查體：身長51 cm，體重3.5 kg（身長別體重P44），口腔黏膜光滑，腹平軟，腸鳴音正常存在；肛周及外陰未見異常。糞便常規(guī)：白細(xì)胞2～5/HP，潛血弱陽性；血細(xì)菌、真菌培養(yǎng)陰性，T-SPOT 陰性；糞便艱難梭菌、細(xì)菌培養(yǎng)、真菌培養(yǎng)等均為陰性；血常規(guī)、糞便鈣衛(wèi)蛋白水平見表1。經(jīng)對(duì)癥治療，患兒病情無好轉(zhuǎn)，間斷發(fā)熱。追問病史，患兒母親自8歲左右出現(xiàn)反復(fù)口腔潰瘍及外陰潰瘍，間斷進(jìn)餐后腹痛，未予重視，未經(jīng)治療。對(duì)患兒完善基因檢查，發(fā)現(xiàn)存在TNFAIP 3基因變異，變異來自于母親。根據(jù)患兒臨床特點(diǎn)、家族史及基因變異，診斷為HA 20。予甲基潑尼松龍10 mg/d治療3天，體溫正常，大便1次/d，黃色糊狀便；繼續(xù)口服甲基潑尼松龍4 mg/d 治療10 天，大便次數(shù)及形狀正常，體重增加。于診斷后第14天加用沙利度胺1.5 mg/(kg·d)，甲基潑尼松龍逐漸減停?；純?月齡時(shí)復(fù)查，身長65.3 cm，體重 8.2 kg（身長別體重P94）。

2.2 基因檢測(cè)結(jié)果

3 例患兒均存在TNFAIP 3基因雜合變異。例1為自發(fā)變異c.811 C＞T（p.R 271 X），在811 號(hào)核苷酸由胞嘧啶變?yōu)樾叵汆奏?，在?71 位氨基酸出現(xiàn)終止密碼子，為無義變異（圖3 A），該變異位點(diǎn)人類基因突變（HGMD）數(shù)據(jù)庫收錄已有報(bào)道，根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（ACMG）指南，判斷為致病性變異（PVS 1+PS 1+PS 2+PM 2）。例2 存在變異c.292_295 dupAACG（p.G 99 Efs*3）（圖3 B），變異來源于母親，為在第292～295 號(hào)核苷酸發(fā)生堿基重復(fù)，致氨基酸移碼，在第99 位氨基酸后第3 個(gè)氨基酸出現(xiàn)終止密碼子，終止密碼子發(fā)生在第2 號(hào)外顯子上，發(fā)生無義介導(dǎo)的mRNA 降解機(jī)制，導(dǎo)致蛋白機(jī)構(gòu)改變，功能喪失。c.292_295 dupAACG 位點(diǎn)在GenomAD 等正常人群數(shù)據(jù)庫中未被發(fā)現(xiàn)，在HGMD、Clinvar 疾病數(shù)據(jù)庫中目前未見報(bào)道。根據(jù)ACMG 指南，判斷為疑似致病性變異（PVS 1+PM 2_Supporting）。例3 為c.133 C＞T（p.R 45 X）雜合變異（圖3 C），變異來源于母親，第133 號(hào)核苷酸由胞嘧啶變?yōu)樾叵汆奏ぃ瑢?dǎo)致第45 位氨基酸出現(xiàn)終止密碼子，從而影響該基因編碼蛋白產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能，該變異為HGMD 數(shù)據(jù)庫收錄的已知變異，根據(jù)ACMG 指南，判斷為致病性變異（PVS 1+PS 4_Moderate+PM2_Supporting）。

3 討論

HA 20 是一種罕見的常染色體顯性遺傳疾病，于2016 年由Zhou 等[1]首次報(bào)道，患兒主要表現(xiàn)為白塞病樣癥狀，之后國際學(xué)術(shù)期刊陸續(xù)對(duì)HA 20 進(jìn)行了報(bào)道[4-10]。A20即腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3，由TNFAIP 3基因編碼，由一個(gè)卵巢腫瘤N 端結(jié)構(gòu)域（ovarian tumor domain，OTU）和七個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域（zine finger domain，ZnFs）組成，共790個(gè)氨基酸殘基。OTU 結(jié)構(gòu)域可去除目標(biāo)蛋白中K 63 泛素鏈（去泛素化），使多種目標(biāo)蛋白如TNF 受體相互作用蛋白、NF-κB 抑制蛋白激酶1、TNF 受體1 等蛋白發(fā)生泛素化，抑制蛋白酶對(duì)其降解；ZnFs 可將泛素鏈附著到K 48 上（泛素化），有線性聚泛素化作用，輔助抑制NF-κB 活化[11-12]，在炎癥和免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[13]。如果TNFAIP 3基因發(fā)生變異，可導(dǎo)致NF-κB 通路的過度激活，引起IL-1 β、IL-6、IL-18、TNF-α等促炎細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生，機(jī)體出現(xiàn)自身炎癥性疾病的癥狀。

目前HA 20 尚無明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)，典型的臨床癥狀、輔助檢查、確切的基因變異可輔助該病的診斷。Zhou 等[1]首次報(bào)道的HA 20 患者主要表現(xiàn)為復(fù)發(fā)性口腔潰瘍、生殖器潰瘍和胃腸道癥狀，類似于白塞病樣表現(xiàn)，之后相關(guān)病例報(bào)道患兒不僅表現(xiàn)出自身炎癥性疾病的特征，還表現(xiàn)出自身免疫性疾病的特征，包括早發(fā)型全身炎癥、關(guān)節(jié)痛、關(guān)節(jié)炎、口腔及生殖器潰瘍、淋巴結(jié)炎、橋本甲狀腺炎、腎臟受累、眼部病變，促炎細(xì)胞因子如IL-1 b、TNF、IL-6、IL-9、IL-17、IL-18、干擾素-γ和干擾素誘導(dǎo)蛋白-10不同程度升高。部分患兒存在低滴度自身抗體，如抗核抗體、抗雙鏈DNA抗體等[4-5,9,14]。相關(guān)研究對(duì)61 例HA 20 患兒臨床特點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)29 例患兒在確診之前被診斷為白塞病，11例診斷為幼年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，6例被診斷為周期性發(fā)熱-阿弗他口炎-咽炎-淋巴結(jié)炎綜合征（PFAPA）；其他患兒分別被診斷為克羅恩病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、成人Still病等[15]。

隨著對(duì)HA 20 疾病機(jī)制認(rèn)識(shí)的加深，一些表現(xiàn)特殊的病例逐漸被診斷。有研究報(bào)道1例7月齡男性患者由于發(fā)熱，C 反應(yīng)蛋白、肝功能異常，頸部淋巴結(jié)腫大，皮疹，抗雙鏈DNA抗體和抗單鏈DNA 抗體陽性，IL-10、可溶性凋亡蛋白1配體和IL-18水平升高，考慮自身免疫性淋巴增生綜合征（ALPS），為患兒行全外顯子組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)患兒存在TNFAIP3基因變異，最終診斷為HA 20。ALPS 樣的臨床表現(xiàn)擴(kuò)大了HA 20 的臨床表型譜[9]。兒童時(shí)期HA 20 還可表現(xiàn)為周期性發(fā)熱綜合征、噬血細(xì)胞綜合征、PFAPA等[16-18]，臨床需注意鑒別診斷。

本研究中，例2、例3 基因變異均來自于各自母親，兩位母親均于幼年起出現(xiàn)反復(fù)口腔潰瘍及外陰潰瘍，并無反復(fù)發(fā)熱、腹瀉，而2例患兒以反復(fù)發(fā)熱、難治性腹瀉為主要表現(xiàn)，均無外陰潰瘍，雖與母親有相同的基因變異，但臨床表型并不相同，提示HA 20為異質(zhì)性病變。即使基因變異完全相同的家庭成員，臨床表現(xiàn)也可不同[19]。人口隊(duì)列研究表明，每個(gè)人的平均基因組包含大約200個(gè)非常罕見的變異和54個(gè)先前報(bào)告為致病的變異，說明許多個(gè)體雖存在致病變異，但并未發(fā)展成相應(yīng)的表型[20-21]，這與致病性變異的不完全外顯率和可變表達(dá)性有關(guān)，即由相同基因型引起表型的嚴(yán)重程度在受影響的個(gè)體之間可能有所不同，造成該種現(xiàn)象與調(diào)控基因變異、表觀遺傳學(xué)、環(huán)境因素和生活方式的改變有關(guān)[22]。

多數(shù)HA 20 患兒對(duì)糖皮質(zhì)激素有反應(yīng)，近一半HA20患兒對(duì)秋水仙堿治療有反應(yīng)，免疫抑制劑如環(huán)孢素、甲氨蝶呤和硫唑嘌呤也經(jīng)常應(yīng)用于HA 20 的治療當(dāng)中，沙利度胺可改善腸道炎癥[23]。由于HA20患兒促炎細(xì)胞因子過度產(chǎn)生，生物制劑如阿那白滯素、利妥昔單抗、托珠單抗、英夫利昔單抗等也已應(yīng)用于部分患兒[15]，并取得療效。嚴(yán)重難治性HA 20患兒可行造血干細(xì)胞移植[24]。本研究中3 例患兒，初始治療選用甲基潑尼松龍，效果并不相同，例3年齡最小，癥狀迅速改善，體重及身長獲得增長。而例1應(yīng)用甲基潑尼松龍后未能誘導(dǎo)緩解，更換為英夫利昔單抗規(guī)律治療后臨床癥狀緩解。HA 20 的長期預(yù)后仍需繼續(xù)隨訪研究。

總之，本研究報(bào)道了3 例兒童期起病以反復(fù)腹瀉為主要表現(xiàn)的HA 20，例3 是目前全球發(fā)病年齡最小的患兒，甲基潑尼松龍、沙利度胺治療取得良好效果，其臨床表型及預(yù)后是否隨年齡增長和環(huán)境變化而改變?nèi)孕柽M(jìn)一步研究。HA 20 患兒臨床表現(xiàn)具有異質(zhì)性，根據(jù)臨床表現(xiàn)疑診為HA 20 的患兒，應(yīng)完善基因檢測(cè)協(xié)助診斷。