郭軍利,陶愚磊,鄭佳麗,梅建強,陳分喬,許文忠

膿毒癥是感染引起宿主反應失調,導致危及生命的器官功能損害的一組癥候群,病死率很高[1],其往往發(fā)生于嚴重感染、燒傷或創(chuàng)傷,同時也是休克、外科大手術等疾病常見的并發(fā)癥[2]。膿毒癥早期常合并單一器官功能障礙,當炎性反應加重,機體出現炎性反應失控、血管內皮功能障礙、凝血功能障礙、循環(huán)代謝障礙,最終導致多器官功能障礙,其中炎性反應、凝血功能障礙、器官損傷貫穿膿毒癥整個疾病階段[3-4]。目前,西醫(yī)治療多采用液體復蘇、抗感染治療、血管活性藥物治療、連續(xù)血液凈化及對癥支持治療等治療措施,取得了一定的效果[5]。然而,大量使用抗生素會增加細菌的耐藥性,增加救治的難度,同時以免疫細胞、炎性介質、凝血系統(tǒng)為治療靶點的最新研究亦未達到降低膿毒癥病死率的預期效果。中醫(yī)藥具有幾千年治療感染性疾病的歷史,大量證據表明中醫(yī)藥在治療膿毒癥方面具有很大的優(yōu)勢。

自擬英黃湯是由全國名中醫(yī)梅建強教授在中醫(yī)理論基礎上結合多年的急危重癥臨床救治經驗創(chuàng)立,且已應用于臨床中治療膿毒癥患者,并取得了一定的療效[6],然而其作用機制尚不明確。多項研究顯示,磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)/核因子-κB(NF-κB)信號通路是膿毒癥發(fā)病機制的關鍵通路,通過藥物干預PI3K/AKT/NF-κB通路被認為是降低膿毒癥病死率的關鍵措施之一[7-8]。因此本研究運用盲腸結扎穿孔法(CLP)建立膿毒癥大鼠模型,基于PI3K/AKT/NF-κB信號通路探討英黃湯對膿毒癥大鼠保護作用,為英黃湯更好在臨床當中發(fā)揮治療作用提供支持,報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:健康雄性SD大鼠240只,體質量(150±20)g ,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物合格證號:SCXK(京)2021-0011。在安靜環(huán)境下適應性飼養(yǎng)1周,飼養(yǎng)環(huán)境溫度25℃,濕度50%～60%。本實驗經河北中醫(yī)學院動物倫理委員會批準(DWLL2019004)。

1.1.2 英黃湯藥物制備:蒲公英20 g,生大黃9 g,赤芍12 g,白芍12 g,清半夏6 g,茯苓20 g,地榆20 g,當歸15 g,青皮15 g,仙鶴草20 g,川芎9 g,水蛭9 g,加入8倍體積水煎煮40 min,濃縮成2 g生藥/ml備用。上述中藥材飲片經由河北中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院藥學部提供,符合2015版《中國藥典》相關規(guī)定。

1.1.3 主要試劑與儀器:大鼠白介素6(IL-6,貨號:ml102828)、大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α,貨號:ml002859)、大鼠白介素1β(IL-1β,貨號:ml028514)ELISA試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司。BCA蛋白定量試劑盒(貨號:A045-4-2)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT,貨號:C009-1)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST,貨號:C0101-2-1)、血肌酐(SCr,貨號:CO11-2-1)、尿素氮(BUN,貨號:C013-2-1)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。總RNA提取試劑盒(貨號:DP419)、cDNA反轉錄試劑盒(貨號:KR116-02)、SYBR擴增試劑盒(貨號:P205-02)均購自天根生化科技(北京)有限公司。PI3K抗體(貨號:bs-10657R)、p-PI3K抗體(貨號:bs-6417R)、AKT抗體(貨號:bsm-33278M)均購自北京博奧森生物技術有限公司;p-AKT抗體(貨號:28731-1-AP)、P65抗體(貨號:80979-1-RR)、β-actin(貨號:20536-1-AP)均購自Proteintech公司;p-P65抗體(貨號:3033S)購自Cell Signaling Technology公司。地塞米松(貨號:D8040)購于北京索萊寶科技有限公司。全自動血液分析儀(型號:Sysmex XT-2000iv)、光學顯微鏡(型號:ECLIPSE E100)均購自Nikon公司;冷凍切片機(型號:CM3050S)購于Leica公司。

1.2 分組與造模方法

1.2.1 動物分組:2022年8—12月于河北省中醫(yī)藥科學院附屬醫(yī)院動物實驗室進行實驗,將240只大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組、地塞米松組、英黃湯低劑量組、英黃湯中劑量組及英黃湯高劑量組。其中模型組、地塞米松組、英黃湯低劑量組、英黃湯中劑量組及英黃湯高劑量組運用CLP法建立膿毒癥模型,假手術組大鼠只切開腹壁并縫合,不進行CLP。

1.2.2 膿毒癥大鼠模型的建立:運用CLP建立膿毒癥大鼠動物模型。術前12 h禁食不禁水,異氟烷氣體麻醉后前腹正中備皮,消毒腹部皮膚,于腹部正中做2 cm切口,取出盲腸后,游離腸系膜和盲腸,運用3-0手術縫合線在盲腸末端距離回盲部5 mm處進行結扎,于距結扎處遠端闌尾根部兩側腸壁0.8～1.0 cm處,運用注射器針頭(20G)做2次貫通穿孔,并擠出少量腸內容物,之后于盲腸貫穿孔中放置3 mm×0.5 mm×30 mm引流條,之后將盲腸放回腹腔,縫合切口。

1.2.3 干預方法:造模后假手術組與模型組灌胃生理鹽水2 ml,每12 h灌胃1次。地塞米松組腹腔注射地塞米松1 mg/kg,每日1次。英黃湯低、中、高劑量組分別灌胃英黃湯8.77 g生藥/kg、17.53 g生藥/kg、35.06 g生藥/kg,每12 h灌胃1次,各組均連續(xù)給藥3 d。英黃湯中劑量為人等效劑量,低劑量是中劑量的1/2,高劑量是中劑量的2倍,動物劑量和人等效劑量均根據體表面積折算[9]。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 大鼠生存率統(tǒng)計:每組大鼠分別選出20只進行生存率統(tǒng)計,大鼠在接受CLP后,每天統(tǒng)計各組大鼠存活的數量,連續(xù)觀察7 d,生存率=存活大鼠數量/20×100%,根據生存率繪制生存曲線。

1.3.2 血清PLT、PT、APTT、TT、Fib檢測:造模給藥72 h后,大鼠麻醉后固定,剖開腹腔,腹主動脈取血,EDTA-K2抗凝真空采血管收集血液200 μl,輕輕混勻,室溫靜置15 min,全自動血液分析儀進行血小板計數(PLT);再用枸櫞酸鈉抗凝真空采血管收集血液200 μl輕輕混勻,使用全自動血凝分析儀測定血漿凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血酶原時間(APTT)、凝血酶時間(TT)、纖維蛋白原(Fib)水平。

1.3.3 支氣管肺泡灌洗液(BALF)收集及總蛋白測定、肺組織濕重/干重(W/D)比值測定:造模給藥72 h后,將大鼠麻醉后固定,剪開喉嚨處皮膚,用鑷子分離周圍組織,暴露大鼠氣管。取1 ml注射器針頭,剪掉磨平針尖,在大鼠甲狀軟骨處插入針尖,絲線結扎固定。將1 ml PBS分2次注射肺內,每次均停留1 min后回收?；厥盏腂ALF于4℃,2 500 r/min離心10 min,回收上清液凍存于-80℃?zhèn)溆?使用BCA試劑盒檢測BALF總蛋白含量。取右肺組織,稱濕重后,置于60℃烘干箱烘干48 h,達到恒重,計算肺W/D比值。

1.3.4 血清ALT、AST、SCr、BUN測定:腹主動脈取血,輕輕混勻,室溫靜置15 min,使用全自動血液分析儀測定ALT、AST、SCr、BUN水平。

1.3.5 肺、肝、腎組織形態(tài)學測定:造模給藥72 h后,收集肺、肝、腎組織,清洗后置于4%多聚甲醛固定,脫水后進行石蠟包埋,切片機切成3 μm厚的切片,常規(guī)HE染色,中性樹膠封片,光學顯微鏡下顯像,觀察各組大鼠組織病理改變。

1.3.6 血清IL-6、IL-1β、TNF-α測定:將收集到的大鼠血液室溫靜置后離心10 min,轉速3 000 r/min,收集血清。按照ELISA試劑盒說明書檢測血清炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α指標。

1.3.7 qRT-PCR檢測大鼠肺組織IL-6、IL-1β、TNF-α基因水平:造模給藥72 h后,取各組大鼠肺組織,提取總RNA,逆轉錄合成cDNA。以cDNA作為模板,按照試劑盒說明分別加入引物和SuperReal PreMix Plus,反應條件:95℃15 min,95℃20 s,56℃20 s,40循環(huán)。使用2-△△CT進行數據定量分析。PCR引物見表1。

表1 IL-6、IL-1β、TNF-α、PCR引物序列

1.3.8 Western-blot檢測各組大鼠PI3K/AKT /NF-κB P65信號通路中相關蛋白表達:稱取肺組織樣品20 mg加入RIPA裂解液,然后12 000 r/min離心10 min后吸取上清至新的EP管中。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定得到的細胞上清液中蛋白質含量,確保各樣品蛋白質含量一致。各取20 μg樣品在密度為10%的分離膠進行電泳。從凝膠中分離的目標蛋白轉移到已被甲醇激發(fā)的PVDF膜上,使膜在5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h,之后加入PI3K(1∶1 000)、p-PI3K(1∶1 000)、AKT(1∶5 000)、p-AKT(1∶5 000)、P65(1∶5 000)、p-P65(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)4℃孵育過夜。第2 d使用1′TBST緩沖液洗膜3次,每次10 min。加入相應二抗(1∶8 000),室溫孵育2 h。膜用1′TBST洗膜3次,每次5 min。使用增強化學發(fā)光法使條帶可視化,以β-actin為內參,并通過凝膠成像分析系統(tǒng)成像,使用Image-J軟件分析各條帶灰度值。

2 結 果

2.1 各組大鼠生存率比較 造模給藥7 d后,假手術組大鼠生存率為100%,模型組大鼠生存率為30.0%(6/20),地塞米松組大鼠35.0%(7/20),英黃湯低劑量組生存率為30.0%(6/20),英黃湯中劑量組40.0%(8/20),英黃湯高劑量組生存率為45.0%(9/20)。

2.2 各組大鼠血清PLT、PT、APTT、TT、Fib比較 與假手術組相比,模型組大鼠血清PLT、Fib含量顯著減少(P<0.05),PT、APTT、TT時間顯著延長(P<0.05);與模型組相比,地塞米松組血清PLT、Fib含量顯著增加(P<0.05),PT、APTT、TT時間顯著縮短(P<0.05),英黃湯高、中劑量組血清PLT、Fib含量顯著增加(P<0.05),PT、APTT顯著縮短(P<0.05),英黃湯低劑量組PT、Fib水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);英黃湯各劑量組TT差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與地塞米松組相比,英黃湯中、高劑量組PLT含量顯著增加(P<0.05),英黃湯低劑量組PT、APTT顯著延長,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠血清PLT、PT、APTT、TT、Fib比較

2.3 各組大鼠BALF中總蛋白及肺組織W/D比值比較 與假手術組相比,模型組大鼠BALF中總蛋白含量顯著增加(P<0.05)、W/D比值顯著增大(P<0.05);與模型組相比,地塞米松組和英黃湯高、中劑量組BALF中總蛋白顯著減少(P<0.05)、W/D比值顯著減小(P<0.05),英黃湯低劑量組W/D比值降低(P<0.05);與地塞米松組相比,英黃湯高劑量組BALF中總蛋白含量、W/D比值顯著降低(P<0.05),英黃湯低劑量組BALF中總蛋白含量、W/D比值均升高(P<0.05),見表3。

表3 各組大鼠BALF中總蛋白及肺組織W/D比值比較

2.4 各組大鼠血清ALT、AST、SCr、BUN比較 與假手術組相比,模型組大鼠ALT、AST、SCr、BUN含量顯著增加(P<0.05);與模型組相比,地塞米松組及英黃湯中、高劑量組ALT、AST、SCr、BUN含量均顯著降低,英黃湯低劑量組SCr水平降低(P<0.05);與地塞米松組相比,英黃湯高劑量組ALT、BUN含量均降低(P<0.05),英黃湯低劑量組SCr升高(P<0.05),見表4。

表4 各組大鼠血清ALT、AST、SCr、BUN比較

2.5 各組大鼠肺、肝、腎組織病理結構比較 肺組織HE染色結果表明,模型組大鼠肺組織肺泡壁增厚,毛細血管擴張，肺間質充血伴有細胞浸潤;與模型組相比,地塞米松組、英黃湯各劑量組炎性細胞減少,肺泡組織結構趨于完整,病理損傷減輕。肝組織HE染色結果表明，模型組大鼠肝細胞排列散亂,肝索紊亂,肝細胞出現壞死,同時可觀察到明顯的炎性細胞浸潤;與模型組相比,地塞米松組、英黃湯各劑量組大鼠肝細胞排列較整齊,肝組織中炎性細胞浸潤均有所緩解。腎組織HE染色結果表明,模型組大鼠腎小球基底膜增生,腎間質炎性細胞浸潤明顯;與模型組相比,地塞米松組、英黃湯各劑量組腎臟組織炎性反應程度明顯減輕,見圖1。

圖1 各組大鼠肺、肝、腎組織病理結構比較(HE染色,×200)

2.6 各組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α比較 與假手術組相比,模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量均顯著升高(P<0.05);與模型組相比,地塞米松組、英黃湯各劑量組IL-6、TNF-α含量及英黃湯中、高劑量組IL-1β含量均降低(P<0.05);與地塞米松組相比,英黃湯低、中劑量組IL-6表達及低劑量組IL-1β表達均升高(P<0.05),見表5。

表5 各組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α比較

2.7 各組大鼠肺組織IL-6、IL-1β、TNF-α基因表達水平比較 與假手術組相比,模型組大鼠肺組織中IL-6、IL-1β、TNF-α基因表達顯著增高(P<0.05);與模型組相比,地塞米松組、英黃湯各劑量組IL-6、IL-1β、TNF-α基因表達顯著降低(P<0.05);與地塞米松組相比,英黃湯各劑量組IL-6、IL-1β、TNF-α基因表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖2。

注:與假手術組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05。

2.8 各組大鼠PI3K/AKT/NF-κBP65信號通路中相關蛋白表達的比較 Western-blot結果表明,與假手術相比,模型組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-P65/P65比值顯著上調(P<0.01);與模型組相比,地塞米松組及英黃湯中、高劑量組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-P65/P65比值均降低(P<0.05),英黃湯低劑量組p-PI3K/PI3K、p-P65/P65比值均降低(P<0.05);與地塞米松組相比,英黃湯各劑量組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-P65/P65比值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表6、圖3。

注:A.假手術組;B.模型組;C.地塞米松組;D英黃湯低劑量組;E.英黃湯中劑量組;F.英黃湯高劑量組。

表6 各組大鼠PI3K/AKT/NF-κBP65信號通路中相關蛋白表達的比較

3 討 論

根據膿毒癥相關癥狀,可將其歸屬于中醫(yī)學“傷寒”“溫病”范疇[10]。多數醫(yī)家認為機體正氣不足,引起毒邪內侵,導致毒熱、瘀血內生,腑氣不通、脈絡瘀滯而發(fā)生本病[11]。膿毒癥期機體多表現出毒熱內蘊,而通里攻下法是快速排出毒熱的有效方法[12]。同時毒熱久蘊,搏血為瘀,瘀阻脈絡,一方面血脈瘀滯,導致毒熱難祛,另一方面血脈瘀滯,藥物難以快速直達病灶[13]。梅建強教授結合多年的臨床經驗,以通腹泄熱、活血解毒為大法,創(chuàng)立中藥“英黃湯”,方中大黃蕩滌胃腸毒熱積滯,給邪出路,同時走血分破瘀血;蒲公英既能清解火熱毒邪,又善泄降滯氣,與大黃相伍解毒之力更強,二者共為君藥;青皮善走竄行氣,水蛭活血逐瘀,歸芍合川芎活血和血,仙鶴草通絡補虛,地榆涼血解毒,共為臣藥;茯苓健脾和胃,固護正氣;清半夏清熱祛痰、降逆,共為佐使之品。

本研究中,通過CLP方法構建的膿毒癥大鼠生存率與真實世界數據相符,且與相關文獻報道一致[14],英黃湯可以有效改善膿毒癥大鼠生存率。凝血功能障礙是膿毒癥病情進展和多器官功能障礙發(fā)生的重要因素[15]。CLP造模72 h后,模型組大鼠血清中PLT含量顯著降低,PT、APTT、TT時間明顯延長,Fib大量消耗;與模型組相比,英黃湯各劑量組大鼠血清中PLT含量顯著增加,PT、APTT時間明顯縮短,Fib含量增加,表明英黃湯能夠改善膿毒癥大鼠凝血功能。CLP造模72 h后,模型組大鼠肺組織BALF中蛋白含量顯著增加,W/D比值明顯增高, ALT、AST、SCr、BUN水平明顯增高,肺、肝、腎組織出現明顯損傷,經英黃湯干預,英黃湯各劑量組大鼠BALF中蛋白含量顯著減少、W/D比值明顯減小,ALT、AST、SCr、BUN水平明顯降低、肺、肝、腎組織損傷明顯減輕,表明英黃湯對膿毒癥大鼠肺肝腎組織具有明顯的保護作用。炎性因子是導致組織出現損傷的重要因素,過度活化的炎性反應也是膿毒癥病情進展的重要原因[16-19]。膿毒癥早期IL-6、TNF-α、IL-1β等炎性因子大量分泌,既可以早期診斷膿毒癥,對于膿毒癥預后也起到關鍵的作用[20-22]。造模給藥72 h后,模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著升高,肺組織中IL-6、IL-1β、TNF-α基因表達顯著增多,而經英黃湯干預,英黃湯各劑量組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著降低,肺組織中IL-6、IL-1β、TNF-α基因表達顯著減少,表明英黃湯能夠顯著減輕炎性反應,抑制炎性因子表達。

研究發(fā)現,PI3K/AKT通路是一條重要的信號傳導通路,參與大多數的炎性反應過程,AKT是PI3K的下游受體,在細胞增殖、分化、凋亡、遷移和轉錄等多種細胞過程中發(fā)揮著重要作用[23]。NF-κB家族成員眾多,其中發(fā)揮轉錄激活作用的是p65,因此p65又被視為該通路活化的標志[24]。 研究發(fā)現NF-κB 屬于炎性反應的中心介質,膿毒癥發(fā)生時,促進炎性因子釋放的同時,加重微血栓的形成,對于膿毒癥病情的發(fā)生及進展起到重要的作用[25]。造模給藥72 h后,模型組肺組織中PI3K/AKT/NF-κB P65蛋白水平較假手術組顯著增高,提示PI3K/AKT/NF-κB P65信號通路在炎性因子的刺激下,顯著激活;英黃湯各組大鼠肺組織中PI3K/AKT/NF-κB P65蛋白水平較模型組顯著下降。由此認為,英黃湯能夠抑制PI3K/AKT/NF-κB P65信號通路活化,減輕膿毒癥大鼠急性肺損傷,修復肺功能。

綜上所述,英黃湯可以改善CLP大鼠凝血功能障礙,保護肺、肝、腎功能,降低炎性反應水平,這些變化可能與抑制PI3K/AKT /NF-κB信號通路活化有關。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

郭軍利:設計研究方案,實施研究過程,分析實驗數據,搜集整理資料,論文撰寫;陶愚磊、鄭佳麗:參與實驗過程,分析實驗數據,搜集整理資料;梅建強、陳分喬:提出研究思路,指導實施研究;許文忠:提出研究思路,指導實施研究,論文審核