徐宗昌，魯雪莉，魏云沖，孟晨，張夢超，張緣楊，王萌，王菊英，張成省，李義強(qiáng)*

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所海洋農(nóng)業(yè)研究中心，山東 青島 266100；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 青島 266109；3. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 晉中 034100；4. 國家鹽堿地綜合利用技術(shù)創(chuàng)新中心，山東 東營 257345；5. 青島市濱海鹽堿地資源挖掘與生物育種重點實驗室，山東 青島 266100）

土壤鹽漬化是制約現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的世界性難題之一，一般情況下能夠?qū)е伦魑餃p產(chǎn)15%～20%，嚴(yán)重的甚至絕產(chǎn)［1］。世界范圍內(nèi)超過100 多個國家的近20%的耕作土地正在遭受土壤鹽漬化的威脅［2］。中國鹽漬化土地面積約有3600 萬hm2，約占全國可利用土地資源的4.88%［3］，是非常重要的后備耕地資源。培育耐鹽作物品種、牧草品種是提高鹽漬化土地利用程度的重要方式。

航天誘變是指利用返回式衛(wèi)星或載人飛船搭載生物材料進(jìn)入太空環(huán)境，利用外太空微重力、強(qiáng)輻射以及弱地磁等誘導(dǎo)生物材料產(chǎn)生可遺傳變異的一種特殊的誘變育種手段。相較于傳統(tǒng)育種方式動輒10 年起步的育種周期而言，航天誘變新品種育成平均5 年，通常在第3、4 代性狀就開始穩(wěn)定［4］，育種周期大大縮短。因此，自20 世紀(jì)60 年代初期，蘇聯(lián)學(xué)者開始進(jìn)行航天誘變研究以來，美國、中國等國家相繼開展了航天誘變育種工作［5-6］。目前，我國的航天育種技術(shù)走在世界前列，已經(jīng)開展了包括農(nóng)作物、蔬菜、花卉、牧草、中藥材、木本植物等在內(nèi)的上千個植物材料的誘變工作，育成品種500 多個，累計推廣面積超過13.33 萬hm2［7-10］，極大地豐富了各種作物品種資源和遺傳背景。

野大豆（Glycine soja）是栽培大豆的近緣野生種，起源于中國，在國內(nèi)各省份分布廣泛。野大豆籽粒營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、脂肪以及異黃酮等功能活性物質(zhì)，藥用食用均可［11］；莖細(xì)而軟，粗纖維含量低，青飼時鮮嫩多汁，干草柔軟，是良好的飼草原料［12］；另外，野大豆耐鹽堿能力突出，篩選耐鹽堿的野大豆種質(zhì)材料進(jìn)行飼草品種培育或與大豆雜交培育各種耐鹽種質(zhì)材料在鹽堿地上應(yīng)用，是踐行“以種適地”鹽堿地綜合利用的有效途徑。

目前，通過航天誘變方式育成的大豆品種已有報道，并指出品質(zhì)育種應(yīng)在SP1代開始選擇，產(chǎn)量和高光效育種則分別從SP2和SP3代開始選擇為宜［13］，但尚未見關(guān)于野大豆航天誘變材料的相關(guān)報道。逆境條件對作物的品質(zhì)和產(chǎn)量均會產(chǎn)生影響，因此本研究以黃河三角洲地區(qū)野大豆為材料，對航天誘變SP1群體苗期進(jìn)行鹽脅迫處理，通過多指標(biāo)綜合分析、主成分分析、隸屬函數(shù)綜合評價等多元統(tǒng)計方法，建立系統(tǒng)的野大豆種質(zhì)資源耐鹽評價體系，從SP1代開始進(jìn)行野大豆耐鹽突變材料的鑒定，為優(yōu)異資源發(fā)掘交換、耐鹽機(jī)理解析、航天誘變?nèi)后w耐逆篩選時期以及品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗野大豆材料取自東營黃三角農(nóng)高區(qū)野外（37°17' N，118°37' E），經(jīng)單粒傳法［14］獲得遺傳背景相對一致的繁育材料于實驗室內(nèi)長期保存。濃硫酸處理脫泥膜后，野大豆種子經(jīng)神舟十二號載人飛船于2021 年6-9 月搭載3 個月后返回地面，獲得野大豆SP1群體。

1.2 試驗設(shè)計

于2022 年3 月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所植物培養(yǎng)間內(nèi)開展試驗。挑選籽粒大小基本一致的150 粒種子，播種于裝滿蛭石的32 孔育苗盤中（規(guī)格540 mm×280 mm×53 mm），每個穴孔播種1 粒，播種深度1 cm。從育苗盤底部倒入2 L 1/10 MS 營養(yǎng)液，在光周期為16 h 光照，8 h 黑暗，溫度（24±1） ℃，濕度60%的植物培養(yǎng)間進(jìn)行培養(yǎng)。待80%植株子葉完全展開時，從育苗盤底部加入3 L 150 mmol·L-1NaCl 溶液，使蛭石中鹽溶液處于飽和狀態(tài)。蛭石缺水時，均從育苗盤底部加入過量的150 mmol·L-1NaCl 溶液，以充分淋洗蛭石中的鹽分，使鹽溶液濃度維持穩(wěn)定。試驗過程中NaCl 溶液均使用1/10 MS 營養(yǎng)液配置。

1.3 調(diào)查指標(biāo)

鹽脅迫7 d 后，剔除SP1群體中包括子葉不伸展、無生長點以及植株明顯矮化不再生長的各種突變類型，調(diào)查植株株高（7 d plant height， 7PH）、下胚軸長（7 d hypocotyl length， 7HL）和下胚軸粗（7 d hypocotyl diameter，7HD，子葉處）；鹽脅迫21 d 后調(diào)查植株株高（21 d plant height， 21PH）、下胚軸長（21 d hypocotyl length， 21HL）、莖粗（21 d stem diameter， 21DD，子葉處）、葉綠素a 含量（content of chlorophyll a， CCA）、葉綠素b 含量（content of chlorophyll b， CCB）、葉面積（leaf area， LA）、單葉鮮重（fresh weight of leaf， FWL）和單葉干重（dry weight of leaf， DWL）等11 個指標(biāo)。其中葉面積、單葉鮮重和單葉干重調(diào)查植株的第一對真葉平均值，真葉使用Canon 5D Mark III（日本）拍照后，用Image J 軟件（https：//imagej. net/software/fiji/，F(xiàn)iji 版）進(jìn)行面積測量；葉片干鮮重使用萬分之一電子天平稱重。葉綠素a 和葉綠素b 使用植株的第2～4 片真葉包括復(fù)葉進(jìn)行測量，植株生理指標(biāo)丙二醛（malondialdehyde， MDA）、過氧化物酶（peroxidase， POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）和過氧化氫酶（catalase， CAT）的含量使用植株剩余葉片測量。上述指標(biāo)的測定方法按照薛秀棟等［15］的報道進(jìn)行，其中葉綠素含量測定使用分光光度計法，MDA 含量測定使用硫代巴比妥比色法，POD 活性測定使用愈創(chuàng)木酚法，SOD 活性測定使用氮藍(lán)四唑法，CAT 活性測定使用紫外吸收法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel、SPSS 24.0 等軟件進(jìn)行平均值、極值、方差、顯著性分析、相關(guān)性分析、主成分分析以及聚類分析等多元分析內(nèi)容。用到的相關(guān)公式如下：

式中：U表示隸屬函數(shù)值，Xij表示第i個種質(zhì)的第j個主成分分值，Xjmax表示第j個主成分的最大值，Xjmin表示第j個主成分的最小值。

式中：權(quán)重wj表示第j個主成分的重要程度，pj表示第j個主成分的貢獻(xiàn)率。

式中：D值表示第i個誘變材料在鹽脅迫條件下的耐鹽性綜合評價值，根據(jù)D值將突變體材料劃分為4 個耐鹽等級：0.75≤D≤1.0，高耐鹽；0.50≤D＜0.75，耐鹽；0.25≤D＜0.50，中間型；0≤D＜0.25，不耐鹽。最后，根據(jù)D值采用歐式距離，最短距離法對129 個SP1個體進(jìn)行聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下野大豆SP1群體苗期各性狀變異分析

苗期11 個性狀的調(diào)查結(jié)果如表1 所示，各個指標(biāo)的變異系數(shù)為6.45%～51.78%。在11 個指標(biāo)中，以21 d 株高、7 d 株高和葉面積3 個指標(biāo)的變異系數(shù)較大，分別為51.78%，24.96%和24.03%，說明其對鹽脅迫的響應(yīng)較為靈敏；葉綠素a（6.45%），7 d 下胚軸粗（11.09%）和葉綠素b（11.20%）這3 個指標(biāo)的變異系數(shù)相對較小，說明鹽脅迫對這些指標(biāo)的影響較小。

表1 野大豆SP1群體鹽脅迫下各性狀變異統(tǒng)計Table 1 Variation analysis of characters in SP1 population of wild soybean under salt stress

2.2 指標(biāo)相關(guān)性分析

對11 個鹽脅迫下性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表2 所示，7 d 株高與21 d 株高、單葉鮮重和單葉干重呈顯著正相關(guān)，與7 d 下胚軸長和葉面積呈極顯著正相關(guān)；7 d 下胚軸長與21 d 下胚軸長呈顯著正相關(guān)，與7 d 下胚軸粗呈顯著負(fù)相關(guān)，與單葉鮮重和單葉干重呈極顯著正相關(guān)；7 d 下胚軸粗與21 d 莖粗呈極顯著正相關(guān)，但與21 d 株高呈極顯著負(fù)相關(guān)；21 d 株高與21 d 下胚軸長和單葉鮮重呈顯著正相關(guān)，與葉綠素b 呈極顯著正相關(guān)，但與21 d 莖粗呈極顯著負(fù)相關(guān)；21 d 下胚軸長與葉面積呈極顯著正相關(guān)，與21 d 莖粗呈顯著負(fù)相關(guān)；21 d 莖粗與葉綠素b 呈顯著正相關(guān)，與單葉鮮重和單葉干重呈極顯著負(fù)相關(guān)；葉綠素a 與單葉鮮重呈極顯著正相關(guān)；葉面積與單葉鮮重和單葉干重呈極顯著正相關(guān)；單葉鮮重與單葉干重呈極顯著正相關(guān)。

表2 野大豆SP1群體鹽脅迫下各個指標(biāo)相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of each index in SP1 population of wild soybean under salt stress

2.3 主成分分析

對在150 mmol·L-1濃度鹽脅迫下的11 個調(diào)查指標(biāo)進(jìn)行主成分分析。根據(jù)特征值大于1 和累計貢獻(xiàn)率大于90%的原則，共提取到5 個主成分，各成分的貢獻(xiàn)率分別為36.49%、15.56%、12.36%、16.67%和10.64%，累計貢獻(xiàn)率達(dá)到91.72%，可代表11 個單一指標(biāo)的絕大部分信息。各主成分因子的特征值，對原始指標(biāo)的載荷矩陣和對表型的貢獻(xiàn)率如表3 所示。主成分因子I 主要與7 d 下胚軸長、21 d 株高和21 d 莖粗等性狀密切相關(guān)；主成分因子II 主要與葉綠素b、葉面積和單葉鮮重等密切相關(guān)；主成分因子III 主要對7 d 下胚軸粗、21 d 莖粗和葉綠素a 等性狀發(fā)揮作用；主成分因子IV 主要與7 d 株高、7 d 下胚軸長和21 d 下胚軸長等性狀密切相關(guān)；而主成分因子V 主要與葉綠素b、單葉鮮重和單葉干重等性狀密切相關(guān)。綜上，通過主成分分析將鹽脅迫下野大豆SP1群體的11 個耐鹽相關(guān)指標(biāo)轉(zhuǎn)換為了5 個獨立的綜合指標(biāo)，以用于下一步的耐鹽綜合評價分析。

表3 前5 個主成分的特征值及特征向量描述Table 3 Eigen values and eigenvectors of the first five principal components

2.4 耐鹽性綜合評價

根據(jù)不同SP1個體野大豆的主成分值，利用公式1）計算5 個綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，利用公式2）計算各主成分的權(quán)重，5 個主成分的權(quán)重值分別為0.3978，0.1697，0.1347，0.1817 和0.1160。得到綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值和各自權(quán)重后，根據(jù)公式3）進(jìn)一步計算各SP1群體個體的耐鹽性綜合評價指標(biāo)D值。各材料D值范圍為0.1890～0.8981，綜合評價D值越高代表材料的耐鹽能力越強(qiáng)，根據(jù)評判標(biāo)準(zhǔn)，共鑒定到高耐鹽材料10 份（0.7582≤D≤0.8981），耐鹽材料53 份（0.5031≤D≤0.7451），中間型材料63 份（0.2505≤D≤0.4901）以及3 份不耐鹽材料（0.1890≤D≤0.2340）（表4）。

2.5 聚類分析

利用不同野大豆突變株系耐鹽性評價值D值，根據(jù)最短距離法對129 份野大豆突變株系進(jìn)行聚類。如圖1 所示，所有供試材料被劃分成了4 類，各亞類較好地對應(yīng)了野大豆突變株系耐鹽（含高耐鹽）、中間型和不耐鹽4 個耐鹽級別。第I 類包含32 份材料，D值為0.5093～0.8930，其中包含8 份高耐鹽材料和24 份耐鹽材料；第IV 類包含31 份材料，D值為0.3633～0.8981，其中包含2 份高耐鹽材料，2 份中間型材料和27 份耐鹽材料；第III 類包括62份材料，D值為0.2505～0.6373，包含60 份耐鹽性中等的中間型材料和2 份耐鹽材料；第II 類包含4 份材料，D值為0.1890～0.3410，是SP1群體中相對最不耐鹽的材料，包括不耐鹽材料3 份和中間型材料1 份。

圖1 129 份野大豆材料D 值聚類分析Fig.1 D-value cluster of 129 wild soybean materials

2.6 生理指標(biāo)測定

從不同耐鹽等級材料中各隨機(jī)挑選1 份，測定鹽脅迫下葉子MDA 含量和抗氧化酶活性（圖2）。除POD 活性為高耐鹽材料（SP1-29）顯著高于不耐鹽材料（SP1-40）外（圖2D），MDA 含量、SOD 和CAT 活性在四類耐鹽性不同的野大豆突變材料中差異不顯著（圖2A～C），這說明POD 在野大豆航天誘變材料的耐鹽性中發(fā)揮重要作用。

圖2 代表性誘變個體生理指標(biāo)測定Fig.2 Physiological indexes of representative mutagenic individuals

3 討論

“以種適地”提高鹽堿地產(chǎn)能和利用效率，是綜合利用鹽堿地的有效手段，而獲得良好的耐鹽植物品種是實現(xiàn)這一目標(biāo)的前提。航天誘變是一種特殊的物理誘變方式，通過后期持續(xù)選育不僅能夠有效獲得性狀穩(wěn)定的遺傳材料，而且還能大幅縮短育種時間［4］。與其他理化誘變類似，誘變方式造成的非致死性遺傳損傷一般都會遺傳給下一代，并且在自交繁殖的過程中逐漸純合。因此航天誘變材料在SP1當(dāng)代就能夠表現(xiàn)出農(nóng)藝性狀差異［16］。王瑞珍等［17］研究指出，大豆SP1群體的發(fā)芽率、熟期、株高、單株總莢數(shù)等性狀指標(biāo)與未經(jīng)搭載的大豆相比都發(fā)生了顯著變化。本研究統(tǒng)計了鹽脅迫下野大豆SP1群體苗期的11 個指標(biāo)，變異系數(shù)為6.45%～51.78%，以株高和葉面積為主的農(nóng)藝性狀變異系數(shù)較大（表1），這說明野大豆SP1群體的確表現(xiàn)出了性狀變異，與前人研究一致。

一般而言，SP2～SP4世代是航天誘變材料后代分離和性狀篩選的主要世代。棉花（Gossypiumspp.）SP3世代纖維品質(zhì)變異程度大且范圍廣，篩選出的突變體一般都有比較好的產(chǎn)量性狀［18］。大豆SP2代對光合相關(guān)性狀如凈光合速率等選擇效率較低，但在SP3和SP4代進(jìn)行篩選效果則很好［19］。單株有效莢數(shù)、底莢高度、單株粒數(shù)以及節(jié)間長度等性狀在SP2代篩選效果較好，但是對株高和有效節(jié)數(shù)的篩選作用較差［20］?？偟膩碚f，大豆航天品質(zhì)育種應(yīng)在SP1代開始選擇，產(chǎn)量性狀從SP2代開始選擇為宜，而高光效品種的選擇則從SP3代開始效率較高［13］。雖未見從低代開始進(jìn)行耐鹽植株篩選的報道，但是對野大豆航天突變材料開展耐鹽評價和耐鹽株系篩選，對后期在高世代誘變?nèi)后w中進(jìn)行耐鹽材料的篩選具有指導(dǎo)意義。

國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者在作物耐鹽評價和篩選方面開展了大量卓有成效的工作，普遍認(rèn)為鹽脅迫在作物的不同生育時期危害性不同，苗期對鹽脅迫尤為敏感［21］。目前對野大豆耐鹽性的研究多集中在芽期，以適應(yīng)NaCl 單鹽或者復(fù)合鹽溶液濃度為主要方向［22-24］，也有開展鹽脅迫對野大豆苗期單一生理性狀指標(biāo)如光合相關(guān)指標(biāo)［25］、抗氧化酶活性［23］以及鈉鉀含量和鹽誘導(dǎo)基因表達(dá)等影響的相關(guān)研究［26］，但是關(guān)于野大豆苗期耐鹽性綜合評價方法和耐鹽品系篩選的研究較少［27］。在本研究中，采用主成分分析方法降低測定指標(biāo)維度，將多個相互關(guān)聯(lián)的指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個相互獨立且能最大程度上反映樣本特征的指標(biāo)，通過主成分隸屬函數(shù)和貢獻(xiàn)率計算每一個株系的耐鹽綜合評價指標(biāo)D值，建立起的綜合評價體系將對后續(xù)野大豆耐鹽評價起到指導(dǎo)作用。

丙二醛（MDA）是植物細(xì)胞膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，通常用來作為評價脂質(zhì)過氧化程度的指標(biāo)［15］。鹽脅迫等逆境脅迫通常會造成植物膜系統(tǒng)損傷，因而MDA 含量也通常用作表示植物遭受逆境損傷的指標(biāo)。在使用不同濃度NaCl 溶液處理多個野大豆種質(zhì)材料時，MDA 含量隨鹽濃度的升高逐漸增加［23］，表明MDA 是野大豆鹽脅迫響應(yīng)的一個指示因子。在野大豆SP1群體中，不耐鹽的突變材料MDA 含量雖與耐鹽材料相比無統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著差異，但是含量也高于多個耐鹽突變材料（圖2A），這與趙如皓等［25］的研究結(jié)果基本一致。另外，抗氧化酶也是植物抵御鹽脅迫的一個重要途徑。在SOD、CAT 和POD 等抗氧化酶的作用下，由鹽脅迫導(dǎo)致的超氧陰離子被逐漸分解成水和氧氣［28］。在本研究中，鑒定到的不同耐鹽分級的野大豆突變材料，其SOD 和CAT 活性在鹽脅迫下沒有顯著差異（圖2B 和C），但是POD 活性在不耐鹽的株系中較高耐鹽材料顯著降低（圖2D）。而在其他區(qū)域的耐鹽野大豆種質(zhì)材料中也有類似的現(xiàn)象，即抗鹽能力較強(qiáng)的種質(zhì)其POD 活性也高［23］，這說明POD 很可能是野大豆響應(yīng)鹽脅迫的重要途徑。

4 結(jié)論

鹽脅迫下野大豆SP1群體農(nóng)藝性狀變異豐富，株高性狀變異系數(shù)最大。檢測的11 個性狀指標(biāo)歸為5 個主成分，通過對主成分進(jìn)行隸屬函數(shù)和權(quán)重分析，構(gòu)建了基于D值的野大豆SP1群體耐鹽綜合評價指標(biāo)和體系，共篩選出高耐鹽材料10 份，耐鹽材料53 份，中間型材料63 份以及3 份不耐鹽材料。生理指標(biāo)測定表明POD 在野大豆耐鹽過程中發(fā)揮重要作用。