張曉波 劉慧婷 劉元茹 左凡 王志霞 任倩倩 姚瑤 陳艷 高騫 盛菊萍 張振新

[摘 ? 要] ? 目的：分析下咽鱗狀細(xì)胞癌（hypopharyngeal squamous cell carcinomas，HSCC）組織中SRY相關(guān)HMG-box轉(zhuǎn)錄因子4（SRY-box transcription factor-4，SOX4）的表達(dá)及其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。觀察siRNAs敲低FaDu人咽鱗癌細(xì)胞中SOX4表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖、遷移及裸鼠成瘤的影響。方法：（1）選取下咽癌石蠟切片標(biāo)本76例，癌旁正常組織標(biāo)本18例作為對(duì)照，采用免疫組化檢測(cè)SOX4和Ki67的表達(dá)水平。（2）選取6對(duì)新鮮的下咽癌組織和相鄰正常組織，采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)SOX4表達(dá)水平。（3）運(yùn)用siRNAs敲低FaDu細(xì)胞中SOX4表達(dá)。（4）饑餓釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SOX4在增殖期FaDu細(xì)胞中的表達(dá)水平，CCK-8法檢測(cè)FaDu細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的分布，Transwell試驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。（5）Western blot檢測(cè)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesendyinal transition，EMT）相關(guān)分子的表達(dá)。（6）裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)觀察SOX4對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。結(jié)果：（1）與癌旁正常組織相比，HSCC組織中SOX4表達(dá)明顯升高，與腫瘤分化程度、腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ki67表達(dá)相關(guān)（P＜0.05）。（2）SOX4高表達(dá)患者生存期較短。（3）增殖期FaDu細(xì)胞SOX4和PCNA的表達(dá)同步明顯增加。（4）SOX4-Si2處理后FaDu細(xì)胞中SOX4染色強(qiáng)度顯著降低，細(xì)胞增殖能力明顯下降，細(xì)胞停滯于G1期，S期細(xì)胞減少。（5）SOX4-Si2干擾后FaDu細(xì)胞劃痕愈合能力明顯下降，細(xì)胞遷移數(shù)減少，上皮表型標(biāo)志物β-連環(huán)蛋白和E-鈣粘蛋白表達(dá)顯著增加，而間質(zhì)表型標(biāo)志物波形蛋白和N-鈣粘蛋白表達(dá)顯著降低。（6）裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示，SOX4-Si2干擾后裸鼠腫瘤生長(zhǎng)受到顯著抑制，Ki-67陽性率增高。結(jié)論：SOX4在HSCC中過表達(dá)，SOX4在體內(nèi)外對(duì)下咽癌的進(jìn)展和遷移起著重要作用，可作為下咽癌患者診斷和治療的分子靶標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] ? 下咽鱗狀細(xì)胞癌；FaDu細(xì)胞；SOX4；上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；動(dòng)物模型

[中圖分類號(hào)] ? R739.63 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] ? A [DOI] ? 10.19767/j.cnki.32-1412.2023.03.002

The expression of SOX4 in hypopharyngeal carcinoma

and its effect on biological behavior of cancer cells

ZHANG Xiaobo1，2， LIU Huiting3， LIU Yuanru1， ZUO Fan4， WANG Zhixia1，

REN Qianqian1， YAO Yao1， CHEN Yan5， GAO Qian6， SHENG Juping1， ZHANG Zhenxin1

（1Departments of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery， 4Department of Stomatology， Affiliated Hospital of Nantong University， Jiangsu 226001; 2Departments of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery， Jiangyin Peoples Hospital;

3Departments of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery， Affiliated Kunshan Hospital of Jiangsu University;

5Departments of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery， Xiangya Changde Hospital; 6Departments of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery， Traditional Chinese Medicine Hospital of Kunshan）

[Abstract] ? Objective： To investigate the expression of SOX4 in hypopharyngeal squamous cell carcinoma （HSCC） tissues and the relationship between SOX4 expression level and clinicopathological features and prognosis. In vivo experiments， using siRNAs to knockdown the expression of SOX4 in FaDu human hypopharyngeal squamous cells， to explore the effect on cell proliferation， migration and tumor formation in nude mice. Methods： （1）Using immunohistochemistry to detect SOX4 and Ki-67 expression in 76 cases of paraffin-embedded HSCC and 18 cases of para-cancerous tissue samples. （2）Using western blot to examine SOX4 expression in 6 fresh pairs of HSCC cancer tissues and adjacent normal tissues. （3）SOX4-siRNAs were used to knockdown the expression of SOX4 in HSCC cell line FaDu. （4）Serum-starving experiment was used to determine expression level of SOX4 in proliferating FaDu cells. Cell viability， cell cycle and cell migration were assessed by CCK-8， flow cytometry， and wound-healing and transwell assays. （5）Using western blot to detect the expression of epithelial mesenchymal transition （EMT） related molecules. （6）Nude mice subcutaneous xenografts experiment was performed to investigate the effect of SOX4 on tumor growth. Results： （1）Compared with para-cancerous tissues， SOX4 expression significantly increased in HSCC specimens and its expression level was associated with differentiation， tumor size， clinical stage， lymph node metastasis and Ki-67 expression （P＜0.05）. （2）The survival time of patients with high SOX4 expression was shorter. （3）The expression of SOX4 and PCNA in FaDu cells increased significantly during proliferating phase. （4）After SOX4-Si2 treatment， the SOX4 staining intensity in FaDu cells decreased significantly， the cell proliferation ability decreased， the cells stagnated in G1 phase， and the cells in S phase decreased. （5）After SOX2-Si2 interference， the scratch healing ability of FaDu cells significantly decreased， the cell migration number decreased， and the expression of β-catenin and E-cadherin which were epithelial phenotype markers increased， while the expression of vimentin and N-cadherin which were interstitial phenotype markers significantly decreased. （6）The tumor formation experiment of nude mice showed that the tumor growth of nude mice was significantly inhibited after SOX4-Si2 interference， and the positive rate of Ki-67 increased. Conclusion： SOX4 is overexpressed in HSCC and plays an important role in the progression and migration of HSCC in vitro and vivo. It can be used as a molecular target for diagnosis and treatment of HSCC.

[Key words] ? hypopharyngeal squamous cell carcinoma; FaDu cell; SRY-box transcription factor-4; epithelial mesenchymal transition; animal model

下咽鱗狀細(xì)胞癌（hypopharyngeal squamous cell carcinomas，HSCC）占所有頭頸部鱗狀細(xì)胞癌3％～5％，近年來其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。超過75％HSCC患者診斷時(shí)疾病已處于晚期，局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較高，預(yù)后較差，5年總體生存率為15％～45％[2-4]。早期診斷和治療對(duì)降低HSCC死亡率非常關(guān)鍵。深入研究HSCC發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找用于早期檢測(cè)和開發(fā)新治療方案的標(biāo)志物具有重要意義。轉(zhuǎn)錄因子家族成員SOX4編碼由474個(gè)氨基酸組成的分子量為47 kD的蛋白質(zhì)，SOX4包含四個(gè)主要部分：HMG盒（DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域）和TAD（反式激活結(jié)構(gòu)域），在中心部位還有一個(gè)富含甘氨酸的區(qū)域和一個(gè)富含絲氨酸的區(qū)域[5-6]。已證實(shí)SOX4在胚胎發(fā)育、細(xì)胞命運(yùn)決定和分化中發(fā)揮重要作用。SOX4參與抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移以及癌癥干細(xì)胞的產(chǎn)生和維持[7-8]。本研究選取南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科2009年1月—2022年10月76例HSCC組織和18例癌旁正常組織石蠟標(biāo)本，6對(duì)新鮮HSCC組織及其相鄰正常組織以及FaDu人咽鱗癌細(xì)胞株，旨在探索SOX4在HSCC中的表達(dá)及其對(duì)癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 對(duì)象與材料 ? （1）組織標(biāo)本：76例HSCC組織石蠟標(biāo)本，患者術(shù)前未作放化療，均經(jīng)病理確診，以同期18例癌旁正常組織石蠟標(biāo)本作為對(duì)照。同時(shí)收集手術(shù)切除的6對(duì)新鮮HSCC組織及其相鄰正常組織，存儲(chǔ)于-80 ℃低溫冰箱保存。本研究經(jīng)南通大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者或其家屬知情同意。（2）FaDu人咽鱗癌細(xì)胞株：購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（3）6周齡雄性BALB/C無胸腺裸鼠由南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供和飼養(yǎng)。

1.2 ? 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ? 免疫組化（immunohistochemistry，IHC）檢測(cè)HSCC組織中SOX4表達(dá)：組織石蠟切片常規(guī)烤片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化。置于枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中煮沸15～20 min，冷卻至室溫，PBS沖洗3次。切片置于3%H2O2，37 ℃ 15 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。以羊血清工作液封閉，37 ℃ 40 min。滴加一抗，4 ℃冰箱過夜。滴加生物素標(biāo)記二抗，37 ℃孵育30 min。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min。DAB染色，自來水沖洗后蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥，中性樹脂封片。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：400倍顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況。染色細(xì)胞百分比為A類評(píng)分，0～4％計(jì)0分， 5％～25％計(jì)1分，26％～50％計(jì)2分，51％～75％計(jì)3分，76％～100％計(jì)4分。染色強(qiáng)度為B類評(píng)分，陰性計(jì)0分，弱陽性計(jì)1分，中等陽性計(jì)2分，強(qiáng)陽性計(jì)3分。A×B為IHC最終得分，0～5分為低表達(dá)或不表達(dá)，6～12分為高表達(dá)。

1.2.2 ? Western blot印跡法：采用Western blot檢測(cè)SOX4、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、E-鈣粘蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、N-鈣粘蛋白（N-cadherin）表達(dá)量。稱取適量HSCC組織或癌旁組織，碾碎，加入RIPA裂解液，置于冰上20 min。將裂解產(chǎn)物移至EP管中，4 ℃下離心取上清液。加入loading buffer，沸水煮15 min后置于-80 ℃冰箱備用。FaDu細(xì)胞蛋白提取方法同組織蛋白提取。根據(jù)目的蛋白分子量選定分離膠濃度為10%，制備SDS-PAGE凝膠，在電泳液中進(jìn)行電泳。組裝轉(zhuǎn)膜夾層，在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜液中轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜移至含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，室溫下?lián)u床均勻封閉2 h。用含5%脫脂奶粉的TBS緩沖液稀釋一抗，4 ℃孵育過夜。取出濕盒室溫復(fù)溫40 min，TBST洗膜3次。TBS稀釋二抗，室溫下孵育1 h。TBST洗膜3遍。膜在暗房加入ECL試劑，膠片曝光、顯影，定影后掃膜備用。利用Image J軟件計(jì)算條帶的灰度值。

1.2.3 ? 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：（1）取生長(zhǎng)良好的FaDu細(xì)胞種植于6孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)50%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分為轉(zhuǎn)染組、空轉(zhuǎn)組及對(duì)照組，轉(zhuǎn)染組根據(jù)SOX4敲低位點(diǎn)不同分為Si1、Si2、Si3、Si4四組。（2）配置轉(zhuǎn)染試劑：2支EP管中分別加入A液（10 μL siRNA+240 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基）、B液（5 μL Lipofectamine 2 000+245 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基），混合后靜置5 min。將B液加入A液中充分混合，靜置20 min。6孔板中加入新鮮無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基1 500 μL，再加入AB混合液。（3）4～6 h后換上含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。（4）48 h后提取細(xì)胞RNA，72 h后提取細(xì)胞蛋白，利用RT-qPCR及Western blot印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 ? 血清饑餓釋放實(shí)驗(yàn)：取生長(zhǎng)良好的FaDu細(xì)胞于無血清DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后，換成含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)0 h、6 h、12 h、24 h、36 h。收集各組細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)和Western blot印跡法檢測(cè)細(xì)胞周期、SOX4蛋白和PCNA蛋白表達(dá)水平。

1.2.5 ? RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)SOX4 mRNA表達(dá)：（1）提取總RNA：FaDu細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，以無菌PBS清洗2次，每孔加入1 mL Trizol充分裂解，將裂解產(chǎn)物移至去RNA酶EP管中，加入0.2 mL氯仿震蕩15 s。4 ℃下12 000 r/min離心15 min，吸取無色上層液至另一支去RNA酶EP管，加入0.5 mL異丙醇，混勻，靜置10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清。每管加入1 mL DEPC水配置的75%乙醇，4 ℃下7 500 r/min離心5 min，棄上清。室溫中晾干，每管加入20 μL DEPC水溶解，測(cè)定樣品RNA濃度。（2）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：去RNA酶EP管中分別加入Oligo（dT）1 μL，RNA（0.1～5 μg）加DEPC水11 μL，70 ℃ 5 min，立即冰上冷卻。加入核糖核酸酶抑制劑1 μL，dNTPmix（10 mmol/L）2 μL，5×Reactin Buffer 4 μL，混勻，再加入1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶。42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min終止反應(yīng)，即刻置于-20℃ 保存。（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）：引物序列為SOX4 F：5-CACTCCTCCTCTTCCTCCTC-3，R：5-GCCGA-

CGACGAACTGAAG-3；GAPDH F：5-CAGACTATCAAGGAGGAAG-3，R：5-CCAGGAGTGAGATG-

ATTC-3。反應(yīng)體系：cDNA（1 ∶ 20）2 μL，上、下游引物2 μL，SYBR Green PCR Master：Mix 10 μL、H2O 6 μL，總體系20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)40次。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.6 ? 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布：收集生長(zhǎng)良好的FaDu細(xì)胞，4 ℃ PBS清洗3遍，胰酶消化后制成細(xì)胞懸液。4 ℃下1 200 r/min離心5 min，棄PBS，重復(fù)2次。加入預(yù)冷70%乙醇1 mL固定細(xì)胞24 h。取出細(xì)胞1 200 r/min離心5 min，棄去乙醇，預(yù)冷PBS洗滌3次，每管加入1%Triton X-100 200 μL 10 min。再加入RNaseA（100 μL/mL）100 μL，4 ℃避光反應(yīng)20 min。每管加入200 μL PI染色試劑（0.5 mg/mL），冰上染色20 min。流式細(xì)胞儀（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm）分析細(xì)胞周期分布。

1.2.7 ? CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力：將FaDu細(xì)胞種入96孔板，每孔約8 000個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h吸凈孔中培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK8試劑+90 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合液，孵育90 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處OD值。

1.2.8 ? 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力：將FaDu細(xì)胞種入6孔板中，待細(xì)胞融合80%左右進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分為轉(zhuǎn)染組、空轉(zhuǎn)組和對(duì)照組。用10 μL槍頭對(duì)每孔劃“井”字，以無菌PBS洗去劃落細(xì)胞，每孔加入無血清DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別于轉(zhuǎn)染后0 h、36 h在顯微鏡下拍照。

1.2.9 ? Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力：將FaDu細(xì)胞種入6孔板中進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分為轉(zhuǎn)染組、空轉(zhuǎn)組和對(duì)照組。取24孔板，每孔加入500 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，將小室置入孔中。用胰酶消化轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，將5×104個(gè)細(xì)胞/200 μL加入上室中。36 h后PBS洗滌細(xì)胞2次，棉簽擦洗干凈上室。外室中每孔加入多聚甲醛固定30 min。小室晾干后置入結(jié)晶紫染色20 min，自來水沖洗干凈，晾干。顯微鏡下觀察、拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.2.10 ? 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)：裸鼠分為NC組和干擾組，每組5只。干擾組裸鼠肩部皮下注射2×106個(gè)SOX4-Si2處理的FaDu細(xì)胞，NC組注射相同數(shù)量的轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的Fadu細(xì)胞。每3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積，體積=0.5×長(zhǎng)度×寬度2。注射后3周處死小鼠，甲醛固定腫瘤組織進(jìn)行病理學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 ? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 ? 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以x-±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。SOX4與Ki67表達(dá)的相關(guān)性采用皮爾森相關(guān)性分析，繪制Kaplan-Meier生存曲線，采用log-rank分析SOX4表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 ? 結(jié) ? ? ?果

2.1 ? SOX4蛋白在HSCC組織中過度表達(dá) ? 石蠟標(biāo)本免疫組化顯示，SOX4蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，在HSCC組織中高表達(dá)（IHC評(píng)分6.50±2.93分），在癌旁正常組織中弱表達(dá)（IHC評(píng)分2.00±1.61分），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）（圖1A、B）。Western blot檢測(cè)6對(duì)新鮮HSCC組織及其癌旁正常組織，結(jié)果顯示HSCC組織中SOX4表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1C、D）。

2.2 ? SOX4表達(dá)與下咽癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系 ? 如表1和圖2所示，低分化型HSCC SOX4表達(dá)高于高分化型（P=0.002，圖2A、B），III～I(xiàn)V期患者SOX4表達(dá)高于I～I(xiàn)I期患者（P<0.001，圖2C），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者SOX4表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P<0.001，圖2D），腫瘤直徑＞2 cm患者SOX4表達(dá)高于≤2 cm患者（P=0.006，圖2E），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而不同年齡（P=0.872）和性別（P=0.222）間SOX4表達(dá)水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Ki-67是細(xì)胞增殖相關(guān)核抗原，是評(píng)估腫瘤增殖細(xì)胞比例的有效工具。皮爾森相關(guān)性分析表明SOX4表達(dá)越高，Ki-67陽性率越高（R2=0.569，P<0.001，圖2F、G）。對(duì)HSCC患者隨訪至2022年10月，Kaplan-Meier生存分析顯示，SOX4高表達(dá)（IHC評(píng)分≥6分）患者生存期較短，預(yù)后較差（P=0.026，圖2H）。

2.3 ? SOX4在增殖期FaDu細(xì)胞中的表達(dá) ? 將FaDu細(xì)胞血清饑餓72 h后，將血清加入培養(yǎng)基中培養(yǎng)6、12、24和36 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示G1期細(xì)胞從86.33％降至46.61％，S期細(xì)胞從9.85％增至37.43％（圖3A）。Western blot檢測(cè)顯示，增殖期FaDu細(xì)胞SOX4和PCNA（細(xì)胞增殖標(biāo)志物）的表達(dá)同步明顯增加（P＜0.05）（圖3B、C）。

2.4 ? 敲低SOX4表達(dá)抑制FaDu細(xì)胞增殖能力 ? 利用siRNAs轉(zhuǎn)染FaDu細(xì)胞以敲低SOX4的表達(dá)，PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)FaDu細(xì)胞中SOX4 mRNA及蛋白表達(dá)，證實(shí)敲低效果良好，其中以SOX4-Si2的效果最好（圖4A、B、C）。后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)采用SOX4-Si2處理的FaDu細(xì)胞。IHC染色結(jié)果表明，SOX4-Si2處理后FaDu細(xì)胞中SOX4染色強(qiáng)度顯著降低（圖4D）。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC-Si或?qū)φ战M相比，SOX4-Si2敲低后的FaDu細(xì)胞增殖能力明顯下降（圖4E）。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，敲低SOX4表達(dá)后導(dǎo)致FaDu停滯于G1期，S期細(xì)胞減少（圖4F、G）。

2.5 ? 敲低SOX4表達(dá)抑制FaDu細(xì)胞遷移能力 ? 劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，SOX4-Si2干擾后FaDu細(xì)胞劃痕愈合能力較對(duì)照組明顯下降（P＜0.05）（圖5A、B），Transwell實(shí)驗(yàn)也顯示SOX4-Si2干擾后FaDu細(xì)胞遷移數(shù)少于Control和NC-Si組（P＜0.05）（圖5C、D），表明敲低SOX4后FaDu細(xì)胞遷移能力明顯下降。同時(shí)上皮表型標(biāo)志物β-catenin和E-cadherin表達(dá)顯著增加，而間質(zhì)表型標(biāo)志物vimentin和N-cadherin表達(dá)顯著降低（圖5E、F），表明HSCC中SOX4可能通過誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesendyinal transition，EMT）而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。

2.6 ? 動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中敲低SOX4表達(dá)抑制腫瘤生長(zhǎng) ? 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示，與NC組相比，SOX4-Si2干擾后腫瘤生長(zhǎng)受到顯著抑制（P＜0.001）（圖6A、B）。此外，免疫組化染色顯示在SOX4表達(dá)增高的同時(shí)，增殖標(biāo)志物Ki-67陽性率也增高（圖6C）。提示敲低HSCC細(xì)胞中的SOX4可以抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。

3 ? 討 ? ? ?論

本研究IHC和Western blot檢測(cè)顯示，HSCC組織中SOX4蛋白表達(dá)明顯高于癌旁組織，其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞分化程度、臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ki-67表達(dá)有關(guān)，這與鼻咽癌[9]、前列腺癌[10]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[11]等惡性腫瘤相似。在非小細(xì)胞肺癌[12]、前列腺癌[13]、膽管癌[14]、口腔癌[11]中SOX4高表達(dá)預(yù)示患者預(yù)后不良，本研究發(fā)現(xiàn)SOX4高表達(dá)患者生存期較短，預(yù)后較差，提示SOX4可能是預(yù)測(cè)HSSC患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。

由于異常增殖是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要環(huán)節(jié)，我們首先檢測(cè)增殖期FaDu細(xì)胞中SOX4表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)顯示，增殖期FaDu細(xì)胞中SOX4和細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA的表達(dá)同步明顯增加，說明SOX4過表達(dá)與腫瘤生長(zhǎng)密切相關(guān)。使用siRNA敲低FaDu細(xì)胞中SOX4的表達(dá)，細(xì)胞增殖能力顯著降低，S期細(xì)胞顯著減少，提示SOX4可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。

轉(zhuǎn)移是癌癥發(fā)病中最復(fù)雜的分子調(diào)控過程[15]，研究表明SOX4高表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和侵襲性有關(guān)[16]。EMT的程序化激活使腫瘤細(xì)胞獲得間充質(zhì)特征，有利于腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。許多上皮來源的惡性腫瘤過表達(dá)SOX4，并且與EMT的發(fā)展有關(guān)[17]。SOX4對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的影響可能與不同信號(hào)通路的激活有關(guān)。有報(bào)告認(rèn)為，癌癥的進(jìn)展與TGF-信號(hào)通路有關(guān)[18-19]。SOX4參與HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中的EMT，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[20]。在人乳腺上皮細(xì)胞中TGF-β介導(dǎo)的SOX4表達(dá)增強(qiáng)對(duì)EMT期間產(chǎn)生間充質(zhì)表型是必要的[21]。SOX4過度表達(dá)有助于乳腺癌細(xì)胞的侵襲和擴(kuò)散，SOX4過度表達(dá)與生成EMT的TGF-β途徑激活有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默SOX4表達(dá)后FaDu細(xì)胞遷移能力受到抑制，同時(shí)上皮標(biāo)志物表達(dá)增加，間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)降低，提示SOX4可能通過協(xié)同EMT促進(jìn)HSCC轉(zhuǎn)移。

綜上所述，SOX4在HSCC中過表達(dá)，SOX4促進(jìn)HSCC細(xì)胞的遷移和增殖，可能是早期識(shí)別HSCC、判斷患者預(yù)后的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

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[收稿日期] 2023-03-08

（本文編輯 ? 王曉蘊(yùn)）