陳海娟，曾陽(yáng)，張國(guó)燕，尚軍*

（1.青海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 青海省青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008；2.高原科學(xué)與可持續(xù)發(fā)展研究院，青海 西寧 810008）

低共熔溶劑（Deep eutectic solvents， DESs）是由氫鍵受體和供體按合適的比例混合加熱而成的低共熔混合物，近年來，在天然產(chǎn)物有效成分的提取中的應(yīng)用受到了廣泛關(guān)注［1］。和傳統(tǒng)的有機(jī)提取溶劑乙醇、氯仿等相比，低共熔溶劑在提取分離方面更加高效、安全、環(huán)保［2-3］。

翁布為檉柳科水柏枝屬多種植物的嫩枝葉，為藏族習(xí)用藥材之一，主治風(fēng)濕痹痛［4］。前期研究表明，翁布總黃酮（Myricaria germanicatotal flavonoids， MGFs）是翁布治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效組分［5］，其主要是通過降低大鼠體內(nèi)炎癥介質(zhì)的釋放，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的網(wǎng)絡(luò)平衡來改善佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的癥狀［5-6］。

因此，本研究將結(jié)合DESs的優(yōu)點(diǎn)，采用響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)DESs提取MGFs的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并考察了MGFs體外抗氧化的活性，以期為MGFs的合理開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

翁布嫩枝葉采自青海省海東市民和縣古鄯鎮(zhèn)，經(jīng)青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院尚軍副教授鑒定為水柏枝［Myricaria germanica（L. Desv.）］。

1.2 試劑

蘆丁對(duì)照品（純度≥98%，成都普菲特生物科技有限公司）；氯化膽堿、丙三醇、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、乙二醇均為分析純（上海阿拉丁試劑有限公司）；其余試劑均為分析純（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）。

1.3 儀器

KQ-100WS超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DFT-200A高速粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；BSA2202S電子天平（德國(guó)Sartorius）；V-5100型紫外-可見分光光度計(jì)（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 不同種類的DESs的制備

如表1所示，氯化膽堿和多元醇按不同的摩爾比例混合，磁力攪拌器（80℃）加熱攪拌制備。

表1 不同摩爾比例的DESs的制備Tab.1 The preparation of DESs with different molar ratio

1.4.2 MGFs的提取

取曬干的翁布枝條，去除多余的雜質(zhì)，粉碎過篩備用。精密稱取翁布藥材粉末10份，每份1 g，分別置50 mL離心管中，其中8份加入上述1.4.1制備的不同摩爾比例的DESs 30 mL，另2份分別加入30 mL的純水和70%的乙醇，超聲，離心（4000 r/min）10 min，吸取上部澄清的液體，即為MGFs提取液。

1.4.3 MGFs得率的測(cè)定

標(biāo)曲的制作參考王麗麗［7］的方法，線性回歸方程為Y= 5.7343X+ 0.0113，R2= 0.9988。

MGFs提取液總黃酮的測(cè)定：精密吸取MGFs提取液1 mL，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法測(cè)得。

1.4.4 單因素試驗(yàn)

參照1.4.2所述的方法提取MGFs，選取DES-4（氯化膽堿∶乙二醇 = 1∶2）為提取溶劑，設(shè)計(jì)如表2所示的單因素試驗(yàn)，考察不同的因素對(duì)MGFs得率的影響。

表2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.2 Single factor experimental design

1.4.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)1.4.4所述的單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以MGFs的含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3水平4因素的Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，具體如表3所示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用響應(yīng)面分析軟件Design Expert 11進(jìn)行分析。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Tab.3 Factors and levels of response surface experiment design

1.4.6 抗氧化活性

1.4.6.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參考敖珍［8］等的測(cè)定方法：分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的MGFs提取液和陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸溶液2 mL于棕色具塞試管中，與DPPH溶液（0.1 mmol/L）2 mL混合后測(cè)得的溶液的吸光度（517 nm，A1）；將上述不同濃度的MGFs溶液和抗壞血酸溶液與2 mL的無(wú)水乙醇混合后測(cè)定溶液的吸光度（517 nm，A2）；將2 mL蒸餾水與2 mL DPPH溶液（0.1 mmol/L）混合后測(cè)定溶液吸光度（517 nm，A0）。

1.4.6.2 ABTS+自由基清除能力測(cè)定

參照吳均［9］的測(cè)定方法：分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的MGFs提取液和陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸溶液2 mL于棕色具塞試管中，與 ABTS+溶液（7 mmol/L）4 mL混合后測(cè)得溶液的吸光度（734 nm，A1）；將上述不同濃度的MGFs溶液和抗壞血酸溶液與4 mL的超純水混合后測(cè)定溶液的吸光度（734 nm，A2）；將2 mL超純水H2O與4 mL ABTS+工作液混合后測(cè)定溶液的吸光度（734 nm，A0）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用響應(yīng)面分析軟件Design Expert 11設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面模型，并進(jìn)行顯著性統(tǒng)計(jì)計(jì)算和分析；采用GraphPad Prism 7繪制柱狀圖和散點(diǎn)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型的DESs對(duì)MGFs得率的影響

本實(shí)驗(yàn)以8種不同類型的DES，純水和70%乙醇為提取溶劑考察了對(duì)MGFs得率的影響，結(jié)果如圖1顯示。由圖可見，以不同類型的DESs為提取溶劑，MGFs的得率明顯優(yōu)于純水和70%乙醇，其中DES-4最為明顯，MGFs得率為23.292 mg/g。這可能是由于DESs溶劑的溶解性、黏性、密度等物理化學(xué)性質(zhì)與純水和70%乙醇均具有一定的的差異造成的［10］。

圖1 不同摩爾比例的DESs對(duì)MGFs得率的影響Fig.1 Effects of different molar ratio DESs on the yield of flavonoids

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同料液比對(duì)MGFs得率的影響

如圖2所示，隨著提取溶劑DES的增加，MGFs的得率也隨之增加，當(dāng)料液比增加到1∶25 g/mL時(shí)，MGFs得率達(dá)到最大值；隨后隨著料液比的增大，總黃酮含量逐漸降低。適當(dāng)?shù)牧弦罕瓤梢允顾幉姆勰┍怀浞纸?rùn)，有利于細(xì)胞內(nèi)的有效成分?jǐn)U散到溶劑中；當(dāng)提取溶劑中DESs的比例增加到一定程度時(shí)，反而會(huì)阻礙有效成分的溶出［11］。

2.2.2 DESs的含水量對(duì)MGFs得率的影響

如圖3所示，當(dāng)DESs溶劑的含水量在10% ～30%的范圍內(nèi)時(shí)，MGFs的含量隨著提取溶劑中含水量的增加而增加，在含水量達(dá)到30%時(shí)，MGFs的得率最高（19.622 mg/g）；隨著提取溶劑中水的比例進(jìn)一步增加，MGFs得率逐漸下降，并趨于平穩(wěn)。提取溶劑中水的比例的增加，一方面導(dǎo)致溶劑極性增加，另一方面改變?nèi)軇┑臍滏I結(jié)合力，含水量過高導(dǎo)致溶劑的黏性降低［12］，不利于黃酮的溶解，導(dǎo)致黃酮得率降低。

圖3 不同含水量對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of different water content on the yield of flavonoids

2.2.3 超聲溫度對(duì)MGFs得率的影響

如圖4所示，當(dāng)超聲溫度從40℃升高至60℃時(shí)，MGFs含量逐漸增加，60℃時(shí)達(dá)到最大值（23.401 mg/g），隨后隨著溫度升高，MGFs的含量逐步下降。適當(dāng)?shù)纳邷囟纫环矫婵梢愿淖僁ESs的物理性質(zhì)，另一方面可以加劇物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而導(dǎo)致MGFs得率的增加，但是進(jìn)一步升高溫度，熱不穩(wěn)定黃酮類化合物會(huì)受熱分解，得率下降［11］。

2.2.4 超聲時(shí)間對(duì)MGFs得率的影響

如圖5所示，當(dāng)超聲時(shí)間從20 min延長(zhǎng)到60 min時(shí)，MGFs得率先增加后減小，在超聲時(shí)間為60 min時(shí)，MGFs含量達(dá)到最大值（21.112 mg/g）。超聲提取的機(jī)械作用和空化現(xiàn)象增加了溶劑的穿透力［2，12］，因此適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)超聲時(shí)間有利于有效成分的溶出，所以MGFs的得率逐漸增大。但是，長(zhǎng)時(shí)間的超聲會(huì)使非有效成分的溶出增加，得率降低，雜質(zhì)增多。

圖5 不同超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of different ultrasonic time on the yield of flavonoids

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化MGFs提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，利用分析軟件 Design Expert 11對(duì)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，回歸方程為：Y = 27.56 - 0.6999A + 4.19B - 1.11C +1.86D+ 1.1AB -0.3905AC - 0.091AD +1.69BC+1.38BD + 0.7357CD - 4.08A2- 4.69B2- 4.33C2-3.31D2

表4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)Tab.4 Response surface experimental design and results

由表5可知，該模型具有較好的擬合性，F(xiàn)值為26.77（P＜ 0.0001，極顯著）；失擬項(xiàng)不顯著（P=0.19477 ＞ 0.05）；根據(jù)F值可以判斷，4個(gè)影響因素對(duì)MGFs提取率大小的影響分別為：料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間、含水量；B、C、D、AB、 BC、BD、A2、B2、C2、D2對(duì)MGF提取效果影響顯著；R2= 0.9640，Radj2= 0.9288表明回歸模型具有較好的擬合度。

表5 方差分析表Tab.5 Variance analysis of test results

2.3.2 雙因素交互作用的影響

如圖6所示，AB、BC、BD的等高線有較大的傾斜度，說明兩者的交互作用對(duì)MGFs的得率影響較大（P＜ 0.05）；而AC、AD、CD的等高線比較平緩，說明兩者交互作用對(duì)MGFs得率的影響不顯著（P＞ 0.05）。

圖6 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface graph of the interaction between various factors

經(jīng)響應(yīng)面分析，最優(yōu)提取工藝為：含水量29.78%，料液比1∶27.51，超聲時(shí)間40.03 min，超聲溫度63.87℃，在此條件下模型預(yù)測(cè)的MGFs的提取率為 28.974 mg/g。為方便操作，將上述條件微調(diào)為：含水量30%，料液比1∶27.5，超聲時(shí)間為40 min，超聲溫度64℃，所得MGFs得率為29.722 mg/g，與預(yù)測(cè)值的擬合度較好，MGFs提取工藝條件簡(jiǎn)單可行。

2.4 體外抗氧化活性試驗(yàn)

2.4.1 MGFs對(duì)DPPH自由基的清除能力

如圖6所示，隨著MGFs提取液的濃度的增加（0.2～1.0 mg/mL），其對(duì)DPPH自由基的清除能力也逐漸增加；當(dāng)MGFs提取液濃度為1.0 mg/mL時(shí)，與相同濃度的抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的清除率接近，分別是98.13%和98.99%。

2.4.2 MGFs對(duì)ABTS+自由基的清除能力

如圖7所示，隨著MGFs提取液的濃度的增加（0.2～1.0 mg/mL），其對(duì)ABTS+自由基的清除能力也逐漸增加；當(dāng)MGFs提取液濃度為1.0 mg/mL時(shí)，與相同濃度的抗壞血酸的清除率接近，分別是98.31%和99.36%。

圖7 總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.7 Clearance activity of total flavonoids on DPPH radical

圖8 總黃酮對(duì)ABTS+自由基的清除能力Fig.8 Clearance activity of total flavonoids on ABTS+ free radicals

3 討論與結(jié)論

翁布作為常用的藏藥，其來源為檉柳科水柏枝及其同屬多種植物的干燥嫩枝［14］。目前已報(bào)道的水柏枝屬的植物的化學(xué)成分主要有黃酮類，萜類、酚酸類和木質(zhì)素等［15-18］。DESs作為一種綠色溶劑，環(huán)保無(wú)毒，在野生植物有效成分的提取和分離中有廣泛的應(yīng)用前景。

本研究以青海省海東市民和縣古鄯鎮(zhèn)河溝漫灘邊的翁布為研究對(duì)象，以8種不同類型的DESs、純水和70%乙醇為提取溶劑，結(jié)果表明以多元醇類化合物為配體的DESs對(duì)MGFs的提取效果明顯優(yōu)于純水和70%乙醇，究其原因可能與多元醇類化合物結(jié)構(gòu)中的羥基對(duì)黃酮有很好的溶解性，可以大大提高黃酮類化合物的提取效果有關(guān)［8］。利用超聲波輔助低共熔溶劑法，以含水量、料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度為單因素，以藏藥MGFs得率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法優(yōu)化MGFs的提取工藝，最終得到的MGFs的最佳提取工藝為：DESs的含水量為30%，翁布粉末與DESs的料液比為1∶27.5，超聲時(shí)間為40 min，超聲溫度為64℃，MGFs得率為29.722 mg/g。根據(jù)方差分析結(jié)果顯示，影響MGFs得率大小的因素依次為料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間和含水量。

體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)MGFs的濃度為1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基、ABTS+自由基的清除率分別可達(dá)到相同濃度Vc清除率的98.13%，98.31%。表明翁布黃酮類化合物具有較強(qiáng)的體外抗氧化能力［13］。本研究可以為翁布的合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。