馬圓圓，王秀霞，周典法，魏 鈺，何逸昭，周成剛，

（1.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)微電子學(xué)院，安徽 合肥 230026；2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國(guó)家研究中心微納研究與制造中心，安徽 合肥 230026）

0 引 言

隨著生活節(jié)奏加快和壓力增大，人體體內(nèi)代謝物的不平衡可能會(huì)誘發(fā)各種生理疾病，因此，監(jiān)測(cè)和管理人體內(nèi)各種生理指標(biāo)對(duì)健康生活至關(guān)重要。葡萄糖（C6H12O6）和酒精（C2H6O）兩種物質(zhì)受人類(lèi)的生活方式、飲食習(xí)慣等影響，在人體內(nèi)濃度會(huì)隨人體行為而出現(xiàn)較大的波動(dòng)，進(jìn)而引發(fā)相關(guān)的并發(fā)癥［1～4］。目前，開(kāi)發(fā)新的傳感器以間接形式實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)人體內(nèi)葡萄糖和酒精濃度，可以避免傳統(tǒng)的采血方式對(duì)人類(lèi)造成痛苦與不便。

人體組織液和汗液與血液具有強(qiáng)相關(guān)性［5～7］，因此最近幾年利用微凸結(jié)構(gòu)檢測(cè)人體汗液和穿透人體皮膚監(jiān)測(cè)人體組織液內(nèi)物質(zhì)受到了廣泛的關(guān)注。例如：Sharma S 等人利用聚碳酸酯（polycarbonate，PC）材料設(shè)計(jì)出可以監(jiān)測(cè)人體組織液葡萄糖的微針陣列［8］，采用電化學(xué)三電極系統(tǒng)，利用葡萄糖氧化酶的催化效果，達(dá)到較長(zhǎng)時(shí)間的監(jiān)測(cè)；Kim J等人采用誘導(dǎo)式汗液檢測(cè)方法［9］，設(shè)計(jì)出可用于監(jiān)測(cè)人體汗液酒精的無(wú)創(chuàng)貼片傳感器，主動(dòng)誘導(dǎo)皮膚分泌汗液再采用常規(guī)的電化學(xué)三電極系統(tǒng)進(jìn)行濃度監(jiān)測(cè)；2015年，劉尚等人［10］提出一種空心微針陣列來(lái)檢測(cè)葡萄糖；2016年，劉亮澤等人［11］提出一種單針三電極的動(dòng)態(tài)血糖傳感器的研制。以上研究普遍使用硬質(zhì)材料微針或者更關(guān)注于某一種物質(zhì)的監(jiān)測(cè)。

本文提出一種柔性集成化微針?biāo)碾姌O系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用的柔性材料在較好地貼合人體皮膚的同時(shí)，也可實(shí)現(xiàn)穿透人體皮膚監(jiān)測(cè)的目的。2個(gè)工作電極分別用于葡萄糖和酒精的檢測(cè)，1個(gè)輔助電極和氯化銀（AgCl）參比電極，完成對(duì)多種物質(zhì)的監(jiān)測(cè)。2個(gè)工作電極上利用氧化酶的特異性分別催化葡萄糖和酒精，采用電化學(xué)沉積普魯士藍(lán)（［Fe（CN）6］3）提高靈敏度，增強(qiáng)抗干擾性，通過(guò)殼聚糖將氧化酶固定在鉑（Pt）電極表面，然后工作電極最外層滴涂全氟磺酸（Nafion），提高傳感器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

1 材料與方法

1.1 傳感器工作原理

本文利用生物氧化酶（葡萄糖氧化酶、醇氧化酶）的酶促反應(yīng)［12］實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖和酒精的電化學(xué)檢測(cè)。葡萄糖在氧化酶的催化下，與氧氣（O2）、水反應(yīng)生成過(guò)氧化氫（H2O2）和葡萄糖酸（gluoose-acid），而H2O2又可以與電化學(xué)沉積的普魯士藍(lán)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，完成電子的轉(zhuǎn)移，最終可以通過(guò)檢測(cè)電流的大小來(lái)反映葡萄糖濃度的變化。同理，酒精在醇氧化酶的催化下生成 H2O2和乙醛（C2H4O），同樣以普魯士藍(lán)為電介質(zhì)完成檢測(cè)。具體反應(yīng)電學(xué)方程式如下：

葡萄糖氧化酶催化化學(xué)反應(yīng)式為

酒精氧化酶催化化學(xué)反應(yīng)式為

利用被檢測(cè)物質(zhì)的濃度與生成的H2O2量成定量關(guān)系，通過(guò)H2O2與普魯士藍(lán)的氧化還原反應(yīng)，將電荷轉(zhuǎn)移至金屬電極表面產(chǎn)生電流信號(hào)，電流信號(hào)的強(qiáng)弱與催化反應(yīng)的產(chǎn)物H2O2的濃度成正比，按照反應(yīng)方程式也就是與被測(cè)物質(zhì)的濃度成正比，其反應(yīng)原理如圖1所示。

圖1 工作電極原理

1.2 傳感器設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)的聚酰亞胺（polyimide，PI）薄膜上的四電極微針傳感系統(tǒng)如圖2所示。其中，帶有微針的PI基底是經(jīng)過(guò)在特定硅基模具上旋涂液態(tài)PI并加熱固化后脫模而成，然后對(duì)薄膜做特殊表面處理和磁控濺射鈦（Ti）／Pt 進(jìn)行金屬圖形化，形成2個(gè)工作電極、1個(gè)輔助電極、1個(gè)參比電極的結(jié)構(gòu)，每個(gè)電極的有效區(qū)域?yàn)閳A形有微針陣列區(qū)域，圓形區(qū)域經(jīng)過(guò)一定長(zhǎng)度的Ti／Pt 引線(xiàn)引出，連接至外界測(cè)試平臺(tái)。2個(gè)工作電極用滴涂法分別依次修飾普魯士藍(lán)、氧化酶、殼聚糖和Nafion，輔助電極采用Pt 金屬，參比電極直接使用AgCl油墨吹涂均勻，同時(shí)在AgCl表面修飾Nafion保護(hù)電極。

圖2 四電極結(jié)構(gòu)示意

2 傳感器加工

2.1 硅基底模具加工

首先，選擇（100）晶向硅片，采用低壓化學(xué)氣相沉積法沉積200 nm厚的氮化硅（Si3N4），再旋涂光刻膠進(jìn)行曝光和顯影，實(shí)現(xiàn)掩模版圖形轉(zhuǎn)移至晶圓片上。在反應(yīng)離子刻蝕設(shè)備中，對(duì)顯影處理后的晶圓片刻蝕，去除未被光刻膠保護(hù)的Si3N4。將經(jīng)過(guò)反應(yīng)離子刻蝕后的晶圓片放入濃度為30%的氫氧化鉀（KOH）溶液中，在75 ℃條件下，腐蝕7～8 h，最終，在硅晶圓片上形成陣列式的金字塔凹槽。腐蝕后的晶圓片先用異丙醇（C3H8O）和去離子水進(jìn)行超聲清洗，再用氮?dú)猓∟2）吹干表面，然后用等離子體增強(qiáng)化學(xué)氣相沉積設(shè)備在干燥后的晶圓片上沉積200 nm 厚的氧化硅（SiO2），用于模具表面親水性處理。

2.2 微針薄膜加工

稱(chēng)量定量液態(tài)PI，在加工好的硅基模具上旋涂和加熱固化，設(shè)置的旋涂程序參數(shù)為：轉(zhuǎn)速200 r／min 下持續(xù)時(shí)間10 s，轉(zhuǎn)速300 r／min下持續(xù)時(shí)間30 s，將旋涂后的硅基模具水平靜置1 h。靜置足夠時(shí)間后加熱固化，設(shè)置的加熱程序參數(shù)為：80 ℃下維持40 min，120 ℃下維持30 min，150 ℃下維持30 min，200 ℃下維持20 min，250 ℃下維持15 min。固化后冷卻脫模。

2.3 四電極系統(tǒng)加工

將固化后的微針薄膜剪裁成合適的大小，磁控濺射鍍金屬之前必須用氧等離子氣體處理薄膜表面，使用激光加工的硅質(zhì)硬掩模完成金屬的圖形化，具體硅質(zhì)硬掩模形狀如圖3（a）所示。首先，將薄膜樣品固定在磁控濺射樣品基板上，再將硅質(zhì)掩模緊貼在薄膜之上，4 個(gè)微針陣列分別對(duì)應(yīng)于硅質(zhì)掩模的4個(gè)圓形區(qū)域，磁控濺射工藝參數(shù)如下：首先鍍1層10 nm Ti作為黏附層，再鍍100 nm的Pt作為電極表面金屬，從而實(shí)現(xiàn)四電極系統(tǒng)工作區(qū)域和引線(xiàn)區(qū)域，如圖3（b）所示。

圖3 硅質(zhì)掩模和金屬圖形化后樣品實(shí)物

2.4 工作電極和參比電極修飾

采用電化學(xué)沉積法分別對(duì)2個(gè)工作電極區(qū)域進(jìn)行普魯士藍(lán)介電層的沉積。首先，在普魯士藍(lán)沉積溶液（2.5 mmol／L FeCl3+ 2. 5 mmol／L K3［Fe（CN）6］+0.05 mol／L HCl+0.1 mol／L KCl）中，采用I-t法完成對(duì)普魯士藍(lán)的沉積，沉積電壓為0.6 V，沉積時(shí)間為200 s，靈敏度設(shè)置為0.001。

普魯士藍(lán)沉積后，需要在普魯士藍(lán)穩(wěn)定溶液（0.1 mol／L HCl+0.1 mol／L KCl）中穩(wěn)定，采用循環(huán)伏安（cyclic voltammetry，CV）法完成對(duì)普魯士藍(lán)的穩(wěn)定，最高電壓設(shè)置為0.35 V，最低電壓設(shè)置為-0.05 V，掃描速度設(shè)置為0.05 V／s，循環(huán)周期設(shè)置為40，靈敏度設(shè)置為0.001；之后，將薄膜樣品100 ℃下烘烤1 h。

烘烤后的薄膜樣品冷卻至室溫后，在2 個(gè)工作電極區(qū)域分別進(jìn)行不同生物酶的修飾。在葡萄糖工作電極區(qū)域，首先根據(jù)工作區(qū)域面積大小滴涂10 μL 的葡萄糖氧化酶（0.02 mg／μL），6 ℃下干燥5 h，再滴涂10 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的殼聚糖溶液，6 ℃下自然過(guò)夜干燥，最外層再滴涂10 μL Nafion溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%）作為選擇性離子透過(guò)膜，6 ℃下自然干燥3 h，葡萄糖工作電極修飾完成。

對(duì)酒精工作電極區(qū)域也是采用滴涂法，首先滴涂4 μL的乙醇氧化酶，6 ℃下自然干燥4 h，再滴涂4 μL 的殼聚糖溶液，6 ℃下自然干燥過(guò)夜，最后再滴涂10 μL Nafion溶液，6 ℃下自然干燥3 h。2個(gè)工作電極修飾完成。

AgCl參比電極直接使用AgCl 油墨涂敷在Pt 金屬表面，移液器吸取一定量的油墨滴涂在參比電極區(qū)域，用N2噴槍將油墨均勻吹開(kāi)，完全覆蓋住圓形區(qū)域和微針陣列，然后120 ℃下烘烤1 min。薄膜冷卻后再滴涂10 μL Nafion溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%），6 ℃下自然干燥3 h。

圖4（a）為磁控濺射鍍Ti／Pt金屬后的圓形區(qū)域的微針陣列，陣列為5 ×5 金字塔陣列，微針形狀可為金字塔形微針或棱臺(tái)，可根據(jù)實(shí)際需求改變微針的形狀和密度。圖4（b）為修飾后的工作電極區(qū)域內(nèi)微針表征，在微針表面依次進(jìn)行沉積普魯士藍(lán)、滴涂氧化酶和殼聚糖、修飾Nafion，掃描電子顯微鏡（SEM）表征結(jié)果顯示修飾物覆蓋和固定效果良好。

圖4 微針陣列SEM圖

3 傳感器測(cè)試

3.1 對(duì)H2O2 的線(xiàn)性響應(yīng)

將采用I-t沉積的普魯士藍(lán)微針傳感器浸入一定量的磷酸緩沖液（phosphatic buffer solution，PBS）溶液（0.05 mol／L磷酸氫二鉀（K2HPO4）+0.05 mol／L磷酸二氫鉀（KH2PO4）+0.1 mol／L氯化鉀（KCl）），輔助電極之間加0.6 V 電壓，等到電流穩(wěn)定后開(kāi)始測(cè)試。普魯士藍(lán)對(duì)不同濃度H2O2的響應(yīng)曲線(xiàn)如圖5 所示，在ORIGIN 中對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行線(xiàn)性擬合，可得到線(xiàn)性擬合方程為Y＝14.99 +9.35X，校正決定系數(shù)R2＝0.981 6，靈敏度為9.35 μA／（mmol·L-1），線(xiàn)性范圍為0 ～28 mmol／L。說(shuō)明沉積的普魯士藍(lán)介電層對(duì)H2O2具有良好的線(xiàn)性響應(yīng)，可以有效檢測(cè)酶催化葡萄糖或酒精后生成的H2O2。

圖5 裸普魯士藍(lán)電極對(duì)H2O2 響應(yīng)曲線(xiàn)

3.2 濃度響應(yīng)時(shí)間測(cè)試

將修飾氧化酶的傳感器浸入一定量的PBS 溶液中，在酒精工作電極和參比電極之間加0.6 V 電壓，初始的PBS溶液中酒精濃度為12 mmol／L，等測(cè)試電流穩(wěn)定之后，如圖6（a）所示，在150 s左右滴加一定量的0.5 mol／L酒精標(biāo)定液，待溶液擴(kuò)散穩(wěn)定后，此時(shí)濃度迅速變成14 mmol／L。計(jì)算出加入酒精標(biāo)定液到最終電流穩(wěn)定所需要的時(shí)間，約為27 s。

圖6 傳感器響應(yīng)時(shí)間曲線(xiàn)

同樣的條件下，在葡萄糖工作電極和參比電極之間加0.6 V電壓，溶液初始葡萄糖濃度為2 mmol／L，然后向PBS溶液中滴加定量的葡萄糖標(biāo)定液，溶液中葡萄糖濃度迅速提高到4 mmol／L，根據(jù)測(cè)試結(jié)果圖6（b）所示，葡萄糖傳感器的響應(yīng)時(shí)間約為47 s。

3.3 濃度響應(yīng)臺(tái)階測(cè)試

設(shè)置傳感器不同響應(yīng)臺(tái)階之間的時(shí)間間隔大于傳感器的響應(yīng)時(shí)間。將微針傳感器浸入PBS 溶液中，在傳感器的工作電極和輔助電極之間加0.6 V 電壓，在一定的時(shí)間間隔下，向PBS溶液中滴加一定濃度的待測(cè)物質(zhì)，從而測(cè)試出不同濃度下的電流臺(tái)階變化。每隔100 s向PBS溶液中滴加待測(cè)液（葡萄糖或酒精），溶液中待測(cè)液的濃度梯度為每次變化2 mmol／L，最終測(cè)試得到圖7所示的臺(tái)階響應(yīng)曲線(xiàn)。

圖7 濃度臺(tái)階響應(yīng)曲線(xiàn)

酒精工作電極在滴加16次后不再出現(xiàn)明顯臺(tái)階變化，其線(xiàn)性范圍為0～32 mmol／L，葡萄糖工作電極在滴加12 次后不再出現(xiàn)明顯臺(tái)階變化，其線(xiàn)性范圍為0～24 mmol／L，2種工作電極的臺(tái)階范圍足夠覆蓋一般人體中酒精和葡萄糖的濃度變化范圍。

3.4 線(xiàn)性范圍和傳感器靈敏度測(cè)試

測(cè)試采用I-t法，每個(gè)濃度下，測(cè)試時(shí)間為100 s，記錄最終穩(wěn)定的電流值，將酒精工作電極和葡萄糖工作電極測(cè)試結(jié)果進(jìn)行線(xiàn)性擬合，如圖8 所示。傳感器對(duì)酒精的線(xiàn)性擬合方程為Y＝0.49X+8.18，校正系數(shù)R2＝0.918，傳感器零位為8.18 μA，靈敏度為0.49 μA／（mmol／L），線(xiàn)性范圍為32 mmol／L，其檢出限（limit of detection，LOD）為4.016 mmol／L；傳感器對(duì)葡萄糖的線(xiàn)性擬合方程為Y＝3.27X+2.88，校正系數(shù)R2＝0. 996，傳感器零位為2.88 μA，靈敏度為3. 27 μA／（mmol／L），線(xiàn)性范圍為24 mmol／L，其LOD為0.134 mmol／L。

圖8 傳感器響應(yīng)曲線(xiàn)

3.5 抗干擾性測(cè)試

在初始PBS溶液中加入一定量的尿酸和抗壞血酸，使得每次測(cè)量保證尿酸濃度為500 μmol／L，抗壞血酸濃度為0.14 mmol／L，這兩者均高于人體正常值，在測(cè)試酒精抗干擾時(shí)加入一定量葡萄糖使得溶液中葡萄糖濃度為5 mmol／L；同理，在對(duì)葡萄糖抗干擾時(shí)加入酒精使得溶液中酒精濃度為5 mmol／L，測(cè)試結(jié)果如圖9所示，隨著被測(cè)物質(zhì)濃度的增加，干擾物所帶來(lái)的電流變化影響越來(lái)越小，減小趨勢(shì)明顯。整體的測(cè)試結(jié)果表明：傳感器在對(duì)酒精和葡萄糖測(cè)試時(shí)具有較好的抗干擾能力。

圖9 干擾物對(duì)傳感器的影響曲線(xiàn)

3.6 微針陣列穿透性測(cè)試

PI具有良好的生物相容性，同時(shí)具有較強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度和彈性模量，其中，機(jī)械強(qiáng)度和彈性模量與PI 溶液加熱固化工藝有關(guān)，本文上述提到的加熱固化工藝加工的微針陣列可以滿(mǎn)足穿透仿人體皮膚的要求。仿人體皮膚穿透實(shí)驗(yàn)是研究微針插入特性的重要手段，仿人體皮膚克服了生物皮膚的局限性，如昂貴的成本、新鮮人體皮膚樣本的有限可用性、安全衛(wèi)生問(wèn)題，采用8 層Parafilm?M（PF）膜作為類(lèi)人體皮膚進(jìn)行插入測(cè)試［13，14］。將傳感器用手指、大拇指輕輕按壓進(jìn)PF膜中，然后在SEM 中表征微針陣列的插入情況。因?yàn)槲⑨樖墙嵌纫阎乃睦忮F，可以根據(jù)插入的創(chuàng)口正方形邊長(zhǎng)估算出插入PF 膜的深度，計(jì)算得出微針陣列平均插入深度135 μm左右，此深度微針陣列完全可以穿透人體皮膚角質(zhì)層監(jiān)測(cè)人體組織液成分變化，同時(shí)不會(huì)帶來(lái)明顯的痛覺(jué)。

4 結(jié) 論

本文設(shè)計(jì)并實(shí)現(xiàn)的新型柔性微針生物傳感器，通過(guò)半導(dǎo)體工藝完成硅基底處理、微針薄膜加工、化學(xué)生物修飾和體外仿人體測(cè)試研究，所有測(cè)試結(jié)果均是通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)獲得，其中傳感器打破傳統(tǒng)的電化學(xué)三電極系統(tǒng)，以分時(shí)監(jiān)測(cè)，共用輔助電極和參比電極的方式設(shè)計(jì)出四電極系統(tǒng)，以微針陣列結(jié)構(gòu)增加了監(jiān)測(cè)汗液的傳感面積和實(shí)現(xiàn)穿透人體角質(zhì)層監(jiān)測(cè)組織間液，傳感器工作電極區(qū)域修飾的氧化酶也同時(shí)被殼聚糖和Nafion固定并保護(hù)。傳感器對(duì)酒精和葡萄糖的線(xiàn)性范圍大，靈敏度較好，同時(shí)具有良好的抗干擾能力，不同樣品之間具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，在適應(yīng)于長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)人體生理變化的難題上具有極大的應(yīng)用前景。