張 楠，胡童霞，朱鑫麗，楊雪梅，王 磊，吳 帆，李紅亮,

（1.中國計量大學生命科學學院，浙江杭州 310018；2.浙江分陽檢測有限公司，浙江杭州 311519）

蜂花粉是蜜蜂采集顯花植物花蕊內的花粉粒后混入自身腺體分泌物及花蜜的不規(guī)則扁球形團狀物，再由蜜蜂的攜粉足帶回蜂巢，經(jīng)脫粉器收集而來[1]。蜂花粉含有多種營養(yǎng)成分以及功能性物質，如蛋白質、多酚、脂肪、多糖及微量元素等[2]。作為傳統(tǒng)的天然營養(yǎng)食品和理想的滋補品，蜂花粉具有一定的醫(yī)療和保健作用，如增強免疫力、抑制前列腺疾病、防癌作用和降脂減脂等功能[3-4]，其中多酚類化合物是蜂花粉重要的功能活性成分[5]。

多酚化合物是指分子結構中含有若干個酚羥基的植物源化合物，主要包括黃酮類、單寧類、酚酸類和花色苷類。酚類化合具有降血脂、降血糖、清除自由基、抗動脈粥樣硬化以及抗炎等功能，因而備受人們關注。楊佳林等[6]通過分離蜂花粉酸解液發(fā)現(xiàn)槲皮素和山奈酚為其主要抗氧化活性成分，另外研究表明山茶蜂花粉多酚對氧嗪酸鉀誘導的高尿酸血癥具有治療作用[7]。近年來，已有一些與蜂花粉降脂相關的研究，Rzepecka-stojko 等[8]證明了富含多酚的蜂花粉乙醇提取物可以減少動脈粥樣硬化小鼠模型C57BL/6 因高脂飲食引起的肝臟脂肪變性和退行性變化的發(fā)生，同時在給予蜂花粉多酚能夠有效降低引起高脂飲食小鼠動脈粥樣硬化有關物質的形成。Li等[9]利用玫瑰蜂花粉多糖對HepG 2 細胞和高脂飲食誘導的肥胖小鼠作用，研究其對胰島素功能和脂質代謝的影響，結果表明蜂花粉多糖通過AMPK/mTOR 介導的信號通路促進自噬，從而減輕肝臟脂肪變性和胰島素抵抗，提示其可能是一種新的治療肥胖和糖尿病藥物。

胰脂肪酶是體內參與脂代謝的關鍵酶[10]，它可以催化酯類生成脂肪酸和甘油，而胰脂肪酶抑制劑則通過抑制胰脂肪酶的活性來阻止脂肪的積累，從而達到減脂的功效[11]。因該類抑制劑具有不進入血液循環(huán)、不作用于神經(jīng)系統(tǒng)、不抑制食欲等特點，備受人們的關注。來源于天然植物的胰脂肪酶抑制劑已經(jīng)成為減肥保健產(chǎn)品的研究熱點[12]，其具有較其它非天然來源（如有機合成和微生物來源）諸多優(yōu)點如活性穩(wěn)定、副作用小等[13]，愈來愈受到人們的重視。研究發(fā)現(xiàn)菠菜多酚水提取物對胰酶有較明顯的抑制作用[14]，任秀娟[15]和田強[16]等研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽提取物原花青素等多酚類物質對胰脂肪酶有明顯的抑制作用，且該抑制作用多為非競爭性抑制。但對于蜂花粉多酚的降脂機制尚未見報道。

由于研究植物多酚類物質與酶、血清白蛋白等蛋白質的相互作用能對于植物多酚物質的利用和人體吸收提供數(shù)據(jù)參考，因此本研究以油菜蜂花粉多酚為研究對象，首先利用超聲波輔助乙醇提取法提取其中的多酚類物質，再分別利用酶動力學和熒光光譜技術探究其對胰脂肪酶的抑制作用過程。本實驗結果為蜂花粉的降脂作用及進一步食品功能開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干燥油菜蜂花粉 杭州天廚蜜源保健品有限公司提供，均于-20 ℃保存；脂肪酶 30000 U/g（來源于豬胰臟），北京百靈威科技有限公司；4-硝基苯基月桂酸酯（p-NPB）上海阿拉丁試劑有限公司；福林酚試劑 生工生物公司（上海）股份有限公司；二甲亞砜、無水乙醇、Tris 緩沖溶液及其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

RF-5301PC 型熒光分光光度計、UV-1800 型紫外可見分光光度計 日本島津公司；FlexA-200 型酶標儀 杭州奧盛儀器有限公司；Rotavapor R-210 型旋轉蒸發(fā)儀 瑞士布奇公司；KQ-250DB 型數(shù)控超聲提取儀 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 油菜蜂花粉多酚的提取和含量測定 油菜蜂花粉多酚的提取參照張燕新[17]的方法并稍有改進，取100 g 油菜蜂花粉樣品，研磨后過60 目篩，按料液比1:10 加入75%乙醇溶液在50 ℃下進行超聲（功率200 W）提取1 h，重復提取三次合并濾液。旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮后，稀釋至合適濃度再進行乙酸乙酯萃取，利用旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)至干后冷凍干燥得油菜蜂花粉多酚提取物備用。

總多酚含量測定采用福林酚法[18]并稍作改動，配制質量濃度為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025mg/mL 的沒食子酸標準品液，加入0.5 mL 福林酚試劑與10%的Na2CO3溶液1.5 mL，避光反應后利用紫外分光光度計測定747 nm 波長處的吸光度。以沒食子酸質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，測定三次取平均值進行計算。得到擬合方程為y=66.82x+0.4517，其R2=0.9987，測得沒食子酸計的油菜蜂花粉多酚含量為71.2%。

1.2.2 蜂花粉多酚對胰脂肪酶活性的影響 胰脂肪酶活性測定及計算方法參考張靜等[19]并稍作改動。將適量胰脂肪酶溶解于0.25 μmol/L 的Tris 緩沖溶液作為儲備液，12000 r/min 離心3 min 后取上清液即為5 mg/mL 的胰脂肪酶工作液，用二甲亞砜配制10 mmol/L 的底物p-NPB 溶液和不同質量濃度（0、0.142、0.356、0.570、0.712、1.068、1.424、2.136 mg/mL）的油菜蜂花粉多酚溶液。在酶標板中每孔加入10 μL 的蜂花粉多酚提取物、30 μL 胰脂肪酶溶液、20 μL Tris 緩沖液作為實驗組，不加胰脂肪酶和多酚提取物為空白組，不加多酚提取物為實驗對照組，不加胰脂肪酶為溶劑對照組。設置酶標儀孵育溫度為37 ℃并孵育15 min 后，加入40 μL 的底物溶液，輕輕吹打混勻后繼續(xù)孵育15 min，并于405 nm處測定吸光度，通過公式（1）得到酶相對活性。以油菜蜂花粉多酚提取物的質量濃度為橫坐標，縱坐標為酶相對活性，繪制曲線并進行多元線性擬合，再利用回歸方程同時計算蜂花粉多酚的半抑制濃度（IC50），所有組別平行測定三次。

式中，A1為實驗組吸光度；A2為空白組吸光度；A3為實驗對照組吸光度；A4為溶劑對照組吸光度。

1.2.3 油菜蜂花粉多酚對胰脂肪酶的抑制類型判定 固定底物濃度為10 mmol/L 不變，分別測定不同質量濃度的油菜蜂花粉多酚溶液（0、0.712、1.424 mg/mL）和不添加酶抑制劑時，不同酶濃度下的反應速率。以1.2.2 中實驗組體系進行反應，并以不加抑制劑為對照組。反應速率為反應后的體系吸光度與反應時間相除，以胰脂肪酶質量濃度為橫坐標，反應速率為縱坐標繪制曲線，基于曲線斜率初步判斷抑制類型[20]。

固定胰脂肪酶質量濃度為5 mg/mL 和油菜蜂花粉多酚提取物濃度為IC50，加入不同濃度的底物p-NPB 溶液（0.5、1、2、3、4 mg/mL），以1.2.2 中實驗組體系進行反應。以底物濃度的倒數(shù)（1/[S]）為橫坐標，縱坐標為反應速率的倒數(shù)（1/v），繪制Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線[21]。

1.2.4 油菜蜂花粉多酚作用于胰脂肪酶的紫外-可見吸收光譜分析測定 將胰脂肪酶工作液與不同質量濃度的油菜蜂花粉多酚溶液混勻，室溫作用5 min 后取適量反應液于石英比色皿，并在250～400 nm 范圍內進行紫外-可見吸收光譜掃描。

1.2.5 熒光發(fā)射光譜及同步熒光光譜分析測定 將不同濃度的油菜蜂花粉多酚提取物加入胰脂肪酶工作液中，調整油菜蜂花粉多酚提取物與胰脂肪酶的用量比。分別在不同溫度（298 和308 K）下振蕩混勻并靜置5 min，設置儀器的激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長掃描范圍300～500 nm，狹縫寬為5 nm 進行熒光發(fā)射光譜掃描。

改變熒光光譜儀的激發(fā)波長和發(fā)射波長之間的波長差（Δλ）分別為15 和60 nm，進行同步熒光光譜掃描，其余測量條件和發(fā)射光譜實驗條件一致[22]。

1.2.6 熒光猝滅機理和結合常數(shù)分析 根據(jù)熒光光譜峰值，結合式（2）進行熒光猝滅機理和結合常數(shù)的分析，以F0/F 為縱坐標，[Q]為橫坐標繪制Stern-Volmer 曲線，斜率即為猝滅常數(shù)（KSV）[23]，通過計算得到雙分子碰撞猝滅常數(shù)（Kq）。

式中，F(xiàn)0為不加樣品時的熒光強度；F 為加入樣品后的熒光強度；τ0為生物分子的熒光壽命（10-8）；[Q]為樣品的質量濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2016 軟件進行數(shù)據(jù)處理，以及GraphPad Prism 8.0 軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 蜂花粉多酚對胰脂肪酶的抑制作用

如圖1 所示，隨著提取物的濃度增大，胰脂肪酶的活性也隨之降低，呈現(xiàn)質量濃度依賴性，蜂花粉多酚引起胰脂肪酶的活性降低50%的質量濃度為1.670±0.045 mg/mL。由此可見，油菜蜂花粉多酚提取物對胰脂肪酶的具有較好的抑制效果。張靜等[19]發(fā)現(xiàn)黑果枸杞花色苷提取物對胰脂肪酶的半抑制質量濃度為2.84±0.45 mg/mL，與本實驗結果類似。

圖1 油菜蜂花粉多酚對胰脂肪酶活性的影響Fig.1 Effects of rape bee pollen polyphenols on pancreatic lipase activity

2.2 蜂花粉多酚對胰脂肪酶的抑制類型

底物濃度為10 mmol/L 不變，改變酶濃度，以反應速率對酶的質量濃度進行作圖，得到經(jīng)過原點的直線。由圖2A 可知，隨著蜂花粉多酚濃度增加，直線斜率逐漸降低，且曲線均經(jīng)過原點，說明油菜蜂花粉多酚通過降低酶活性使得反應速率減小，而不是通過降低酶量，說明此過程為可逆性抑制過程[24]。固定胰脂肪酶的質量濃度，改變底物的濃度，Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線如圖2B，曲線均相交于第二象限，為非競爭性與競爭性混合的抑制類型[25]。黃桂麗等[26]證實枇杷花多酚對胰脂肪酶的抑制類型為可逆混合型抑制，半抑制質量濃度為66.1±6.36 μg/mL，與本研究的結果比較類似，表明植物提取多酚對于胰脂肪酶的抑制類型具有一定相似性。

圖2 油菜蜂花粉多酚對胰酶的抑制類型與Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線Fig.2 Inhibitory types and Lineweaver-Burk double reciprocal curve of rape bee pollen polyphenols on pancreatic lipase

混合型抑制是特異性抑制和酶催化作用同時存在的抑制類型，KI表示抑制劑與酶的復合物（EI）的離解常數(shù)，而KIS則表示抑制劑與酶-底物的復合物（EIS）分解出抑制劑（I）時的離解常數(shù)，KI與KIS的大小均與抑制劑的抑制作用效果呈反比[27]。根據(jù)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線計算在有無油菜蜂花粉多酚存在時斜率的比值（1+[Q]/KI）以及縱軸截距的比值（1+[Q]/KIS）即可求得KI及KIS，計算結果見表1。當油菜蜂花粉多酚質量濃度一定時，1/KI>1/KIS，即多酚與胰脂肪酶的親和力大于多酚與底物-酶復合物的親和力[28]，表明油菜蜂花粉多酚對胰脂肪酶的抑制現(xiàn)象是競爭性與非競爭性抑制兩種混合的結果。王燕飛等[29]發(fā)現(xiàn)米胚芽中的胰脂肪酶抑制劑是通過間接改變底物乳化來阻礙底物與酶的而結合，不直接與酶作用。

表1 Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線參數(shù)Table 1 Lineweaver-Burk double reciprocal curve parameters

2.3 油菜蜂花粉多酚作用于胰脂肪酶的紫外-可見吸收光譜分析

胰脂肪酶中含有芳香族氨基酸如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，這也決定了其在260 nm 左右存在最大吸收波長。由圖3 可知，胰脂肪酶除了在260 nm處有最大吸收峰外同時隨著油菜蜂花粉多酚濃度的增加，250～280 nm 處的吸收峰值增強并出現(xiàn)了紅移現(xiàn)象，這也說明了胰脂肪酶結構中的芳香族氨基酸微環(huán)境發(fā)生了改變，因此導致酶構象的改變。

圖3 不同濃度的油菜蜂花粉多酚對胰脂肪酶的紫外-可見吸收光譜Fig.3 UV absorption spectra of pancreatic lipase with different concentrations of rape bee pollen polyphenols

2.4 油菜蜂花粉多酚對胰脂肪酶的熒光光譜

通過熒光猝滅實驗分析油菜蜂花粉多酚與胰脂肪酶之間的相互作用，如圖4 所示，隨著油菜蜂花粉多酚質量濃度的升高，胰脂肪酶的熒光強度呈現(xiàn)出遞降的趨勢，同時熒光峰位從341 nm 紅移到349 nm，說明油菜蜂花粉多酚使胰脂肪酶的構象發(fā)生了改變，即色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸影響導致。

為進一步確定蜂花粉多酚對胰脂肪酶構象的影響，利用同步熒光光譜來判斷氨基酸殘基構象及其所處環(huán)境的變化。如圖5A 和圖5B 分別是Δλ=15 nm和Δλ=60 nm 時油菜蜂花粉多酚的加入對胰脂肪酶的影響。前者表示對胰脂肪酶中酪氨酸的光譜特性，后者則為色氨酸[30]。由圖5 可知，酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長基本保持不變，而色氨酸殘基的最大發(fā)射波長略有紅移，表明多酚的加入導致胰脂肪酶的構象發(fā)生變化，從而降低了色氨酸殘基所處環(huán)境的疏水性，使得胰脂肪酶內部結構發(fā)生改變，肽鏈的伸展程度隨之增加[31]。范金波等[32-33]、張國文等[34]采用熒光光譜法分別研究了綠原酸、咖啡酸和白楊素與胰脂肪酶的相互作用。結果表明這三種多酚與胰脂肪酶的結合均通過改變酶的結構從而抑制胰脂肪酶活性，同時金屬離子在一定程度上抑制了這種結合。此外綠原酸、咖啡酸和白楊素均通過靜態(tài)猝滅方式猝滅胰脂肪酶的內源性熒光。

2.5 熒光猝滅機理和結合常數(shù)分析

為探究胰脂肪酶和油菜蜂花粉多酚的互作模式，實驗比較了不同溫度下Stern-Volmer 方程的變化曲線。分別測定298 K 和308 K 時胰脂肪酶的的熒光強度，據(jù)公式（2）繪制F0/F 對[Q]的關系圖見圖6A，并將由Stern-Volmer 曲線擬合得到的方程中各參數(shù)見表2。在熒光分析中，若已知猝滅為動態(tài)猝滅，則隨溫度升高，猝滅常數(shù)增大；若為靜態(tài)猝滅，則減小[35]。由圖6A 可知，直線斜率隨著溫度升高而減小，提示其結合過程為靜態(tài)猝滅。另外在298 K時，蜂花粉多酚對胰脂肪酶的KSV為0.1000 mg/mL，而在308 K 時，KSV則為0.0743 mg/mL。當油菜蜂花粉多酚與胰脂肪酶的熒光猝滅主要為靜態(tài)猝滅時，其猝滅規(guī)律符合公式（3）。

表2 不同溫度下油菜蜂花粉多酚與胰脂肪酶相互作用的Stern-Volmer 方程和雙對數(shù)曲線方程參數(shù)Table 2 Stern-Volmer equation and double logarithm curve equation parameters for the interaction between rape bee pollen polyphenols and pancreatic lipase at different temperatures

式中，F(xiàn)0為未加入猝滅劑時的熒光強度；F 為猝滅劑濃度等于[Q]時的熒光強度；KA為表觀結合常數(shù)；n 為結合位點數(shù)。

以lg[（F0-F）/F]對lg[Q]作圖，見圖6B 及表2，結合圖表可求得298 K 時的油菜蜂花粉多酚與胰脂肪酶的表觀結合常數(shù)KA的值為0.0755 mg/mL（298 K），0.1718 mg/mL（308 K），結合位點常數(shù)n 值為1.0288（298 K），0.5993（308 K），說明油菜蜂花粉多酚與胰脂肪酶的結合位點在這兩個溫度下均僅有1 個。

3 結論

本文通過紫外-可見分光光度法和熒光光譜法探究油菜蜂花粉多酚對胰脂肪酶的抑制活性和相互作用過程，發(fā)現(xiàn)油菜蜂花粉多酚能以靜態(tài)猝滅方式與胰脂肪酶結合，而且能對胰脂肪酶的活性產(chǎn)生一定的抑制作用，引起酶活性降低50%時多酚的質量濃度為1.670±0.045 mg/mL，抑制類型為可逆性混合型抑制。此外，根據(jù)同步熒光光譜結果顯示，隨著油菜蜂花粉多酚的加入，胰脂肪酶中酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長基本保持不變，而色氨酸殘基的最大發(fā)射波長略有紅移，由此可見多酚的加入導致胰脂肪酶的構象發(fā)生了變化。Stern-Volmer 猝滅常數(shù)Ksv隨著溫度升高而減小，表明結合過程為靜態(tài)猝滅，且結合位點約為1 個。綜上所述，油菜蜂花粉多酚對胰脂肪酶存在明顯抑制作用，多酚的存在可進一步阻礙膳食中脂肪的吸收，并使脂肪積累過程受到抑制。本實驗也為蜂花粉多酚的降脂機制和進一步功能開發(fā)提供了理論依據(jù)，此外不同萃取方式得到的提取物及油菜蜂花粉多酚單體化合物對胰脂肪酶活性的抑制作用及二者的構效關系可作為后續(xù)研究的重點。