彭佳佳，張小軍，田 鑫，楊燕君，段國鋒，高 鵬，劉群龍,

（1.山西農(nóng)業(yè)大學園藝學院，山西晉中 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學果樹研究所，山西太原 030031）

核桃（Juglans regiaL.）為胡桃科核桃屬落葉喬木，是世界“四大干果”之一[1]。核桃仁含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、人體必需的鈣、磷、鐵等多種微量元素以及維生素E、核黃素等多種維生素，具有較高的營養(yǎng)價值，深受消費者喜愛[2-4]。游離氨基酸作為維持人體健康的營養(yǎng)成分之一，可被人體直接吸收利用，參與人體氮代謝和免疫調(diào)節(jié)作用[5-7]，也可與口腔中的味蕾結(jié)合產(chǎn)生酸、甜、苦、鮮或咸等滋味[8]。已有研究表明，具內(nèi)種皮核桃仁中含有17 種氨基酸，且必需氨基酸占總氨基酸含量的1/3 左右[9-12]。楊永濤等[9]研究表明，具內(nèi)種皮核桃仁氨基酸比例系數(shù)貼近全雞蛋蛋白模式，適合人體吸收，為優(yōu)質(zhì)蛋白來源。毛曉英等[10]研究表明，具內(nèi)種皮核桃仁必需氨基酸含量高于聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）推薦值，可作為營養(yǎng)食品添加到其它食品中以滿足人體對必需氨基酸的需求。具內(nèi)種皮核桃種仁中藥用氨基酸含量較高，與枸杞中含量相近，可作為藥用價值較高的植物蛋白資源進行開發(fā)利用[11]。

核桃內(nèi)種皮是包裹核桃種仁的一層種皮結(jié)構(gòu)，占核桃仁質(zhì)量的5%左右[13]，但在生產(chǎn)加工過程中常被廢棄，缺乏對其的合理開發(fā)利用。核桃內(nèi)種皮含有豐富的維生素、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等物質(zhì)，營養(yǎng)價值較高[14-15]，其含有的酚類、氨基酸等物質(zhì)亦可豐富核桃仁滋味。謝素雅等[15]研究表明，核桃內(nèi)種皮含有16 種氨基酸，7 種必需氨基酸占氨基酸總量33.16%。目前，有關(guān)核桃內(nèi)種皮氨基酸的呈味特性和營養(yǎng)價值評價的相關(guān)研究較少，且以單一品種為主[15]。為探究不同品種核桃內(nèi)種皮游離氨基酸組成及含量差異，本研究通過對6 個品種核桃內(nèi)種皮中游離氨基酸含量的測定，并分析其呈味特性和營養(yǎng)價值，以期為核桃副產(chǎn)物的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘農(nóng)核1 號’、‘汾核2 號’、‘汾核4 號’、‘京861’、‘薄殼香’和‘金薄香8 號’共6 個核桃品種 山西農(nóng)業(yè)大學果樹研究所核桃種質(zhì)資源圃，樹齡15 年，每個品種選取6 株樹隨機組合為三組，每組2 棵樹，設(shè)3 個重復(fù)；17 種氨基酸標準品 色譜級，北京索萊寶科技有限公司；磺基水楊酸、鹽酸等試劑 分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

Biochrom30+氨基酸分析儀 德國Biochrom公司；冷凍干燥機 美國GOLD-SIM 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料預(yù)處理 于2020 年9 月核桃果實成熟時，從植株的東、南、西、北4 個方向和樹冠內(nèi)外隨機采集30 個核桃青皮顏色由綠色漸變?yōu)辄S綠色、頂部出現(xiàn)裂縫且無病蟲害的果實帶回實驗室，脫青皮后打開堅果，用鑷子將核桃種仁和內(nèi)種皮剝離，液氮速凍，再冷凍干燥后研磨成粉，-20 ℃干燥保存，待測。

1.2.2 游離氨基酸含量測定 稱取0.5 g 內(nèi)種皮干粉于離心管中，加入5 mL 鹽酸（0.02 mol/L）于4 ℃冷藏過夜后12000 r/min 離心15 min。取1 mL 上清液加入1 mL 質(zhì)量分數(shù)為4%的磺基水楊酸，充分混勻后用0.22 μm 的水系濾膜過濾到棕色進樣瓶。測定采用Biochrom 30+氨基酸分析儀測定，測定方法參照賀娜等[16]的方法，并計算必需氨基酸比例E/T 值、E/N 值、RAA 值、RCAA 值和滋味活性值（TAV）。其中E/T=（EAAs/TFAAs）×100，E/N=（EAAs/NEAAs）×100；RAA=內(nèi)種皮中某種必需氨基酸含量/FAO/WHO 提出的含量；RCAA=內(nèi)種皮中某種必需氨基酸的RAA/必需氨基酸RAA 的均值，TAV=C/T。式中，EAAs 表示必需氨基酸含量；TFAAs 表示游離氨基酸總量；NEAAs 表示非必需氨基酸含量；C 表示樣品中呈味物質(zhì)含量；T 表示各氨基酸味道閾值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果采用Excel 2013 軟件對數(shù)據(jù)進行整理，SPSS 20.0 軟件進行方差分析、主成分分析、聚類分析和聚類結(jié)果作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種核桃內(nèi)種皮游離氨基酸含量

6 個核桃品種內(nèi)種皮中均含有17 種游離氨基酸（表1）。不同核桃品種內(nèi)種皮總游離氨基酸含量為2673.86～3490.21 mg/kg，平均為2972.01 mg/kg?！诤? 號’含量最高，與其余品種差異明顯。‘京861’含量最低，最高值/最低值的比值為1.31。6 個核桃品種中必需氨基酸含量差異較小?！诤? 號’必需氨基酸與總氨基酸的比值（E/T）最高，為30.77%，‘京861’最低，為20.48%，平均值為25.07%。必需氨基酸與非必需氨基酸的比值（E/N）中‘農(nóng)核1 號’最高，為53.18%，‘京861’最低，為38.15%，‘農(nóng)核1 號’和‘汾核4 號’內(nèi)種皮中氨基酸比較接近WHO/FAO提出的理想蛋白模型（理想蛋白模型中E/T 在40%左右，E/N 接近60%）。內(nèi)種皮中9 種藥用氨基酸（Leu、Lys、Met、Phe、Arg、Asp、Glu、Gly、Tyr）含量為1582.72～2188.88 mg/kg，占氨基酸總量的57.67%～68.23%，各品種中含量差異較大。因此，核桃內(nèi)種皮的營養(yǎng)價值較高。

表1 核桃內(nèi)種皮游離氨基酸含量（mg/kg）Table 1 Content of free amino acid in walnut pellicle (mg/kg)

由表1 可知，不同核桃品種內(nèi)種皮中各游離氨基酸含量差異顯著（P<0.05）。Arg 在6 個品種間上差異最大，其在‘京861’中含量最高，是‘汾核4 號’（含量最低）的4.74 倍，Arg 是藥用氨基酸，有助于恢復(fù)免疫細胞的抗腫瘤能力，增強細胞免疫力[6]?！诤? 號’內(nèi)種皮Leu 含量與其它5 個品種之間差異較小。Glu 為6 個品種內(nèi)種皮中含量最高的氨基酸，占總量的26.23%～32.74%，這與在‘香玲’核桃[15]、新疆核桃[9,17]、山核桃[13]和漾濞大泡核桃[18]中的研究結(jié)果相似。Glu 作為一種興奮型神經(jīng)遞質(zhì)，與認知能力有關(guān)，對大腦中與學習記憶有關(guān)的神經(jīng)元有重要作用[7]。內(nèi)種皮中Asp 含量較高，其與Glu 共占游離氨基酸總量33.99%～46.20%。已有研究表明Glu和Asp 含量對蛋白質(zhì)含量影響較大[17]，因此，Glu 和Asp 可能為影響內(nèi)種皮蛋白質(zhì)的主要游離氨基酸。內(nèi)種皮中含量較高的氨基酸還有Thr、Cys 和Arg，與Glu 及Asp，5 種氨基酸共占氨基酸總量的77.02%～81.44%，為內(nèi)種皮游離氨基酸的主要成分。

2.2 核桃內(nèi)種皮RAA、RCAA 評價

內(nèi)種皮中的必需氨基酸較WHO/FAO 氨基酸模式[9,11]中的標準偏?。ㄒ姳?）。RCAA 值表示偏離標準模式的大小，RCAA>1 表示該必需氨基酸在內(nèi)種皮中相對過剩，RCAA<1 表示該必需氨基酸在內(nèi)種皮中相對不足，RCAA 為1 表示該必需氨基酸在內(nèi)種皮中為理想平衡狀態(tài)，RCAA 最小的必需氨基酸為限制氨基酸。由表2 可知，內(nèi)種皮中的第一限制性氨基酸為Leu，第二限制性氨基酸為Val，Thr、Ile 和含硫氨基酸在內(nèi)種皮中相對過剩，表示核桃內(nèi)種皮可以為人體補充豐富的Thr、Ile 和含硫氨基酸，與其它果蔬混合食用，可提高不同食物的利用效率。

表2 核桃內(nèi)種皮必需氨基酸RAA、RCAA 值Table 2 RAA and RCAA values of essential amino acids in walnut pellicle

2.3 核桃內(nèi)種皮中氨基酸的呈味特征分析

6 個核桃品種內(nèi)種皮共檢測出鮮味氨基酸3 種（Glu、Asp、Lys）、苦味氨基酸6 種（Val、Ile、Leu、Tyr、Phe、Arg）、甜味氨基酸6 種（Thr、Ser、Pro、His、Gly、Ala）和芳香族氨基酸2 種（Tyr、Phe）。由表3 可知，‘汾核2 號’呈味氨基酸總量最高（3075.43 mg/kg），‘京861’最低（2344.48 mg/kg），‘汾核2 號’是‘京861’的1.30 倍。不同核桃品種中各呈味氨基酸含量存在差異，鮮味氨基酸是含量最高的呈味氨基酸，占呈味氨基酸總含量的41.77%～55.28%。除‘汾核2 號’和‘汾核4 號’外，其余品種的苦味氨基酸含量均高于甜味氨基酸含量，‘汾核2 號’和‘汾核4 號’中苦味氨基酸與其余品種均存在顯著差異（P<0.05），芳香族氨基酸為含量最低的呈味氨基酸且各品種間差異較小。綜上，內(nèi)種皮中呈味氨基酸差異與核桃品種有關(guān)，鮮味氨基酸為內(nèi)種皮呈味氨基酸含量最高，芳香族氨基酸為含量最低。

6 個核桃品種內(nèi)種皮各呈味氨基酸TAV 值見表4。TAV 是表示樣品中呈味物質(zhì)濃度與其味道閾值的比值，反映樣品中呈味物質(zhì)的滋味強度，當TAV>1 時，表示該氨基酸對內(nèi)種皮滋味影響較大；當TAV<1 時，表示其對內(nèi)種皮滋味影響不大。由表4 可知，TAV>1 的呈味氨基酸主要為Glu（鮮味氨基酸）和Arg（苦味氨基酸）。6 個品種中Glu 的TAV值為2.34～3.81，均值為2.94，為影響內(nèi)內(nèi)種皮鮮味的主要氨基酸。同時，Glu 是黃花菜和蘑菇中鮮味的活性成分之一[19-20]。Glu 還具有掩蓋苦味的功效，可抑制味覺受體中Ca2+信號傳遞[21]，降低苦味氨基酸Ile 的強度[22]?！?61’、‘薄殼香’和‘金薄香8 號’中Arg 的TAV 值為1.03～1.26，對該品種內(nèi)種皮的苦味有重要影響。在課題組前期口感評價中，‘京861’、‘薄殼香’和‘金薄香8 號’苦味程度低于‘汾核2 號’和‘汾核4 號’[23]，與本研究結(jié)果存在差異，這可能與Arg 的特殊呈味性有關(guān)。天然物質(zhì)中Arg以L 型存在，呈苦味，具有抑制苦味的特殊作用，可通過掩蓋/結(jié)合味覺上的苦味受體或與味覺中的Na+通道相互作用，降低對L-Ile、L-Phe 等苦味氨基酸和奎尼溶液苦味的感知[8,24-26]，同時Arg 可與單寧[27]、苯甲地那銨和對乙酰氨基酚相互作用[28]，降低苦味化合物的苦味強度。因此，Arg 對‘京861’、‘薄殼香’和‘金薄香8 號’的苦味作用為呈味抑制效應(yīng)，它可能通過掩蓋苦味受體或與內(nèi)種皮中苦味分子結(jié)合而造成內(nèi)種皮中其它苦味物質(zhì)苦味強度的減小。內(nèi)種皮中大部分苦味氨基酸含量低于閾值，Lioe 等[29]研究表明Phe含量低于閾值時可增強其它氨基酸的甜味和鮮味，由此可見內(nèi)種皮中低于閾值的苦味氨基酸增加其呈味的復(fù)雜性。時羽杰等[30]研究表明L-Leu 為核桃內(nèi)種皮苦澀味差異代謝物，而本研究中各品種內(nèi)種皮中L-Leu 含量均低于閾值，對內(nèi)種皮苦味貢獻較小。這可能由于前者研究中所有試材為內(nèi)種皮口感極具苦味的CZ-301 和無苦味且略帶甘甜的CZ-64，本研究中6 個品種核桃內(nèi)種皮都具有不同程度的苦味，故L-Leu 對內(nèi)種皮苦味影響差異與核桃品種有關(guān)。

表4 核桃內(nèi)種皮呈味氨基酸TAV 值Table 4 TAV values of flavor amino acids in walnut pellicle

2.4 不同品種核桃內(nèi)種皮氨基酸含量的主成分分析

對6 個品種內(nèi)種皮中17 個游離氨基酸含量進行主成分分析，可使各主成分含義更加明確。初始因子載荷矩陣進行旋轉(zhuǎn)后共提取出4 個特征值大于1 的主成分（見表5），方差貢獻率依次為31.95%，23.73%，22.20%，18.72%，累計方差貢獻率為96.59%，高于閾值85%，因此4 個主成分可以代替17 個指標對內(nèi)種皮游離氨基酸進行分析，主成分線性關(guān)系分別為：

表5 游離氨基酸主成分特征值和貢獻率Table 5 Eigenvalue of the principal components and cumulative contribution rates in free amino acid

由表6 可知，PC1 在Lys、Asp、Cys、Glu 和Tyr 有較高的載荷，均高度正相關(guān)，表明PC1 對內(nèi)種皮的非必需氨基酸影響最大，稱為非必需氨基酸因子。PC2 中Met 和Val 載荷值分別為0.87 與0.99，且存在正向影響，可稱為必需氨基酸因子。PC3 中Leu、Thr 和Ser 載荷較大，并與PC3 呈正相關(guān)，可稱為甜味氨基酸因子。PC4 的方差貢獻率最低，其中Ile 和Ala 的特征向量值較高，為正值，可稱為苦-甜味混合氨基酸因子。4 個主成分從營養(yǎng)和滋味方面反映了核桃內(nèi)種皮游離氨基酸的綜合品質(zhì)，以每個主成分對應(yīng)的方差相對貢獻率作為權(quán)重建立綜合評價模型F=0.33F1＋0.25F2＋0.23F3＋0.19F4，最終獲得6 個核桃內(nèi)種皮綜合質(zhì)量分值及排名（表7），從高至低的排序為‘汾核2 號’、‘農(nóng)核1 號’、‘汾核4 號’、‘金薄香8 號’、‘薄殼香’、‘京861’。其中‘汾核2 號’綜合得分最高，為0.69，表明其氨基酸綜合質(zhì)量水平較高，‘京861’得分最低為-0.74，表明其氨基酸綜合質(zhì)量水平較低；‘薄殼香’和‘京861’因子綜合得分為負值，表明其氨基酸綜合質(zhì)量水平低于平均水平。結(jié)果表明，營養(yǎng)成分因子PC1 和PC2 對內(nèi)種皮中氨基酸的綜合質(zhì)量影響較大。因此，營養(yǎng)成分因子PC1 和PC2 對內(nèi)種皮中氨基酸綜合質(zhì)量影響較大，‘汾核2 號’為氨基酸綜合質(zhì)量水平較高的品種。

表6 游離氨基酸主成分載荷矩陣與系數(shù)Table 6 Principal component load matrix and coefficient of free amino acid

表7 核桃內(nèi)種皮中游離氨基酸成分得分和綜合得分Table 7 Principal component scores and comprehensive assessment of free amino acid in walnut pellicle

2.5 核桃內(nèi)種皮游離氨基酸的聚類分析

依據(jù)核桃內(nèi)種皮中游離氨基酸的含量，采用pearson 相關(guān)性測定了6 個核桃品種的組間連接距離，得到樹狀聚類圖（圖1）。6 個核桃品種可劃分為兩大類，第一類為‘薄殼香’、‘金薄香8 號’、‘農(nóng)核1 號’和‘京861’，該類核桃內(nèi)種皮中苦味氨基酸與甜味氨基酸含量比值大于1，且‘薄殼香’和‘金薄香8 號’最先進行第一階聚類，該階聚類的2 個品種中苦味氨基酸與甜味氨基酸含量比值、氨基酸總量和必需氨基酸含量均相差較?。弧r(nóng)核1 號’的苦味氨基酸與甜味氨基酸含量比值與第一階聚類的2 個品種的平均比值之間差距較小，進行第二階聚類，‘京861’的苦味氨基酸與甜味氨基酸含量比值與第一階聚類的2 個品種的平均比值差距較大，則為第三階聚類；第二類為‘汾核2 號’和‘汾核4 號’，其苦味氨基酸含量與甜味氨基酸含量的比值小于1，且必需氨基酸和鮮味氨基酸含量均高于第一類。因此，‘汾核2 號’和‘汾核4 號’為滋味品質(zhì)和氨基酸營養(yǎng)價值較高的品種。

圖1 不同核桃品種內(nèi)種皮游離氨基酸的聚類圖Fig.1 Cluster of free amino acid in different walnut pellicle

3 結(jié)論

核桃內(nèi)種皮中游離氨基酸差異明顯，各品種游離氨基酸含量為2673.86～3490.12 mg/kg，Glu、Asp、Thr、Cys 和Arg 為內(nèi)種皮游離氨基酸的主要成分，占游離氨基酸總量的77.02%～81.44%，其中Glu 含量最高，占總量的26.23%～32.74%。藥用氨基酸為內(nèi)種皮中差異較大的組分之一，占游離氨基酸總量57.67%～68.23%，因此，核桃內(nèi)種皮具有較高的藥用價值，可依據(jù)其藥理作用進行合理開發(fā)利用。必需氨基酸含量為547.71～885.14 mg/kg，不同品種間差異較小。Leu 是內(nèi)種皮第一限制性氨基酸，第二限制性氨基酸為Val。

內(nèi)種皮中呈味氨基酸模式與核桃品種有關(guān)，鮮味氨基酸為含量最高的呈味氨基酸，芳香族氨基酸含量最低，除‘汾核2 號’和‘汾核4 號’外，其余品種苦味氨基酸含量均高于甜味氨基酸含量。經(jīng)TAV 計算，6 個品種中Glu 的TAV 值為2.34～3.81，對內(nèi)種皮鮮味貢獻最大?！?61’、‘薄殼香’和‘金薄香8 號’中Arg 的TAV 值為1.03～1.26，對內(nèi)種皮苦味有貢獻，具呈味抑制作用。

本研究明確了‘農(nóng)核1 號’、‘汾核2 號’、‘汾核4 號’、‘京861’、‘薄殼香’和‘金薄香8 號’6 個品種核桃內(nèi)種皮游離氨基酸主要成分，證實了必需氨基酸、藥用氨基酸和呈味氨基酸組分在不同品種中存在差異。但研究中所選用試材品種較少，后續(xù)研究將再此基礎(chǔ)上擴大品種數(shù)量，對核桃內(nèi)種皮氨基酸組分進行深入研究，以期篩選富含藥用氨基酸的特異種質(zhì)，提高核桃經(jīng)濟價值。