韋澤晶 師麗敏 雷湘蘭 易新 楊琛

(海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，海南 海口 570216)

前言

雞白痢沙門氏菌(Salmonella Pullorum，SP)是一種兼性厭氧菌，革蘭氏染色呈陰性，其大小為0.5～1.6μm×1.9～5.0μm，形態(tài)圓鈍，形狀短小，無莢膜和芽孢。雞白痢沙門氏菌感染分為3個階段，沙門氏菌浸入腸道，通過腸道感染后，通過菌毛附著于腸粘膜上導(dǎo)致盲腸病變；巨噬細胞包裹著沙門氏菌轉(zhuǎn)移至組織器官(肝臟、脾臟和卵巢等)；沙門氏菌在肝臟和脾臟大量復(fù)制導(dǎo)致肝臟、脾臟腫大，形成病變。雛雞感染可表現(xiàn)為高致病性，臨床癥狀表現(xiàn)為食欲減少，精神萎靡，排白色糞便，并伴有糊肛現(xiàn)象。急性型感染可致雛雞死亡，病理學(xué)可見心包內(nèi)有滲出物，心肌組織內(nèi)肉芽腫，肝臟表現(xiàn)出白色病灶或局部壞死，膽囊腫大等，蛋雞感染后可導(dǎo)致卵巢和卵泡損傷變形[1]。

三丁酸甘油酯(Tributyrate，TB)又稱甘油三丁酸酯，其不可被胃酸溶解，可被胰脂肪酶分解產(chǎn)生3分子丁酸和1分子甘油，正常腸上皮細胞的70%的能量均由丁酸提供[2]，TB分解后通過血液循環(huán)系統(tǒng)運輸至機體各組織器官發(fā)揮作用。飼糧添加TB可促進動物腸道發(fā)育，提高動物的免疫力，改善動物的生長性能，保障動物機體的健康。有研究表明，高濃度的丁酸可抑制細胞增殖并促進凋亡，低濃度的丁酸可促進腸上皮細胞的生長和增殖[3]。此外，丁酸可在線粒體中發(fā)生β-氧化同時釋放大量能量，使得腸道環(huán)境酸化，阻止病原菌的增殖，因此TB可作為替抗備選藥物。由于規(guī)?；B(yǎng)殖，濫用抗生素引起的畜產(chǎn)品安全的案例屢見不鮮，故無毒、安全、綠色的飼料添加劑來替代抗生素顯得十分重要。目前，國內(nèi)外對TB和沙門氏菌的單獨研究較多，而TB在對沙門氏菌引起的肝臟影響知之甚少，因此，通過研究探討三丁酸甘油酯對沙門氏菌感染文昌雞肝臟及盲腸損傷的影響，為提高三丁酸甘油酯高效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

隨機將200只質(zhì)量相近、體況健康的1日齡雛雞分為對照組(Con組)、三丁酸甘油酯組(TB組)、雞白痢沙門氏菌組(SP組)和沙門氏菌加三丁酸甘油酯組(SP+TB組)，每組5個重復(fù)，每個重復(fù)10只。Con組給予基礎(chǔ)飼料，TB組和SP+TB組在基礎(chǔ)飼料中添加500mg·kg-1的三丁酸甘油酯，飼養(yǎng)7d時，SP組和SP+TB組每只雞口服1mL雞白痢沙門氏菌(1×109CFU/只)，試驗期為21d。分籠常規(guī)飼養(yǎng)，自由采食、飲水，并每周采集體重信息?；A(chǔ)飼料其成分及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 樣品的采集

于試驗21d進行采樣，以重復(fù)為單位取2只雞。采樣前12h禁水、禁食，翅靜脈采集10mL血液，并離心取血清用于生化指標的檢測。安樂死后，立即取出肝臟和盲腸組織，將一部分樣品置于4%多聚甲醛固定液中用于HE染色；另一部分組織于超低溫冰箱保存，用于凋亡和炎癥因子相關(guān)mRNA相對表達量的檢測。

1.3 生化指標的測定

血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的測定根據(jù)試劑盒說明書進行操作，試劑盒為南京建成科技有限公司生產(chǎn)。

1.4 肝臟組HE染色

參照Cheng G等[10]方法制備。

1.5 凋亡和炎癥相關(guān)mRNA相對表達量的檢測

1.5.1 引物與探針設(shè)計

雞轉(zhuǎn)錄基因序列從NCBI的基因庫中獲取，用Primer express 3.0軟件進行引物和探針設(shè)計，引物和探針序列見表2，由擎科生物科技有限公司合成。

表2 凋亡和炎癥相關(guān)mRNA引物和探針序列

1.5.2 肝臟組織RNA提取

使用Trizol法，根據(jù)TaKaRa試劑盒的說明書進行總RAN的提取。并使用核酸濃度儀測定RNA濃度。

1.5.3 基因組DNA的去除和反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)TaKaRa說明書進行操作，將已知RNA的濃度稀釋為1000ng用于反轉(zhuǎn)錄。

1.5.4 RT-qPCR反應(yīng)

雞肝臟中的基因用TaqMan RT-qPCRT法進行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)反應(yīng)。每組分別取20個樣品，每個樣品設(shè)定3個重復(fù)，進行實時熒光定量PCR擴增。擴增程序：50℃2min，95℃min，40個循環(huán)，95℃ 15s，60℃ 1min。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行分析，并用Duncans進行組間比較差異性顯著，最后用Prism 5.0軟件對試驗數(shù)據(jù)作柱狀圖。試驗結(jié)果數(shù)據(jù)均用“平均值±標準誤差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 三丁酸甘油酯對雞白痢沙門氏菌導(dǎo)致肝臟生化指標的影響

三丁酸甘油酯對雞白痢沙門氏菌導(dǎo)致肝臟生化指標的影響見圖1。與Con組相比，TB組有下降趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)；與Con組相比，SP組和SP+TB組的ALT和AST的活性顯著升高(P<0.05或P<0.001)，而SP+TB組與SP組相比，ALT和AST的活性有顯著下降趨勢(P<0.05)。

圖1 三丁酸甘油酯對雞白痢沙門氏菌導(dǎo)致肝臟生化指標的影響

2.2 三丁酸甘油酯對雞白痢沙門氏菌導(dǎo)致肝臟炎癥因子相關(guān)基因mRNA表達的影響

三丁酸甘油酯對雞白痢沙門氏菌導(dǎo)致肝臟炎癥因子相關(guān)基因mRNA表達的影響如圖2所示。與Con組相比，TB組有下降趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)；SP組和SP+TB組與Con組相比，IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α和IFN-γ的mRNA表達水平顯著升高(P<0.05，P<0.01或P<0.001)；SP+TB組與SP組相比上述炎癥因子mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)。

圖2 三丁酸甘油酯對雞白痢沙門氏菌導(dǎo)致肝臟炎癥因子相關(guān)基因mRNA表達的影響

2.3 三丁酸甘油酯對雞白痢沙門氏菌導(dǎo)致肝臟凋亡相關(guān)基因mRNA表達的影響

三丁酸甘油酯對沙門氏菌導(dǎo)致肝臟凋亡相關(guān)基因mRNA表達的影響，如圖3所示。與Con組相比，TB組有下降趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)；相比于Con組，SP組和SP+TB組的Caspase-9、Caspase-3和Bax的mRAN的表達量極顯著上升(P<0.001)；SP+TB組與SP組相比，Caspase-9、Caspase-3和Bax的mRAN的表達量顯著下降(P<0.001)。

圖3 三丁酸甘油酯對雞白痢沙門氏菌導(dǎo)致肝臟凋亡相關(guān)基因mRNA表達的影響

2.4 三丁酸甘油酯對雞白痢沙門氏菌導(dǎo)致肝損傷的影響

三丁酸甘油酯對雞白痢沙門氏菌導(dǎo)致肝損傷的影響見圖4。Con組和TB組：肝細胞飽滿、圓潤，排列整齊，肝竇無明顯擴張或擠壓；無明顯的炎性變化，見圖4a、圖4b。SP組：肝臟出現(xiàn)大量的血管周圍淋巴細胞灶性浸潤，見圖4c。SP+TB組：肝細胞空泡變性；局部血管周圍可見淋巴細胞灶性浸潤，少見淤血見圖4d，相較于SP組有明顯的改善情況。如圖4e盲腸HE染色結(jié)果顯示，Con組和TB組盲腸絨毛正常，無淋巴細胞浸潤；而圖4g、圖4h黏膜層有大量淋巴細胞浸潤，腸絨毛縮短，圖4h與圖4g相比，黏膜層淋巴細胞減少。

注：a～d肝臟×13；e～h盲腸×13。圖4 三丁酸甘油酯對雞白痢沙門氏菌導(dǎo)致肝臟及盲腸損傷的影響

2.5 三丁酸甘油酯對沙門氏菌感染文昌雞生長性能的影響

三丁酸甘油酯對沙門氏菌感染文昌雞生長性能的影響如表3所示。與Con組相比，TB組顯著提高了料重比(P<0.01)，SP組料重比顯著降低(P<0.001)；SP+TB組與SP組相比料重比顯著提高(P<0.001)。

表3 三丁酸甘油酯對沙門氏菌感染文昌雞生長性能的影響

3 討論

肝細胞的胞質(zhì)中存在大量ALT，而AST主要存在于心肌中，其次是肝臟。當(dāng)肝細胞壞死或受損時，ALT和AST通過細胞膜進入血液，導(dǎo)致血清中ALT、AST的含量顯著上升，因此血清中ALT和AST含量是反映肝組織的損傷程度的指標之一。在SP的感染下，雞血清中ALT和AST的含量極顯著升高，說明SP可導(dǎo)致肝臟損傷[4]。黃夕瑤[5]研究顯示，鼠傷寒沙門氏菌刺激肝細胞釋放ALT，并在染毒24h后含量達到峰值。曾靜靜[1]研究表明，在鴨沙門氏菌的感染下雛鴨血清中ALT和AST含量顯著升高，造成了鴨肝臟損傷。本試驗結(jié)果顯示，SP+TB組和SP組的ALT和AST的含量均顯著高于Con組，與黃夕瑤、曾靜靜研究結(jié)果一致，而SP+TB組與SP組相比ALT和AST的含量顯著下降，說明TB能夠減輕SP導(dǎo)致的肝損傷。機體先天免疫細胞表達受體系統(tǒng)能夠在細胞表面及內(nèi)體膜上的Toll樣受體(toll like receptors，TLRs)識別細胞外的微生物，并引發(fā)快速防御和遲發(fā)細胞反應(yīng)，激活多種宿主防御信號通路。Toll樣受體下游的NFκB和IRF途徑可誘導(dǎo)促炎性細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達。IL-1β是IL-1家族中的重要成員，其在炎癥相關(guān)疾病中的重要作用。IL-1β具有較強的促炎活性，可誘導(dǎo)多種促炎介質(zhì)，如細胞因子和趨化因子，并最終導(dǎo)致擴大炎癥反應(yīng)。此外，IL-1β的局部激活是促炎反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，可導(dǎo)致繼發(fā)性炎癥介質(zhì)(包括IL-6)的激活。TNF-α與IL-1β相似，是一種多效性促炎細胞因子，屬于TNF家族。TNF-α在調(diào)節(jié)發(fā)育和免疫過程中發(fā)揮著不同的作用，包括炎癥、分化、脂質(zhì)代謝和凋亡，與多種疾病有關(guān)[6]。IL-17、IL-1β和IL-6共同參與NF-κB的活化過程，NF-κB能調(diào)控分泌次級炎癥介質(zhì)的酶，直接導(dǎo)致炎癥的典型癥狀。IFN-γ是可溶性二聚體細胞因子，是II型干擾素的唯一成員，IFN-γ過度激活會引起組織損傷、壞死和炎癥[7]。曾靜靜[1]研究顯示，鴨感染沙門氏菌后肝臟中IFN-γ的mRNA表達量顯著升高，肝臟變現(xiàn)出血和大量炎性細胞增生。高晗[8]研究表明，在沙門氏菌感染下雞肝組織IL-6、IL-17和TNF-α表達水平的升高，應(yīng)用丁酸梭菌后減輕雞白痢沙門氏菌對綠殼蛋雞肝臟，脾臟組織的病變程度。本試驗結(jié)果顯示，與Con組相比，SP組和SP+TB組的IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α和IFN-γ的mRNA表達水平顯著升高，SP+TB組與SP組相比，Caspase-9、Caspase-3和Bax的mRAN的表達量顯著下降，此結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，說明SP能夠引起導(dǎo)致雞肝臟和盲腸組織發(fā)生損傷和炎癥反應(yīng)，而TB能夠減緩SP導(dǎo)致的雞肝組織反應(yīng)。

細胞凋亡是細胞死亡的一種形式，細胞凋亡也稱程序性死亡。在肝組織的病變中凋亡起著重要作用。大量研究表明，急、慢性肝損傷的主要原因是死亡受體通路的紊亂而引起。凋亡主要特征為線粒體膜電位降低，線粒體嵴斷裂[9]。由線粒體途徑引起的凋亡途徑機制：Bax促凋亡因子活化轉(zhuǎn)移至線粒體外膜形成蛋白性孔道，改變線粒體膜通透性，釋放細胞色素C[10]。細胞色素C能夠調(diào)節(jié)促凋亡基因Caspase家族。細胞色素C的大量釋放能夠激活上游基因p-Caspase-9，使其具有活性的Caspase-9，Caspase-9剪切執(zhí)行凋亡基因Caspase-3使其活化，最終導(dǎo)致細胞發(fā)生凋亡[11]。Schwabe等[12]研究顯示，細胞凋亡與肝損傷的發(fā)病機制密切相關(guān)，如肝硬化、病毒性肝炎。Takayashiki等[13]報道，發(fā)生乙醇性肝損傷時，部分肝細胞以凋亡的方式被清除，說明損傷的肝細胞與凋亡有關(guān)；黃夕瑤[5]研究表明，鼠傷寒沙門氏菌刺激后雛雞肝臟的Caspase-3和Bax mRNA的表達量顯著升高，通過HE染色發(fā)現(xiàn)肝竇擴張明顯，門管區(qū)出現(xiàn)炎性細胞，肝細胞中出現(xiàn)較大的空泡，胞漿散布于空泡之間。ChuanYu等[14]研究顯示，在鼠沙門氏菌感染巨噬細胞下，巨噬細胞Caspase-9和Caspase-3的mRNA表達水平顯著升高，并發(fā)生凋亡。本研究表明，SP激活了凋亡通路的死亡受體，從而啟動凋亡程序，導(dǎo)致Caspase-9、Caspase-3和Bax的表達水平顯著升高導(dǎo)致細胞凋亡。SP+TB組與SP組相比表達水平顯著降低，說明TB能夠減輕SP導(dǎo)致的雞肝細胞發(fā)生凋亡。同時HE染色發(fā)現(xiàn)SP組肝臟出現(xiàn)多量的血管周圍淋巴細胞灶性浸潤和血管淤血；SP+TB組出現(xiàn)肝細胞空泡變性，胞質(zhì)內(nèi)可見體積微小的圓形空泡；局部血管周圍可見淋巴細胞灶性浸潤，未出現(xiàn)淤血，相較于SP組有明顯的改善。SP組盲腸的黏膜層出現(xiàn)大量淋巴細胞浸潤，而SP+TB組較SP組淋巴細胞浸潤顯著降低。此外，在生長性能上，與Con組相比TB組能夠顯著提高文昌雞料重比，而SP組的料重比顯著降低；SP+TB組與SP組相比料重比顯著提高。

綜上所述，雞白痢沙門氏菌能夠?qū)е码u肝細胞發(fā)生損傷和炎癥反應(yīng)，而應(yīng)用TB可減輕肝細胞發(fā)生損傷和炎癥反應(yīng)并提高文昌雞的生長性能。