王歡， 金慧敏

（黑龍江省傳染病防治院結(jié)核內(nèi)科四病區(qū)，黑龍江哈爾濱 150500）

結(jié)核?。╰uberculosis）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起的傳染性疾病，也是單一傳染性病原體導致死亡的首要原因[1]。研究[2]表明，Mtb通過感染宿主體內(nèi)的巨噬細胞，誘發(fā)過度的炎癥反應，加重組織損傷和患者癥狀。近20年來，針對結(jié)核病的研究和抗結(jié)核病藥物的開發(fā)一直備受關注；然而，由于患者耐藥性和靶向藥物的缺乏，臨床上常用的宿主導向治療（host-directed therapy，HDT）藥物并未達到理想的治療效果[3]。因此，開發(fā)抗結(jié)核病新藥具有重要的研究意義。穿心蓮內(nèi)酯（andrographolide，Andro）是中藥穿心蓮的主要生物活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤和抗氧化等藥理作用[4-7]。已有研究[8]證明，Andro 是潛在的抗結(jié)核病藥物。本研究采用Mtb感染巨噬細胞模型，探討Andro 對巨噬細胞炎癥反應的調(diào)控作用及其機制，以期為Andro作為控制結(jié)核病病程中過度炎癥反應的候選藥物提供實驗依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株與細胞Mtb H37Ra 和小鼠巨噬細胞系RAW264.7，均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），于本實驗室凍存。

1. 2 藥物、試劑與儀器穿心蓮內(nèi)酯（Andro），分子量：350.45，分子式：C20H30O5，購自四川精萃天成藥物科技有限公司，批號：TC0953，純度：98%。Middlebrook 7H9 和Middlebrook OADC（美國BD 公司）；胎牛血清（FBS）、青霉素/鏈霉素混合液以及DMEM 培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司）；miR-342-3p mimic、陰性對照（miR-NC）以及相關引物均由廣州銳博生物科技有限公司提供；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑（美國Thermo Fisher 公司）；碘化丙啶（PI，美國Sigma 公司）；乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測試劑盒和Poly（A）聚合酶加尾試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；小鼠白細胞介素6（IL-6）和小鼠白細胞介素18（IL-18）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海仁捷生物技術(shù)有限公司）；RNA easy Plus Mini 試劑盒（上海優(yōu)寧維生物科技有限公司）；M-MuLV 第一鏈cDNA 合成試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）；蛋白酶抑制劑cocktail（美國Roche 公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；抗GSDMD 抗體、抗Caspase-1抗體、抗核因子E2相關因子2（Nrf2）抗體和抗血紅素氧化酶1（HO-1）抗體、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔抗山羊IgG二抗（美國Abcam公司）。微孔板分光光度計（美國Agilent 公司，型號：Epoch2）；流式細胞儀（美國BD 公司，型號：FACS Calibur）；化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國Aplegen 公司，型號：OmegaLum G）；實時熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司，型號：StepOne TM）。

1.3 菌株培養(yǎng)與細胞感染Mtb H37Ra 培養(yǎng)于含0.2%甘油、0.05%吐溫-80 和10% Middlebrook OADC 的Middlebrook 7H9瓊脂中。根據(jù)Li 等[9]研究方法構(gòu)建Mtb 感染的RAW264.7巨噬細胞。將處于對數(shù)生長期的RAW264.7 細胞接種于6 孔板中，接種密度為5× 105個/孔。待細胞匯合度達到70%～80%時，用活化的Mtb H37Ra感染細胞，病毒感染復數(shù)（MOI）為10∶1。37 ℃共培養(yǎng)4 h 后，用無菌PBS 清洗細胞，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以待備用。

1. 4 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染RAW264.7 巨噬細胞用含10%FBS 和1%青霉素/鏈霉素混合液的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中。另外，根據(jù)Lipofectamine 2000 的使用說明書，將miR-NC 或miR-342-3p mimic 于RAW264.7 細胞接種24 h 后進行轉(zhuǎn)染操作。首先，將100 nmol/L 的miR-NC 或miR-342-3p mimic 分別與2.5 μL 的Lipofectamine 2000 于200 μL 的DMEM 完全培養(yǎng)基中共同孵育。15 min后，將上述混合物逐滴加入經(jīng)H37Ra 感染（MOI=10∶1）后的RAW264.7 巨噬細胞中，孵育6 h，更換新鮮培養(yǎng)基。

1. 5 細胞分組根據(jù)實驗目的，將小鼠RAW264.7 巨噬細胞隨機分為Control（對照）組，Mtb 組，Mtb+Andro 組，Mtb+Andro+miR-NC 組和Mtb+Andro+miR-342-3p組。隨后，按照“1.3”項內(nèi)容進行H37Ra感染操作，并按照“1.4”項內(nèi)容進行細胞轉(zhuǎn)染。其中：Control 組為未作處理的巨噬細胞；Mtb 組為經(jīng)Mtb 感染（MOI=10∶1）的巨噬細胞；Mtb+Andro 組為巨噬細胞經(jīng)Mtb 感染（MOI=10∶1）后，給予Andro（25 μmol/L）處理4 h；Mtb+Andro+miR-NC 組或Andro+Mtb+miR-342-3p 組為巨噬細胞經(jīng)Mtb（MOI=10∶1）和Andro（25 μmol/L）聯(lián)合處理4 h 后，分別轉(zhuǎn)染100 nmol/L 的miR-NC 或miR-342-3p mimic，48 h后收集細胞，以備檢測。

1.6 觀察指標與方法

1. 6. 1 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將各組RAW264.7巨噬細胞用胰酶消化后，PBS清洗3次，離心（800g，5 min）后去除胰酶。然后用2 μg/mL PI 避光孵育細胞15 min，并使用FACS Calibur 儀器進行分析，數(shù)據(jù)用FlowJo V10軟件處理。所有樣本在PI染色后1 h內(nèi)進行分析。

1. 6. 2 LDH 釋放試驗確定LDH 活性 按照LDH細胞毒性檢測試劑盒說明書，采用比色法檢測各組RAW264.7 巨噬細胞LDH 活力（U/L），其中，用Epoch2 微孔板分光光度計測定490 nm 波長處的吸光度（OD）。

1. 6. 3 ELISA 法檢測細胞上清液IL-6 和IL-18含量 收集待測細胞的上清液，采用ELISA 檢測，具體步驟按照試劑盒說明書操作。隨后，用Epoch2 微孔板分光光度計測定450 nm 波長處吸光度（OD），通過繪制標準曲線計算IL-6 和IL-18 的含量（pg/mL）。

1.6.4 熒光實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）法檢測miR-342-3p 表達 應用TRIzol 裂解液提取RAW264.7 巨噬細胞總RNA。使用Poly（A）聚合酶加尾試劑盒在RNA分子3’末端添加Poly（A）尾，隨后采用RNA easy Plus Mini 試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA 為模板，利用M-MuLV 第一鏈cDNA 合成試劑盒進行PCR。反應程序：95 ℃預變性5 min，以95 ℃變性15 s、58 ℃退火延伸30 s的條件循環(huán)擴增40 次。引物如下所示：U6正義鏈為5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，反義鏈為5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’，擴增片段167 bp；miR-342-3p 正義鏈為5’-TCTCAC ACAGAAATCGCACCCGT-3’，反義鏈為5’-CGCT TCACGAATTTGCGTGTCAT-3’，擴增片段23 bp。以U6表達為管家基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1. 6. 5 Western Blot 法確定GSDMD、Caspase-1、Nrf2 以及HO-1 蛋白含量 收集RAW264.7 巨噬細胞，用含蛋白酶抑制劑cocktail 的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液冰上裂解細胞。離心后收集上清，用BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測各樣品中總蛋白濃度。隨后，加入5×SDS，100 ℃煮沸10 min使蛋白變性，分裝于-80 ℃保存。等量蛋白質(zhì)用8%～10%的十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰氨凝膠電泳（PAGE）分離后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜（0.22 μm）上。用5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜2 h。封閉后，將膜與一抗（包括抗GSDMD 抗體、抗Caspase-1抗體、抗Nrf2 抗體、抗HO-1 抗體和抗GAPDH 抗體，稀釋比均為1∶1 000）在4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3 次后，將膜與HRP標記的IgG二抗（1∶2 000）在室溫下孵育2 h。洗膜后，用增強化學發(fā)光（ECL）試劑盒顯色，曝光。用ImageJ 軟件進行目的蛋白的定量分析。

1. 7 統(tǒng)計方法采用Graph Pad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用雙尾t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。所有實驗均獨立重復3 次。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2. 1 Andro 減輕Mtb 感染的巨噬細胞焦亡圖1、表1 結(jié)果顯示：與Control 組比較，Mtb 組細胞內(nèi)LDH 活力以時間依賴的方式顯著增加（P＜0.05）；與Mtb組比較，在48 h和72 h時，經(jīng)Andro 處理后巨噬細胞胞內(nèi)LDH 活力顯著減弱（P＜0.05）。另外，與Control組比較，Mtb組和Mtb+Andro組細胞內(nèi)IL-6、IL-18 含量，GSDMD 和Caspase-1 的蛋白表達水平以及細胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）；與Mtb 組比較，給予Andro 處理48 h 后，Mtb+Andro組細胞中IL-6、IL-18 含量，GSDMD 和Caspase-1的蛋白表達水平以及細胞凋亡率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。以上結(jié)果提示，Andro可減輕Mtb感染的巨噬細胞焦亡。

表1 穿心蓮內(nèi)酯（Andro）對結(jié)核分枝桿菌（Mtb）感染巨噬細胞IL-6和IL-18的影響Table 1 Effect of Andrographolide（Andro）on IL-6 and IL-18 in Mycobacterium tuberculosis（Mtb）-infected macrophages（±s，pg·mL-1）

表1 穿心蓮內(nèi)酯（Andro）對結(jié)核分枝桿菌（Mtb）感染巨噬細胞IL-6和IL-18的影響Table 1 Effect of Andrographolide（Andro）on IL-6 and IL-18 in Mycobacterium tuberculosis（Mtb）-infected macrophages（±s，pg·mL-1）

注：①P＜0.05，與Control組比較；②P＜0.05，與Mtb組比較

組別Control組Mtb組Mtb+Andro組IL-6 23.16±7.21 100.13±8.78①67.27±5.16②IL-18 100.27±11.23 340.24±10.24①209.41±22.12②

圖1 穿心蓮內(nèi)酯（Andro）對結(jié)核分枝桿菌（Mtb）感染巨噬細胞焦亡的影響Figure 1 Effect of Andrographolide（Andro）on Mycobacterium tuberculosis（Mtb）-infected macrophage pyroptosis

2.2 Andro 下調(diào)Mtb 感染巨噬細胞的miR-342-3p表達圖2結(jié)果顯示：與Control組比較，Mtb組細胞miR-342-3p的表達以時間依賴的方式顯著升高（P＜0.05）；與Mtb 組比較，在Andro 處理6 h 后，Mtb+Andro 組細胞miR-342-3p 表達無明顯差異（P＞0.05），而經(jīng)Andro 處理12 h 和24 h 后，Mtb+Andro 組細胞miR-342-3p 表達以時間依賴的方式顯著下降（P＜0.05）。以上結(jié)果提示，Andro 能夠下調(diào)Mtb感染的巨噬細胞miR-342-3p表達。

圖2 穿心蓮內(nèi)酯（Andro）處理6、12、24 h對結(jié)核分枝桿菌（Mtb）感染巨噬細胞miR-342-3p表達的影響Figure 2 Effect of Andrographolide（Andro）treatment for 6，12 and 24 hours on miR-342-3p expression in Mycobacterium tuberculosis（Mtb）-infected macrophages

2. 3 過表達miR-342-3p 增強Andro 誘導的Mtb感染的巨噬細胞焦亡圖3、表2 結(jié)果顯示，與Mtb+Andro+miR-NC 組比較，Mtb+Andro+miR-342-3p 組胞內(nèi)IL-6、IL-18 含量，LDH 活力，GSDMD 和Caspase-1 的蛋白表達水平升高（P＜0.05）。另外，經(jīng)miR-342-3p處理后，細胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）。以上結(jié)果提示，過表達miR-342-3p能夠促進Andro誘導的Mtb感染的巨噬細胞焦亡。

表2 miR-342-3p對穿心蓮內(nèi)酯（Andro）誘導的結(jié)核分枝桿菌（Mtb）感染巨噬細胞IL-6和IL-18的影響Table 2 Effect of miR-342-3p on IL-6 and IL-18 in Mycobacterium tuberculosis（Mtb）-infected macrophages induced by andrographolide（Andro）（±s，pg·mL-1）

注：①P＜0.05，與Mtb+Andro+miR-NC組比較

組別Mtb+Andro+miR-NC組Mtb+Andro+miR-342-3p組IL-6 79.06±10.01 153.27±9.86①IL-18 211.17±10.13 316.55±21.02①

圖3 miR-342-3p對穿心蓮內(nèi)酯（Andro）誘導的結(jié)核分枝桿菌（Mtb）感染巨噬細胞焦亡的影響Figure 3 Effect of miR-342-3p on Mycobacterium tuberculosis（Mtb）-infected macrophage pyroptosis induced by Andrographolide（Andro）

2. 4 Andro 激活Mtb 感染的巨噬細胞Nrf2/HO-1通路圖4結(jié)果顯示：與Control組比較，Mtb組細胞中Nrf2和HO-1蛋白表達水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與Mtb 組比較，Andro+Mtb 組細胞中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。以上結(jié)果提示，Andro 能夠激活Mtb 感染的巨噬細胞Nrf2/HO-1 信號通路。

圖4 穿心蓮內(nèi)酯（Andro）對結(jié)核分枝桿菌（Mtb）感染的巨噬細胞Nrf2/HO-1通路的影響Figure 4 Effect of Andrographolide（Andro）on the Nrf2/HO-1 pathway in Mycobacterium tuberculosis（Mtb）-infected macrophages

3 討論

結(jié)核分枝桿菌（Mtb）作為胞內(nèi)病原體，通過促進或抑制宿主的細胞功能來逃避宿主對慢性感染的先天性免疫[10]。研究[11-13]報道，細胞焦亡是宿主天然免疫系統(tǒng)為了應對Mtb 感染的重要組成部分，是一種高效的抗菌方式，能夠減輕炎癥反應、清除致病細菌。細胞焦亡是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞程序性死亡方式，依賴于促炎性的半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶Caspase 的激活[14]，其特征是細胞核完整、細胞腫脹、細胞膜破裂以及相關促炎因子的釋放[15]。其中，GSDM 家族蛋白是細胞焦亡的關鍵執(zhí)行者。GSDM家族成員大多具有N端和C端兩個結(jié)構(gòu)域。游離的N 端結(jié)構(gòu)域可以轉(zhuǎn)移到細胞膜上導致細胞焦亡和促炎因子的釋放，加重組織炎癥反應[16]。因此，目前常通過檢測GSDMD 蛋白和Caspase-1蛋白表達、細胞焦亡相關炎性因子（IL-6和IL-18）含量以及胞內(nèi)LDH 活性以判斷Mtb 誘發(fā)的細胞死亡方式是否為細胞焦亡[17-18]。本研究通過PI染色確定Mtb感染的巨噬細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，Andro 能夠明顯減少Mtb 感染的巨噬細胞凋亡。然后，通過檢測Mtb 感染的巨噬細胞內(nèi)GSDMD、Caspase-1 蛋白表達，IL-6、IL-18 含量以及胞內(nèi)LDH 活性以判斷該死亡方式是否為細胞焦亡，結(jié)果顯示，Andro能夠以時間依賴的方式顯著降低Mtb 感染的巨噬細胞胞漿中LDH 釋放，同時減少GSDMD 和Caspase-1 表達，減少炎性細胞因子（IL-6和IL-18）的釋放。以上結(jié)果說明，Andro能夠通過激活Caspase-1/GSDMD通路進而抑制Mtb感染的巨噬細胞焦亡。

MicroRNAs（miRNAs）作為重要的基因表達調(diào)節(jié)因子廣泛參與發(fā)育、凋亡、腫瘤、免疫和機體-微生物相互作用等生理病理過程。miRNAs 可對宿主固有免疫和適應性免疫進行精細調(diào)控。miRNAs在調(diào)節(jié)宿主抗細菌（幽門螺旋桿菌、沙門氏菌、李斯特氏菌、分枝桿菌）感染免疫應答中發(fā)揮重要作用。明確機體抗感染免疫中miRNAs如何調(diào)節(jié)免疫應答將有助于開發(fā)作用于miRNAs或其靶標的新的治療手段[19]。對Mtb 患者體內(nèi)miRNAs 表達與活動性結(jié)核感染間的關系進行研究，結(jié)果證實，Mtb可以誘導或抑制miRNAs表達，進而調(diào)節(jié)主要免疫細胞中相關基因表達，如巨噬細胞、樹突狀細胞（DC）、自然殺傷細胞（NK）和T 細胞，以逃避免疫反應[20]。重癥肺炎患兒血清中miR-342-3p 相對表達量均高于健康兒童，miR-342-3p 過表達均能夠使A549 細胞增殖活性和EdU 陽性細胞率降低，細胞凋亡率升高[21]。miR-342-3p 在類風濕關節(jié)炎患者中低表達并促進滑膜成纖維細胞（RA-FLS）的炎癥和遷移[22]。本研究中，挽救實驗結(jié)果表明，Andro能夠負調(diào)控Mtb 感染巨噬細胞中miR-342-3p 的表達，且過表達miR-342-3p 能夠逆轉(zhuǎn)Andro 介導的Mtb 感染的巨噬細胞焦亡。這提示Andro 可通過下調(diào)miR-342-3p 表達抑制Mtb 感染的巨噬細胞焦亡，揭示了宿主天然免疫系統(tǒng)通過miRNAs控制巨噬細胞的死亡方式，為將來的靶向治療提供了一種新的思路。

另外，有研究[23]表明，Nrf2/HO-1 信號通路的激活有助于抑制氧化應激誘導的細胞焦亡。Nrf2/HO-1信號通路可以通過抑制NLRP3炎癥小體的激活來減輕細胞焦亡[24-26]。由此可見Nrf2/HO-1 信號通路在細胞焦亡中扮演了至關重要的角色。本研究中，為了確定Andro 對Mtb感染巨噬細胞模型中Nrf2及其下游抗氧化基因HO-1是否有影響，通過Western Blot 實驗檢測Mtb 感染巨噬細胞中Nrf2 和HO-1等相關蛋白的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞經(jīng)過Mtb 刺激后，Nrf2 蛋白表達顯著升高，而HO-1蛋白表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。另外，給予Andro 治療后，逆轉(zhuǎn)了上述結(jié)果。這提示，Andro 能夠介導Nrf2/HO-1 信號通路抑制Mtb誘導的巨噬細胞焦亡。

綜上所述，Andro 對Mtb 感染的巨噬細胞具有重要的保護作用。Andro 能夠負調(diào)控miR-342-3p表達且顯著抑制Mtb介導的巨噬細胞焦亡，同時減輕Mtb 誘導的炎癥反應，其分子機制可能與Nrf2/HO-1信號通路有關。