馬可藍(lán)， 董恩釗， 林營(yíng)， 馮學(xué)烽

[1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院（佛山市順德區(qū)中醫(yī)院），廣東佛山 528333]

骨質(zhì)疏松癥是以骨強(qiáng)度下降和骨折風(fēng)險(xiǎn)性增高為主要表現(xiàn)的骨骼系統(tǒng)疾病[1]。骨質(zhì)疏松癥流行病學(xué)調(diào)查[2-3]結(jié)果表明，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為我國(guó)50 歲以上人群的重要健康問(wèn)題，中老年女性骨質(zhì)疏松問(wèn)題尤為嚴(yán)重。運(yùn)用中西醫(yī)整體醫(yī)療模式治療、預(yù)防及監(jiān)測(cè)骨質(zhì)疏松癥已成為最有效的方法[4]。骨質(zhì)疏松癥歸屬于中醫(yī)學(xué)“骨痿”“骨枯”“骨極”“骨痹”等范疇，因其臨床表現(xiàn)多為肢體軟弱無(wú)力、麻木疼痛等癥狀，遂目前較為公認(rèn)的病名當(dāng)推“骨痿”[5]。李東垣在《脾胃論》中指出“脾病則下流乘脾腎……則骨乏無(wú)力，是為骨痿。會(huì)人骨髓空虛，足不能履地。”根據(jù)《黃帝內(nèi)經(jīng)》提出“治痿獨(dú)取陽(yáng)明”的治療大法，及現(xiàn)代從脾治痿論治骨質(zhì)疏松[6]的深入，補(bǔ)中益氣湯當(dāng)為補(bǔ)脾益氣治療脾虛證骨痿之代表性方劑，治療上以甘溫之品黃芪、黨參、干姜為主健脾益氣，升舉中陽(yáng)。既往臨床研究[7]表明，補(bǔ)中益氣湯可以調(diào)節(jié)脾胃氣虛型老年骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折（OVCF）術(shù)后患者骨代謝指標(biāo)，促進(jìn)成骨，提高骨密度，同時(shí)可以增加四肢骨骼肌肌量和股四頭肌肌力，減輕臨床癥狀，改善生存質(zhì)量。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[8]表明，補(bǔ)中益氣湯可對(duì)抗環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的小鼠骨質(zhì)量下降，預(yù)防骨質(zhì)疏松。另外，近年研究表明，益生菌不僅可以調(diào)節(jié)脾虛證的各種疾病[9]，也可用于治療骨質(zhì)疏松[10]。因此，本研究著眼于通過(guò)健脾治療改善骨質(zhì)疏松，觀察補(bǔ)中益氣湯與益生菌合劑單用或聯(lián)用對(duì)脾虛證骨質(zhì)疏松大鼠的影響，以期在臨床使用中，根據(jù)患者的各種情況綜合評(píng)估如何選擇使用補(bǔ)中益氣湯和益生菌合劑進(jìn)行治療，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40 只SPF 級(jí)6月齡雌性SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（粵）2018-0034。大鼠在廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2018-0001]內(nèi)喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)方案獲得廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：20210331002。

1.2 藥物及制備補(bǔ)中益氣湯由黃芪、升麻、柴胡、黨參、炙甘草、當(dāng)歸、陳皮、白術(shù)組成，上述中藥材及番瀉葉購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院藥劑科。將黃芪、升麻、柴胡、黨參、炙甘草、當(dāng)歸、陳皮、白術(shù)原藥材以15∶3∶3∶10∶7.5∶3∶3∶5的比例，放入10 倍量蒸餾水中浸泡2 h，常規(guī)煎煮3 次，濾過(guò)，將3 次濾液合并后水浴濃縮成1 g生藥/mL，降溫后放置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩⒎瑸a葉置于10倍量蒸餾水中浸泡2 h，煎3次，濾過(guò)，將3次濾液合并后水浴濃縮成每mL含1 g生藥，降溫后放置4 ℃保存?zhèn)溆?。極菌開益生菌固體飲料合劑（主要成分：長(zhǎng)雙歧桿菌、乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、腸膜明串珠菌腸膜亞種，日本凱菲亞株式會(huì)社生產(chǎn)，批號(hào)：91650）。地塞米松磷酸鈉注射液（西南藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：211104）。

1. 3 主要試劑與儀器重組Anti-SP7 抗體[EPR21034]、重組Anti-RUNX2 抗體[EPR22858-106]-ChIP Grade、Anti-beta-actin 抗體[AC-15]（美國(guó)Abcam 公司）；山羊抗兔IgG（H+L）、小鼠/人ads-HRP 二抗（美國(guó)Southern Biotech 公司）。小動(dòng)物專用雙能X 射線骨密度儀（美國(guó)豪洛捷醫(yī)療公司）；SkyScan 1276 Micro-CT（德國(guó)布魯克公司）；微型垂直電泳儀和電泳裝置（美國(guó)伯樂(lè)公司）；核酸蛋白分子儀（德國(guó)貝克曼公司）。

1.4 造模大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，構(gòu)建脾虛證骨質(zhì)疏松癥模型，方法：灌胃番瀉葉煎液（10 g·kg-1，每日1 次）[11]，同時(shí)皮下注射地塞米松磷酸鈉注射液（0.6 mg·kg-1，每3 d 1 次）[12]，造模時(shí)間為4 周。造模結(jié)束后，若大鼠出現(xiàn)明顯成群蜷縮，嗜睡，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)減少，四肢無(wú)力，行動(dòng)緩慢，皮毛枯槁，排便次數(shù)增多，便溏，緊張焦慮，容易激怒等表現(xiàn)，則判斷脾虛證造模成功[13-14]。若骨密度（BMD）峰值減少≥2.5 標(biāo)準(zhǔn)差（SD），則判斷骨質(zhì)疏松癥模型構(gòu)建成功[12]。

1. 5 分組與給藥將建模成功的大鼠隨機(jī)分為4 組，即補(bǔ)中益氣湯組、聯(lián)合組、益生菌合劑組以及模型組，每組10只。給藥劑量根據(jù)等效劑量為成人一日量的6.3倍計(jì)算。補(bǔ)中益氣湯組：給予補(bǔ)中益氣湯水煎液4.46 g·kg-1·d-1灌胃；聯(lián)合組：給予補(bǔ)中益氣湯水煎液4.46 g·kg-1·d-1和極菌開益生菌合劑蒸餾水混懸液6.98 g·kg-1·d-1灌胃；益生菌合劑組：給予極菌開益生菌固體飲料合劑蒸餾水混懸液6.98 g·kg-1·d-1灌胃；模型組：給予等體積生理鹽水灌胃。每日1次，連續(xù)治療4周。

1.6 觀察指標(biāo)與方法

1.6.1 一般情況觀察 造模與干預(yù)期間，每周測(cè)定大鼠體質(zhì)量，同時(shí)觀察大鼠的進(jìn)食量、精神狀態(tài)、行為變化以及皮毛色澤等。

1.6.2 雙能X 射線吸收法（DEXA）檢測(cè)骨密度干預(yù)結(jié)束后，麻醉處死大鼠，將股骨剝出，用10%福爾馬林溶液浸泡，用小動(dòng)物專用雙能X射線骨密度儀進(jìn)行掃描，并分析股骨密度。

1.6.3 Micro-CT 掃描分析股骨組織 使用Micro-CT 掃描儀對(duì)取出的大鼠股骨進(jìn)行掃描。掃描后，重建選擇區(qū)域，得到重建圖像，重建后使用CT Analyser 軟件對(duì)感興趣區(qū)域（ROI）進(jìn)行分析。計(jì)算骨小梁微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)：骨小梁數(shù)（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分離度（Tb.Sp）、體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）等。

1.6.4 Western Blot 法檢測(cè)股骨組織SP7、RUNX2蛋白表達(dá)水平 處死大鼠后迅速剝離股骨，并迅速保存在干冰中。取樣完畢后，在骨組織中加入少許液氮，研磨勻漿，加入裂解液過(guò)夜，收集蛋白溶液。測(cè)定蛋白濃度后根據(jù)濃度調(diào)整樣品蛋白用量，加入上樣緩沖液，沸水浴5 min。吸取樣品上樣，進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)好的膜于室溫脫色搖床上用5%脫脂牛奶封閉1 h。分別加入重組Anti-SP7 抗體（稀釋倍數(shù)1∶1 000）、重組Anti-RUNX2 抗體（稀釋倍數(shù)1∶1 000）、Anti-beta-actin抗體4 ℃孵育過(guò)夜。更換二抗室溫孵育后，使用ECL 顯色液曝光顯影，應(yīng)用ImageJ 軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度（OD）值。

1. 7 統(tǒng)計(jì)方法采用GraphPad Prism 8.0、SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較造模期間：第1周，各組大鼠一般狀態(tài)比較基本無(wú)差異；第2周，各組大鼠開始出現(xiàn)毛發(fā)無(wú)澤、掉毛現(xiàn)象，爪甲顏色較淺，大便較稀軟，且體質(zhì)量開始增長(zhǎng)減緩；第3 周，大鼠出現(xiàn)大便清稀，甚者如水狀，爪甲顏色變淡，毛發(fā)枯萎無(wú)華，尾巴涼，弓背倦怠，喜扎堆，體質(zhì)量增長(zhǎng)進(jìn)一步減少；第4周，各組大鼠明顯成群蜷縮，嗜睡，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)減少，四肢無(wú)力，行動(dòng)緩慢，同時(shí)皮毛爪甲失去正常潤(rùn)澤而枯槁，進(jìn)食量少，排水樣便，次數(shù)增多，緊張焦慮，容易激怒。各組大鼠造模期間體質(zhì)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。提示脾虛證造模成功。

圖1 各組大鼠造模期間體質(zhì)量比較（±s）Figure 1 Comparison of body mass during modeling among each group of rats（±s）

造模成功后開始分組藥物干預(yù)。分組干預(yù)治療1周后，各組大鼠一般情況基本無(wú)明顯差異；治療2周后，與模型組比較，補(bǔ)中益氣湯組、聯(lián)合組及益生菌合劑組大鼠毛發(fā)色澤開始可見些許光澤，爪甲稍變紅，大便性狀雖仍質(zhì)稀、次數(shù)多，但較前已有所好轉(zhuǎn)，體質(zhì)量稍增長(zhǎng)，組間比較，聯(lián)合組大鼠體質(zhì)量顯著高于模型組（P＜0.05）。治療3 周后，與模型組比較，3 個(gè)干預(yù)組大鼠無(wú)扎堆現(xiàn)象，尾巴溫度恢復(fù)正常，毛發(fā)色澤出現(xiàn)光澤、掉毛情況少，爪甲變紅，大便稀軟但成形，大便量及次數(shù)較前減少，體質(zhì)量持續(xù)增長(zhǎng)，組間比較，3 個(gè)干預(yù)組大鼠體質(zhì)量均高于模型組（P＜0.05 或P＜0.000 1），且聯(lián)合組體質(zhì)量高于其他2個(gè)干預(yù)組（P＜0.05）。治療4 周后，與模型組比較，3 個(gè)干預(yù)組大鼠攝食量佳、精神狀態(tài)良好、機(jī)敏好動(dòng)，毛色鮮亮，大便質(zhì)地恢復(fù)、無(wú)便溏癥狀，體質(zhì)量明顯增加，組間比較，3個(gè)干預(yù)組大鼠體質(zhì)量均高于模型組（P＜0.01 或P＜0.000 1），且聯(lián)合組體質(zhì)量高于補(bǔ)中益氣湯組、益生菌合劑組（P＜0.01 或P＜0.001），結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠藥物干預(yù)期間體質(zhì)量比較Table 1 Comparison of body mass during pharmacological intervention among each group of rats（±s）

表1 各組大鼠藥物干預(yù)期間體質(zhì)量比較Table 1 Comparison of body mass during pharmacological intervention among each group of rats（±s）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，③P＜0.000 1，與模型組比較；④P＜0.05，⑤P＜0.001，與益生菌合劑組比較；⑥P＜0.05，⑦P＜0.01，與補(bǔ)中益氣湯組比較

組別補(bǔ)中益氣湯組聯(lián)合組益生菌合劑組模型組鼠數(shù)/只10 10 10 10干預(yù)期間體質(zhì)量/g開始治療時(shí)215.73±2.08 215.46±2.19 215.58±7.45 215.36±6.48第1周220.41±2.30 222.52±2.24 220.10±7.41 218.42±6.92第2周227.73±2.34 231.52±2.36①227.24±7.38 222.93±6.97第3周236.85±2.53①242.55±2.44③④⑥236.41±7.42①230.06±6.96第4周248.16±2.64②256.36±2.51③⑤⑦247.61±7.33②238.99±6.77

2. 2 各組大鼠股骨骨密度比較圖2 結(jié)果顯示：與模型組比較，補(bǔ)中益氣湯組、聯(lián)合組及益生菌合劑組大鼠股骨骨密度明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001）。

圖2 各組大鼠股骨骨密度（BMD）比較（±s）Figure 2 Comparison of bone mineral density（BMD）among each group of rats（±s）

2.3 各組大鼠骨小梁微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)比較圖3 結(jié)果顯示，與模型組比較，補(bǔ)中益氣湯組、益生菌合劑組及聯(lián)合組的Tb.N、Tb.Th及BV/TV顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），Tb.Sp 明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），其中聯(lián)合組改善效果最明顯。

圖3 各組大鼠骨小梁微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)比較（±s）Figure 3 Comparison of microstructural parameters of bone trabeculae among each group of rats（±s）

2. 4 各組大鼠骨組織中SP7 和RUNX2 蛋白表達(dá)比較圖4結(jié)果顯示，與模型組比較，補(bǔ)中益氣湯組、聯(lián)合組及益生菌合劑組大鼠骨組織SP7 和RUNX2 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05 或P＜0.001或P＜0.000 1）。其中，聯(lián)合組SP7和RUNX2蛋白表達(dá)水平顯著高于補(bǔ)中益氣湯組、益生菌合劑組（P＜0.05或P＜0.001）。

圖4 各組大鼠骨組織中SP7和RUNX2蛋白表達(dá)比較（±s）Figure 4 Comparison of protein expressions of SP7 and RUNX2 in bone tissue among each group of rats（±s）

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是中老年人群中常見的骨退行性變疾病[15]?！鹅`樞·五癃津液別》中指出：“五谷之津液和而為膏者，內(nèi)滲于骨空，補(bǔ)益腦髓?！逻^(guò)度則虛，虛極腰背痛而脛酸。”骨痿的發(fā)病與脾虛密切相關(guān)，脾虛則氣血兩虛，骨髓失養(yǎng)，精虧髓空，肢體倦怠無(wú)力而致骨痿?！端貑?wèn)·五臟生成》曰：“腎之合骨也，其榮發(fā)也，其主脾也?！逼馓?，運(yùn)化失常，氣血津液生化無(wú)源，則骨髓失后天之養(yǎng)而痿。蔣寧等[16]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)中益氣顆?？娠@著提高骨質(zhì)疏松小鼠的骨量，明顯抑制成破骨活性。補(bǔ)中益氣湯中君藥黃芪的主要活性成分黃芪多糖不僅可以提高大鼠骨密度[17]，還可以上調(diào)大鼠腸道中有益益生菌的含量[18]。加之補(bǔ)中益氣湯本身即有促進(jìn)腸道菌群生長(zhǎng)的作用[19]。故補(bǔ)中益氣湯值得深入研究。

此外，有證據(jù)表明，調(diào)節(jié)腸道菌群可以改善骨骼健康，是治療骨質(zhì)疏松癥的一種有前途的方法。Ohlsson 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌可保護(hù)卵巢切除小鼠的皮質(zhì)骨，減少骨量流失。益生菌還可以通過(guò)減輕炎癥和促進(jìn)骨形成來(lái)提高骨密度。Whisner 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌可以通過(guò)減輕腸道炎癥和增加骨形成來(lái)預(yù)防骨量流失，這種保護(hù)作用依賴于腸道微生物。加之益生菌復(fù)合制劑能夠調(diào)節(jié)脾虛證大鼠胃腸激素水平，改善其免疫功能[22]。故推測(cè)補(bǔ)中益氣湯聯(lián)合益生菌合劑有望更好地治療脾虛證骨質(zhì)疏松。

本研究構(gòu)建脾虛證骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，觀察補(bǔ)中益氣湯、益生菌合劑單用或聯(lián)合治療脾虛證骨質(zhì)疏松癥大鼠的療效，結(jié)果表明，補(bǔ)中益氣湯、益生菌合劑單用及聯(lián)合用藥不僅可以明顯改善大鼠脾虛證癥狀，促進(jìn)體質(zhì)量增長(zhǎng)，還可明顯促進(jìn)股骨BMD 增加，Micro-CT 三維重建圖像示股骨骨小梁組織較模型組更致密，骨小梁數(shù)目（Tb.N）及骨小梁厚度（Tb.Th）均有所增加且排列有序，骨小梁分離度（Tb.Sp）減小，連續(xù)性增強(qiáng)，骨量丟失較少，且聯(lián)合治療效果優(yōu)于單用補(bǔ)中益氣湯或益生菌合劑。

近年來(lái)Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）/SP7 引起了骨生物學(xué)上的極大重視，被認(rèn)為是骨形成調(diào)節(jié)作用機(jī)制的新途徑。RUNX2 可影響成骨細(xì)胞分化、軟骨細(xì)胞發(fā)育成熟及終末分化軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成骨細(xì)胞[23]，并且RUNX2 高表達(dá)可促進(jìn)成骨細(xì)胞合成骨基質(zhì)[24]。SP7（Osterix）是迄今被發(fā)現(xiàn)的唯一的成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，是骨形成不可缺少的蛋白，可調(diào)節(jié)成骨、軟骨相關(guān)基因表達(dá)，并促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、成熟與骨形成等，參與骨骼發(fā)育的過(guò)程[25]。同時(shí)，RUNX2 可通過(guò)調(diào)節(jié)下游的SP7，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞祖細(xì)胞增殖并分化為成骨細(xì)胞[26]。本研究結(jié)果表明，補(bǔ)中益氣湯、益生菌合劑單用或者聯(lián)合用藥均能上調(diào)骨質(zhì)疏松大鼠骨組織RUNX2和SP7表達(dá)，且以聯(lián)合用藥的效果最明顯。

綜上所述，補(bǔ)中益氣湯、益生菌合劑單用或聯(lián)合使用可激活RUNX2/SP7 途徑，上調(diào)大鼠骨組織RUNX2 和SP7 表達(dá)，提高脾虛證骨質(zhì)疏松癥模型大鼠骨密度，使受損骨結(jié)構(gòu)得到改善。本研究?jī)H明確了該機(jī)制與RUNX2/SP7 途徑相關(guān)，具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步探討。另外，腸道菌群的類型多種多樣，究竟哪幾類菌群是以何種方式影響骨代謝機(jī)制尚未完全掌握，需要加以探究。未來(lái)研究需更好地融合辨證思想和可能機(jī)制，整合補(bǔ)中益氣湯與聯(lián)合益生菌合劑在骨質(zhì)疏松治療中的相通之處。