李美璇，張向昆，王莉，喬月蓮，師校欣，杜國(guó)強(qiáng)

沙地葡萄莖痘相關(guān)病毒在‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄樹(shù)不同物候期和不同部位的變化規(guī)律

李美璇，張向昆，王莉，喬月蓮，師校欣，杜國(guó)強(qiáng)

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北保定 071000

【背景】沙地葡萄莖痘相關(guān)病毒（grapevine rupestris stem pitting associated virus，GRSPaV）是皺木復(fù)合病中最常見(jiàn)的一種病毒，主要通過(guò)無(wú)性繁殖傳播，靈敏的檢測(cè)技術(shù)和培育無(wú)病毒植株是預(yù)防GRSPaV危害的關(guān)鍵?！灸康摹拷RSPaV檢測(cè)體系，確定適宜樣品采集時(shí)期及部位，為病毒檢測(cè)和無(wú)病毒材料培育及樣品采集提供參考?！痉椒ā拷⒒贏ugeGreen染料法和外殼蛋白（coat protein，CP）基因區(qū)域設(shè)計(jì)引物的RT-qPCR檢測(cè)方法，對(duì)攜帶GRSPaV的‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄樹(shù)地上部不同物候期、不同部位的樣品進(jìn)行GRSPaV檢出率及基因表達(dá)量分析。【結(jié)果】以GRS q CP1為引物的GRSPaV RT-qPCR檢測(cè)方法靈敏度較RT-PCR高10倍。GRSPaV在萌芽期、新梢生長(zhǎng)期和花期的檢出率均為100%，果實(shí)膨大期為91.7%；成熟卷須為94.4%，成齡葉片、成齡葉柄和幼嫩枝條均為100%。檢測(cè)為陰性的樣品均為幼嫩部位。GRSPaV CP基因表達(dá)量在花期幼嫩卷須中最高，其次為花期成齡葉片；成齡葉中表達(dá)量在果實(shí)膨大期至成熟期均為同物候期內(nèi)表達(dá)量最高部位；當(dāng)年冬芽的萌芽期及二次枝的新梢生長(zhǎng)期表達(dá)量均較低。【結(jié)論】‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄GRSPaV檢出率和GRSPaV CP基因表達(dá)量隨物候期進(jìn)程表現(xiàn)差異，檢出率在萌芽期至花期最高，果實(shí)成熟期最低；GRSPaV CP基因表達(dá)量在花期最高。綜合檢出率及表達(dá)量因素，花期成齡葉適合作為GRSPaV病毒檢測(cè)樣品；果實(shí)膨大期至成熟期當(dāng)年冬芽及萌發(fā)的二次枝適合作為脫除病毒材料。

‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄；沙地葡萄莖痘相關(guān)病毒；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；病毒檢出率；基因表達(dá)量

0 引言

【研究意義】中國(guó)是世界上最大的鮮食葡萄生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)[1]。據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局統(tǒng)計(jì)，截至2019年，中國(guó)葡萄栽培總面積達(dá)到72.62萬(wàn)公頃，葡萄總產(chǎn)量1 419.54萬(wàn)噸；2021年葡萄總產(chǎn)量達(dá)到1 499.80萬(wàn)噸[2]。栽培上，由于葡萄以無(wú)性繁殖（嫁接和扦插）為主，造成病毒積累和重復(fù)感染，導(dǎo)致病毒病的發(fā)生愈發(fā)嚴(yán)重[3]。‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄自2007年引入中國(guó)后，因其優(yōu)良的品質(zhì)，栽培面積快速增加，逐漸形成規(guī)模[4]。然而因其親本‘白南’極易感染病毒，導(dǎo)致該品種也易被病毒侵染[5]，植株感病后易表現(xiàn)出葉片畸形、變小、褪綠斑駁等癥狀，嚴(yán)重影響光合作用，降低葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)[6]。因此，培育無(wú)病毒感染植株是預(yù)防危害的關(guān)鍵。通過(guò)病毒檢測(cè)技術(shù)，了解樹(shù)體地上部不同部位病毒動(dòng)態(tài)分布變化可為培育無(wú)病毒感染植株提供材料。【前人研究進(jìn)展】據(jù)報(bào)道，‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄受到11種病毒危害，其中，沙地葡萄莖痘相關(guān)病毒（grapevine rupestris stem pitting associated virus，GRSPaV）寄主范圍僅限于葡萄，是在皺木復(fù)合?。╮ugose wood disease，RW）中最常見(jiàn)的一種病毒[7]。該病毒于1961年首次在意大利報(bào)道[8]，在中國(guó)新疆于2004年首次由Ribeiro等[9]檢出。葡萄樹(shù)感染GRSPaV幾年后，比健康的葡萄樹(shù)矮小，嚴(yán)重時(shí)影響果實(shí)產(chǎn)量[8]，有些受感染植株出現(xiàn)樹(shù)勢(shì)衰退現(xiàn)象，重者甚至死亡[10]。該病毒引起的主要癥狀是在莖上出現(xiàn)縱向凹槽和紋孔[10]，但因?yàn)閹Ф局仓甑陌Y狀難以覺(jué)察，加上實(shí)際生產(chǎn)中嫁接技術(shù)的普遍應(yīng)用，以及不同地區(qū)之間廣泛交換繁殖材料，使GRSPaV傳播范圍更加廣泛。GRSPaV主要通過(guò)無(wú)性繁殖傳播，目前沒(méi)有生物媒介傳毒的報(bào)道[11]，且感病植株無(wú)法使用化學(xué)藥劑治愈[12]，分生組織培養(yǎng)或熱處理脫毒也難以從繁殖材料中脫除GRSPaV[13]。目前對(duì)于GRSPaV檢測(cè)的研究主要集中于血清學(xué)和分子生物學(xué)方法，分子生物學(xué)方法精度高、靈敏度高，更適合實(shí)驗(yàn)室病毒檢測(cè)[14-15]。通過(guò)分子生物學(xué)檢測(cè)GRSPaV的方法主要有逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT- qPCR）。Zhang等[8]建立了針對(duì)GRSPaV的RT-PCR特異性檢測(cè)方法。Osman等[16]建立了TaqMan探針RT-qPCR（TaqMan?RT-PCR）檢測(cè)RW的方法，并驗(yàn)證TaqMan?RT-PCR比RT-PCR更靈敏。Greig等[17]采用一步直接實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（DRT-qPCR）方法對(duì)葡萄GRSPaV檢測(cè)進(jìn)行了優(yōu)化，利用更節(jié)省時(shí)間與成本的直接植物提取緩沖液（DiPEB）系統(tǒng)進(jìn)行總核酸提取，取代了商業(yè)試劑盒。Greig等[17]發(fā)現(xiàn)同一新梢上葉齡3—6周葉和＞6周葉的Ct值始終較低，幼葉具有較高的Ct值，并且通常檢測(cè)為陰性；同一片葉左、右半葉間Ct值無(wú)顯著差異；新鮮和冷凍感染葉片的Ct值也沒(méi)有顯著差異；感染GRSPaV的葡萄樹(shù)同一時(shí)期枝條刮取的形成層組織與葉片材料兩組間Ct值無(wú)顯著差異。Hu等[11]利用RT-qPCR檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)對(duì)于感染GRSPaV的3個(gè)品種葡萄試管苗樣品，基因表達(dá)量根部最高，其次為植株上部。Stewart等[18]利用RT-PCR檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)除夏季在幼嫩新梢上采集的嫩芽外，在受感染植物的所有組織中均可檢測(cè)到GRSPaV?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】RT-qPCR相較于RT-PCR、巢式PCR、RT-LAMP等一些檢測(cè)方法更靈敏且穩(wěn)定[19-21]，應(yīng)用DNA染料法進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，以SYBR Green Ⅰ染料應(yīng)用最廣泛[22]，而飽和染料AugeGreen熒光值高于SYBR Green Ⅰ染料，且性能佳、安全性好，同時(shí)相對(duì)TaqMan探針價(jià)格較低，便于在實(shí)驗(yàn)室操作[22]，目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)針對(duì)GRSPaV建立的基于AugeGreen染料的檢測(cè)方法報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用AugeGreen染料法，建立一種針對(duì)GRSPaV的RT-qPCR檢測(cè)方法，并利用該法對(duì)‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄樹(shù)地上部不同部位、不同物候期GRSPaV基因表達(dá)量進(jìn)行研究，為GRSPaV病毒檢測(cè)及培育無(wú)病毒植株提供參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2021—2022年在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。

1.1 供試材料

以4年生自根‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄為試材，株行距3.0 m×3.0 m，南北行向，水平雙臂龍干形整枝。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 GRSPaV RT-qPCR檢測(cè)技術(shù)建立

1.2.1.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 取攜帶GRSPaV的‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄樹(shù)不同部位樣品，總RNA提取使用全能型植物RNA提取試劑盒（DNase I）（CWBIO，Beijing，China）。使用EasyScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TRAN，Beijing，China）合成cDNA。合成產(chǎn)物于-20 ℃保存。

1.2.1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank登錄號(hào)AF026278的GRSPaV基因組序列，設(shè)計(jì)5對(duì)GRSPaV RT-qPCR引物（表1）。

通過(guò)RT-PCR及RT-qPCR對(duì)引物進(jìn)行檢出率、擴(kuò)增效率比較與特異性檢測(cè)。最終引物的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，在NCBI BLAST進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證引物特異性。

表1 GRSPaV RT-qPCR引物序列

1.2.1.3 檢測(cè)體系優(yōu)化及驗(yàn)證 以陽(yáng)性樣品cDNA作為模板，設(shè)置退火溫度范圍為54.0—64.0 ℃，通過(guò)觀察Ct值大小與熒光信號(hào)強(qiáng)度篩選出最適退火溫度。在此退火溫度下，設(shè)置引物濃度梯度為50、100、200、300、400和500 nmol·L-1，篩選引物最佳濃度。

將cDNA模板進(jìn)行100—10-4的梯度稀釋?zhuān)謩e進(jìn)行RT-PCR和RT-qPCR檢測(cè)，比較兩種方法的靈敏度。

1.2.2 GRSPaV CP基因表達(dá)量的動(dòng)態(tài)檢測(cè) 選擇攜帶GRSPaV長(zhǎng)勢(shì)相近的3株‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄樹(shù)作為生物學(xué)重復(fù)，于休眠期、萌芽期、新梢生長(zhǎng)期、花期、果實(shí)膨大期、果實(shí)轉(zhuǎn)色期、果實(shí)成熟期以及落葉期采樣。選擇健壯新梢重截處理促使當(dāng)年形成的冬芽萌發(fā)，于此類(lèi)冬芽萌芽期、新梢生長(zhǎng)期采樣。

按時(shí)期采集休眠枝條、嫩芽、嫩葉片、嫩葉柄、成齡葉片、成齡葉柄、幼嫩卷須、成熟卷須、1—2片葉副梢、3—5片葉副梢、幼嫩新梢、木質(zhì)化枝條。采樣選取植株北、中、南部位，每樣品6個(gè)重復(fù)并進(jìn)行混樣，共147個(gè)樣品。其中成齡葉選取基部1—2片葉，嫩葉選取頂端3—5片葉，休眠期休眠枝條、落葉期幼嫩新梢和木質(zhì)化新梢均取用韌皮部，1—2片葉副梢取用第1節(jié)位，3—5片葉副梢取用第2—3節(jié)位即1—2片葉副梢第1節(jié)位的生長(zhǎng)后期。液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存。

以水作為無(wú)模板對(duì)照，以Actin基因（NC_012010）作為相對(duì)GRSPaV定量的內(nèi)參基因，進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用2-ΔΔCT法計(jì)算病毒基因相對(duì)表達(dá)量，用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SigmaPlot制圖，SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析。GRSPaV檢出率（%）=陽(yáng)性樣品數(shù)/總樣品數(shù)×100。

2 結(jié)果

2.1 GRSPaV RT-qPCR檢測(cè)方法建立

2.1.1 引物篩選 提取9個(gè)感染GRSPaV的‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄樹(shù)樣品RNA，使用5對(duì)引物對(duì)樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，以水作為無(wú)模板對(duì)照。引物GRS q CP1與GRS q RdRp1擴(kuò)增效果較好，9個(gè)陽(yáng)性樣品均檢出目標(biāo)條帶，GRS q CP2和GRS q TGB兩對(duì)引物檢出率低，且條帶不清晰。引物GRS q RdRp2無(wú)法擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。所有無(wú)模板對(duì)照均未產(chǎn)生條帶（圖1）。

M：DL2000；CK：無(wú)模板對(duì)照；1—9：攜帶GRSPaV的葡萄樣品 CK: No template control; 1-9: Grape samples infected GRSPaV

將陽(yáng)性樣品的cDNA模板進(jìn)行100—10-4的梯度稀釋?zhuān)褂靡颎RS q CP1和GRS q RdRp1進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增并構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明兩對(duì)引物擴(kuò)增效率均較高，分別為102.7%和110.7%。GRS q RdRp1引物溶解曲線存在非特異性擴(kuò)增，因此選擇GRS q CP1作為檢測(cè)引物。

對(duì)GRSPaV CP1擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得的序列使用NCBI BLAST進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果均為GRSPaV的病毒分離物，且相似性最高達(dá)98.35%，證明擴(kuò)增片段為GRSPaV的部分序列。

2.1.2 RT-qPCR反應(yīng)體系優(yōu)化及驗(yàn)證

2.1.2.1 退火溫度及引物濃度篩選 將退火溫度區(qū)間設(shè)置為54.0—64.0 ℃時(shí)，RT-qPCR擴(kuò)增結(jié)果Ct值在22.72—30.02。當(dāng)退火溫度為54.0、54.7、56.0和57.9 ℃時(shí)，Ct值較低，范圍在22.72—24.11。其中當(dāng)溫度為57.9 ℃時(shí)，曲線的相對(duì)熒光強(qiáng)度達(dá)到最高，因此，選擇57.9 ℃作為GRS q CP1的最終退火溫度（圖2）。

退火溫度57.9 ℃時(shí)，隨著引物濃度降低，曲線Ct值逐漸增加。當(dāng)引物濃度為400和500 nmol·L-1時(shí)，Ct值分別為23.83和23.37，均較低且差異小，相對(duì)熒光強(qiáng)度均較強(qiáng)，為避免高引物濃度產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，選擇擴(kuò)增效果較好、引物濃度較低的400 nmol·L-1作為本試驗(yàn)最終引物濃度（圖3）。

使用經(jīng)過(guò)優(yōu)化的RT-qPCR反應(yīng)檢測(cè)體系構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明100—10-4倍樣品稀釋的擴(kuò)增曲線呈梯度分布，決定系數(shù)較高（2=0.985），擴(kuò)增效率較好（E=102.7%）（圖4）。

圖2 不同退火溫度下GRSPaV的RT-qPCR擴(kuò)增結(jié)果

圖4 GRSPaV引物GRS q CP1的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2.2 靈敏度比較 梯度稀釋的樣品cDNA分別進(jìn)行RT-PCR和RT-qPCR擴(kuò)增，RT-qPCR可穩(wěn)定檢測(cè)到稀釋10-3倍的GRSPaV陽(yáng)性樣品，RT-PCR只能檢測(cè)到10-2倍，表明RT-qPCR檢測(cè)靈敏度比RT-PCR檢測(cè)提高了10倍（圖5）。

2.2 ‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄樹(shù)地上部GRSPaV分布的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

2.2.1 不同時(shí)期和不同部位GRSPaV的檢出率 選擇3株經(jīng)前期檢測(cè)攜帶GRSPaV的‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄樹(shù)，分別在8個(gè)物候期，采集12個(gè)不同部位共147個(gè)樣品進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，以Ct值＞32為陰性。如表2所示，GRSPaV在‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄樹(shù)新梢中的檢出率由高到低依次為：萌芽期（100%）=新梢生長(zhǎng)期（100%）=花期（100%）＞果實(shí)膨大期（91.7%）=落葉期（91.7%）＞休眠期（66.7%）＞果實(shí)轉(zhuǎn)色期（50%）＞果實(shí)成熟期（41.7%）。重截促使萌發(fā)的當(dāng)年冬芽萌芽期及二次枝的新梢生長(zhǎng)期檢出率均低于新梢的同一物候期。

檢測(cè)為陰性的樣品共38個(gè)，3次檢測(cè)為陰性的樣品分別是果實(shí)轉(zhuǎn)色期1—2片葉副梢，果實(shí)成熟期嫩葉片、嫩葉柄、幼嫩卷須和3—5片葉副梢，二次枝新梢生長(zhǎng)期1—2片葉副梢，所有樣品均為幼嫩部位。

對(duì)GRSPaV在不同部位中的檢出率進(jìn)行分析。不同部位檢出率由高到低次序?yàn)椋撼升g葉片（100%）=成齡葉柄（100%）=幼嫩新梢（100%）＞成熟卷須（94.4%）＞嫩芽（83.3%）＞嫩葉柄（72.2%）=幼嫩卷須（72.2%）＞木質(zhì)化枝條（66.7%）=休眠枝條（66.7%）＞3—5片葉副梢（53.3%）＞嫩葉片（50%）＞1—2片葉副梢（46.7%）。成齡葉片及成齡葉柄從花期到落葉期所有樣品均檢出病毒。僅采自于落葉期的幼嫩新梢檢出率比同期的木質(zhì)化新梢和休眠期采集的休眠枝條檢出率高。成熟卷須采自新梢生長(zhǎng)期至成熟期和二次枝新梢生長(zhǎng)期，檢出率僅次于成齡葉片、成齡葉柄和幼嫩新梢，是幼嫩卷須檢出率的1.3倍。

表2 不同物候期不同部位‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄樹(shù)樣品GRSPaV檢出結(jié)果

GRSPaV陽(yáng)性樣本/該時(shí)期該部位樣本總數(shù)；空格表示沒(méi)有測(cè)試過(guò)的樣本

GRSPaV positive samples / the total number of samples in this period; Blanks denote samples that have not been tested

圖5 陽(yáng)性葡萄樣品不同稀釋梯度RT-PCR（左）和RT-qPCR（右）檢測(cè)方法靈敏度比較

所有部位中檢出率最低的部位是1—2片葉副梢，成熟度較高的3—5片葉副梢檢出率略高于1—2片葉副梢。檢出率較低的部位是嫩葉片，嫩葉柄檢出率是嫩葉片的1.4倍。新梢的嫩葉片和嫩葉柄在新梢生長(zhǎng)期和花期檢出率均為100%，果實(shí)膨大期檢出率開(kāi)始降低，至成熟期時(shí)檢測(cè)為陰性。幼嫩卷須在新梢生長(zhǎng)期至果實(shí)膨大期檢出率均為100%，果實(shí)轉(zhuǎn)色期檢出率降低，成熟期檢測(cè)為陰性。兩種副梢在新梢生長(zhǎng)期和果實(shí)膨大期檢出率為100%，果實(shí)轉(zhuǎn)色期至成熟期檢出率降低或檢測(cè)為陰性。

2.2.2 不同時(shí)期及不同部位GRSPaV CP基因表達(dá)量變化 通過(guò)RT-qPCR技術(shù)對(duì)不同物候期中芽、葉、卷須、副梢、新梢及休眠枝條韌皮部樣品的GRSPaV進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算病毒CP基因的相對(duì)表達(dá)量。由圖6可知，GRSPaV在花期幼嫩卷須中基因表達(dá)量最高，其次為花期成齡葉片。不同物候期中GRSPaV CP基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢(shì)，在花期最高，果實(shí)膨大期其次，在新梢生長(zhǎng)期、果實(shí)轉(zhuǎn)色期和果實(shí)成熟期表達(dá)水平一致，其余時(shí)期中表達(dá)量均較低。

成齡葉片中基因表達(dá)量呈現(xiàn)不斷降低的趨勢(shì)，在果實(shí)膨大期至成熟期均為同物候期內(nèi)表達(dá)量最高部位；成齡葉柄則表現(xiàn)出先降低再升高至成熟期達(dá)到最高，再降低的趨勢(shì)；幼嫩卷須中基因表達(dá)量呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(shì)，新梢生長(zhǎng)期升高至花期達(dá)到最高，其余時(shí)期均保持最低水平；成熟卷須中表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，在新梢生長(zhǎng)期中與幼嫩卷須同為基因表達(dá)量最高的部位；嫩葉片、嫩葉柄及兩種副梢中基因表達(dá)量在所有物候期中均較低且無(wú)顯著性差異。

在生長(zhǎng)周期中，GRSPaV在花期的幼嫩卷須和成齡葉片中的含量最高。新梢生長(zhǎng)期至果實(shí)膨大期的GRSPaV分布范圍較廣泛，在卷須、成齡葉片、成齡葉柄中均有存在，從果實(shí)轉(zhuǎn)色期至落葉期病毒集中于成齡葉片及成齡葉柄，其余部位的病毒基因表達(dá)量均保持較低水平。重截新梢萌芽期及新梢生長(zhǎng)期的所有樣品病毒基因表達(dá)量均處于最低水平。

3 討論

3.1 GRSPaV RT-qPCR檢測(cè)體系應(yīng)用

‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄作為易被病毒侵染的葡萄品種之一，其無(wú)病毒繁殖材料的使用是減少病害發(fā)生和危害的重要策略。通過(guò)建立一種快速、高靈敏度且可靠的檢測(cè)方法來(lái)確認(rèn)葡萄材料中是否存在病毒十分重要[11]。目前已報(bào)道建立了葡萄卷葉病毒3[23]、葡萄病毒A[20]、葡萄病毒B[24]和葡萄蠶豆萎蔫病毒[19]的RT-qPCR檢測(cè)體系，分別比相應(yīng)的RT-PCR法靈敏度高10倍、100倍和1 000倍。本研究建立了針對(duì)GRSPaV的RT-qPCR檢測(cè)方法，也比RT-PCR靈敏度高10倍，能夠檢測(cè)出基因表達(dá)量較低的陽(yáng)性樣品。

圖6 ‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄樹(shù)不同物候期不同部位GRSPaV CP基因表達(dá)量

不同種類(lèi)病毒檢測(cè)時(shí)需要對(duì)病毒不同基因區(qū)域設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行篩選。周俊等[21]對(duì)葡萄扇葉病毒的歸巢蛋白、移動(dòng)蛋白和CP基因區(qū)域設(shè)計(jì)引物研究，以歸巢蛋白基因區(qū)域的引物擴(kuò)增效果最好。任芳等[25]對(duì)葡萄卷葉病毒2的多聚蛋白、DNA解旋酶、區(qū)域設(shè)計(jì)的引物研究，其中區(qū)域的引物擴(kuò)增效果最好。本研究以GRSPaV的、和區(qū)域設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明區(qū)域的引物檢出率高，特異性好。CP包裹核酸，保護(hù)病毒中的遺傳物質(zhì)，并參與病毒的復(fù)制、擴(kuò)增和傳播等重要過(guò)程，具有高度序列保守性[26]。

3.2 不同物候期及不同部位GRSPaV檢出率存在差異

病毒在植物組織中并非均勻分布，且在一些特殊情況下，組織顯癥可能會(huì)有所延遲[27]，給病毒檢測(cè)工作增加難度。因此，篩選病毒檢出率高的植物部位與關(guān)鍵物候期可以為適宜病毒檢測(cè)樣品的采集提供參考。本研究根據(jù)不同物候期的檢出率發(fā)現(xiàn)萌芽期、新梢生長(zhǎng)期、花期和果實(shí)膨大期的GRSPaV檢出率較高，而果實(shí)轉(zhuǎn)色期和果實(shí)成熟期檢出率較低。尚佑芬等[28]研究表明5—6月（即本研究花期至果實(shí)膨大期）采集的葉片陽(yáng)性率高，9—10月（即本研究成熟期）采集的葉片陽(yáng)性率低，與本研究結(jié)果一致。

Hu等[11]通過(guò)RT-PCR法研究葡萄各部位病毒檢出率，新梢韌皮部檢出率為89.3%，葉柄檢出率為50.0%。本研究中幼嫩新梢韌皮部與成齡葉的葉片、葉柄檢出率均為100%，這可能與兩種方法靈敏度不同有關(guān)。Stewart等[18]認(rèn)為休眠芽最適宜作為檢測(cè)材料，但因其研究只針對(duì)芽、莖尖、種子和枝條部位的樣品進(jìn)行檢測(cè)，未包含本研究檢出率最高的成齡葉，與本研究結(jié)果不矛盾。由于提取核酸時(shí)必須先將新梢韌皮部制成削片，耗時(shí)費(fèi)工[18]，而成齡葉樣品制備相對(duì)更簡(jiǎn)單，因此認(rèn)為成齡葉更適合作為GRSPaV檢測(cè)材料。

3.3 不同物候期及不同部位中GRSPaV CP基因表達(dá)量存在差異

本研究在對(duì)‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄樹(shù)不同物候期及不同部位的GRSPaV定量分析中，CP基因在果實(shí)膨大期、果實(shí)轉(zhuǎn)色期、果實(shí)成熟期、落葉期中成齡葉片或成齡葉柄中Ct值始終較低。這一結(jié)果與Greig等[17]發(fā)現(xiàn)同一枝條上葉齡3周以上的葉片Ct值始終較低結(jié)果一致。此外，據(jù)Xiao等[29]報(bào)道，6—9月，‘品麗珠’‘霞多麗’‘雷司令’‘佳美’和‘瓊瑤漿’葡萄上成齡葉和枝條韌皮部中GRSPaV的基因表達(dá)量沒(méi)有差異，這與本研究落葉期的結(jié)果一致。

Monis等[30]報(bào)道病毒在葡萄體內(nèi)分布不均勻可能是由于病毒在韌皮部組織中的運(yùn)動(dòng)和復(fù)制效率低造成，且位于葡萄新梢基部的樣品中檢測(cè)到較高的病毒滴度。本研究結(jié)果表明，GRSPaV主要集中在成熟度較高的部位，幼嫩部位中病毒含量較低。因此，根據(jù)GRSPaV CP基因表達(dá)量在不同物候期及成齡葉中的變化規(guī)律，認(rèn)為花期的成齡葉更適宜作為GRSPaV病毒檢測(cè)樣品。

本研究通過(guò)重截促使冬芽當(dāng)年萌發(fā)形成的當(dāng)年冬芽和二次枝，重截新梢的萌芽期及新梢生長(zhǎng)期均處于果實(shí)膨大期及果實(shí)轉(zhuǎn)色期，此時(shí)GRSPaV已經(jīng)在成熟部位中積累，而當(dāng)年冬芽和二次枝的所有樣品此時(shí)比較幼嫩，病毒向幼嫩組織中移動(dòng)較慢[30]，GRSPaV在當(dāng)年冬芽和二次枝的所有部位中CP基因表達(dá)量一直維持在低水平。因此，認(rèn)為果實(shí)膨大期至成熟期冬芽及萌發(fā)的二次枝可作為脫除病毒材料的采集樣品。

4 結(jié)論

本研究首次建立了基于AugeGreen染料法的RT-qPCR GRSPaV病毒檢測(cè)體系，靈敏度較RT-PCR高10倍。不同物候期病毒檢出率在春季萌芽期至花期較高，花后開(kāi)始降低，果實(shí)成熟期達(dá)到最低值，落葉期開(kāi)始回升。不同部位病毒檢出率由高到低依次為：成齡葉片=成齡葉柄=幼嫩新梢＞成熟卷須＞嫩芽＞嫩葉柄=幼嫩卷須＞木質(zhì)化枝條=休眠枝條＞3—5片葉副梢＞嫩葉片＞1—2片葉副梢。GRSPaV CP基因表達(dá)量整體呈先升高再下降的趨勢(shì)，以花期最高。綜合GRSPaV檢出率及CP基因表達(dá)量等因素，進(jìn)行GRSPaV病毒檢測(cè)時(shí)宜采集花期成齡葉；用于脫除病毒材料時(shí)宜采集果實(shí)膨大期至成熟期冬芽及萌發(fā)的二次枝。

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The Variation of GRSPaV in Different Parts of Shine Muscat Grapevines During Their Phenological Periods

LI MeiXuan, ZHANG XiangKun, WANG Li, QIAO YueLian, SHI XiaoXin, DU GuoQiang

College of Horticulture, Hebei Agricultural University, Baoding 071000, Hebei

【Background】Grapevine rupestris stem pitting associated virus (GRSPaV) is the most common virus causing rugose wood disease. It is mainly transmitted via asexual reproduction. Sensitive detection technology and cultivation of virus-free plants are essential for preventing GRSPaV. 【Objective】The purpose of this study was to establish a GRSPaV detection system, and to determine the appropriate periods and sites of sample collection for virus detection, so as to provide a reference for virus detection and obtaining virus-free materials. 【Method】An RT-qPCR detection method was established using the AugeGreen dye method and primers according to the coat protein gene () region. The detection rate and gene expression of GRSPaV in samples from different parts of Shine Muscat grapevines during various phenological stages were examined. 【Result】The RT-qPCR detection method for GRSPaV using GRS q CP1 as primer showed 10 times higher sensitivity than that of RT-PCR method. The detection rates of GRSPaV were 100% during the budbreak, shoot growing period, and florescence, 91.7% during the fruit enlargement stage, 94.4% for mature tendrils, and 100% for mature leaves, mature petioles, and tender shoots. Samples showing negative results were all from the young parts of the plants. The young tendrils at florescence showed the highest level of GRSPaVgene expression, followed by the mature leaves at florescence. The expression level in mature leaves was the highest among the parts in the same phenological period from berry expansion to maturity. The expression levels in secondary winter buds at the budbreak stage and the secondary laterals at the shoot growing period were both relatively low. 【Conclusion】 The detection rate of GRSPaV and the GRSPaVgene expression level of Shine Muscat grape varied with the progression of phenological periods. The detection rate was the highest from budbreak to florescence, while which was the lowest at berry maturity period. The GRSPaVgene expression level was the highest at florescence. Based on both the detection rate and the expression level factors, it could be concluded that the mature leaves at florescence were suitable as samples for GRSPaV virus detection, and the winter buds from the berry expansion to maturity period and the lateral shoots germinated from these buds was appropriate for obtaining virus-free materials.

Shine Muscat grapevines; grapevine rupestris stem pitting associated virus; real-time fluorescence quantitative PCR; detection rate of viruses; gene expression level

2023-06-21；

2023-08-21

河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系葡萄創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（HBCT2023150201）、熱雜果現(xiàn)代種業(yè)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（葡萄-6）（21326310D）

李美璇，E-mail：lmx970130@163.com。張向昆，E-mail：1169806059@qq.com。李美璇和張向昆為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者杜國(guó)強(qiáng)，E-mail：gdu@hebau.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）