王雪竹，伍曄暉，陶喬孝慈，劉建華

（ 1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院動物科技分院，新疆 昌吉 831199 ； 2.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆 烏魯木齊 830052 ）

禽副黏病毒（avian paramyxovirus，APMVs）是全球禽類感染率最高的重要病毒之一。根據(jù)相關(guān)報道，APMVs可在遷移的水禽中呈流行性暴發(fā)，許多APMVs均是在流感病毒的監(jiān)測過程中被發(fā)現(xiàn)。鴿子、野鴨、雙冠鸕鶿是野生鳥類群體中APMVs的重要宿主之一[1-2]。APMVs發(fā)病率增加嚴重制約了家禽業(yè)的發(fā)展，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。禽副黏病毒1型（avian paramyxovirus type 1，APMV-1）是APMVs中最具特征的病毒，又稱新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV），源自英格蘭的紐卡斯爾海濱市。1926年，NDV首次從印度尼西亞被發(fā)現(xiàn)；1927年，英國新城堡報道了NDV[3]。NDV在全球范圍內(nèi)呈地方性暴發(fā)，其傳播速度快，宿主范圍廣，病死率高達90%[4]，對家禽養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成一定威脅。禽副黏病毒4型（avian paramyxovirus type 4，APMV-4）1975年首次分離自宰鴨廠[5]。在美國，APMV-4主要分離自水禽，如野鴨、木鴨、赤膀鴨、環(huán)頸鴨等[6]，且大多是在禽流感的監(jiān)測過程中被發(fā)現(xiàn)?？蓮膶嶒炇腋腥続PMV-4 1 d后的SPF雛雞肺、氣管、胰腺及腸部檢測到該病毒[7]。目前除實驗室感染雞可導致輕度間質(zhì)性肺炎和卡他性氣管炎外，APMV-4感染無明顯的臨床表征[8]。若不能及時控制APMV-1和APMV-4的流行趨勢，可能會造成更大的損失，因此，盡早分離和鑒定病原并進行生物學特性研究迫在眉睫。針對上述問題，本研究擬對上述兩種病毒的流行現(xiàn)狀和特點進行總結(jié)，并對其進行分子生物學特性研究，以期為今后臨床預防APMV-1和APMV-4提供參考。

1 APMV-1/NDV

APMVs屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae family）、禽腮腺炎病毒屬（Avulavirus genus），其基因組為不分節(jié)段的單股、負鏈RNA。目前，可通過紅細胞凝集抑制試驗（haemagglutination inhibition，HI）和神經(jīng)氨酸酶抑制試驗（neuraminidase inhibition，NI）將APMV分為21個血清型（APMV-1～APMV-21）[9]，各血清型之間的致病潛力也存在很大差異。不同血清型的APMV與禽類物種不同程度的致病性相關(guān)，其中APMV-1是APMVs中最具特征的血清型，能夠在雞群中引起嚴重的疾病，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

1.1 病原學

APMV-1基因組結(jié)構(gòu)特征為3'-N-P-M-F-HN-L-5'，可依次編碼產(chǎn)生6個結(jié)構(gòu)蛋白，包括融合蛋白（fusion protein，F(xiàn)）、大聚合酶蛋白（large polymerase protein，L）、基質(zhì)蛋白（matrix protein，M）、核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）、磷蛋白（phosphoprotein，P）和血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（hemagglutination-neuraminidase protein，HN）[10]。此外，NDV基因組在3'末端含有55個核苷酸（nt）前導序列，在5'末端含有114個nt尾序列。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，NDV的F蛋白是其致病性的重要決定因素之一，對宿主起到主要保護作用。流感病毒和NDV毒株在其F蛋白裂解位點含有共有序列R/KR-Q-R/K-R↓F，F(xiàn)蛋白裂解位點的共有序列是G/E-K/R-Q-G/E-R↓L，蛋白前體F0至F1-F2亞基是NDV感染性的決定因素。因此，F(xiàn)蛋白切割位點的氨基酸序列假定為NDV毒力的主要決定簇。F基因和HN基因在NDV毒力和致病性中起到主要作用。有研究表明，F(xiàn)基因的免疫原性比HN基因更好，并可誘導NDV的無菌免疫感染。F蛋白的切割位點存在谷氨酰胺殘基的保守位點，并且Q114R的突變可導致病毒毒力減弱。此外，病毒的毒力和致病性可通過改變F蛋白調(diào)制糖基化位點。由于NDV在野鴨中普遍呈隱性感染狀態(tài)[11]，且病毒顆粒在水中穩(wěn)定性更強，因此野鴨遷徙也是該病毒遠距離傳播的途徑之一。

1.2 病毒復制

APMV進入宿主細胞，通過糖蛋白（F、HN）在病毒表面上的相互作用及其與細胞表面唾液酸受體的介導結(jié)合，使病毒與宿主細胞融合。病毒核衣殼進入宿主細胞質(zhì)，使負性病毒RNA被轉(zhuǎn)錄，通過病毒編碼的RNA以依賴性RNA聚合酶的梯度方式，使用宿主細胞機器翻譯和折疊病毒蛋白產(chǎn)生mRNA結(jié)構(gòu)。一旦達到N基因mRNA的最佳濃度，則將負向基因組RNA轉(zhuǎn)化為積極的反基因組模板，用于合成新的負性RNA基因組。

1.3 流行病學

雞非典型新城疫一年四季均可發(fā)病，夏季相對高發(fā)，病雞與帶毒雞均是該病的傳染源。據(jù)調(diào)研分析，多數(shù)發(fā)病雞為免疫雞，但病情較為溫和[12]，不同日齡的雞感染癥狀不同。其中，1～2月齡的雛雞發(fā)病率最高，接種免疫4～15 d后和抗體效價較低的成年雞群易感；產(chǎn)蛋雞多在產(chǎn)蛋高峰期之前易感[13]。NDV不僅能夠感染雞，也可感染其他禽類，其中火雞最易感，鴨、鵝均易感，但雞的病死率最高。

根據(jù)致病性可將NDV分為3類：輕毒（低毒力）、中毒性（中等毒力）和強毒性（高毒力）。通過氨基酸裂解位點預測，可根據(jù)NDV的毒力基因?qū)⑵浞譃槭葍?nèi)臟型和嗜神經(jīng)型等兩種。1996至2005年間，通過對美國、丹麥、芬蘭和瑞典陸續(xù)分離的NDV進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)這些毒株均來自同一池塘的野鳥[14]。鴿群也是該病毒傳播的主要媒介之一，帶毒體可通過排便及分泌物大范圍傳播病毒[15]。為更好地防控NDV，世界各地多個國家已制定相應的免疫程序。

1.4 臨床癥狀

雞新城疫的臨床癥狀差異較大，其嚴重程度主要取決于感染毒株的毒力、免疫狀態(tài)、抗體效價、品種日齡、飼養(yǎng)管理水平等因素。感染NDV會損害雞的特異性免疫系統(tǒng)，雞血紅細胞會出現(xiàn)血凝抑制現(xiàn)象，并抑制細胞表面產(chǎn)生抗體。雞新城疫可分為典型性和非典型性兩種，根據(jù)臨床癥狀和發(fā)病速度還分為最急性、急性和慢性等3種。一般情況下，自然感染NDV具有3～5 d的潛伏期[16]?；疾‰u常伴隨呼吸癥狀、神經(jīng)癥狀、急性敗血癥及黏膜出血等。發(fā)病初期，患病雞出現(xiàn)精神萎靡、羽毛雜亂、食欲廢絕、飲欲增加、排黃綠色水樣糞便，并伴隨輕微呼吸、神經(jīng)癥狀；后期癥狀加重，體溫升高至43 ℃，流涎、嗉囊積液，雞冠肉髯呈紫紅或紫黑色，產(chǎn)蛋量下降，癱瘓，重者死亡[17]。

1.5 診斷方法

容敏靖等[18]針對NDV建立結(jié)合TaqMan探針的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（RT-TaqMan-LAMP）快速檢測方法，驗證該方法的特異性、靈敏性和重復性，并與反轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR（RT-dPCR）方法對比。結(jié)果顯示，研究建立的NDVRT-TaqMan-LAMP檢測方法特異性強、靈敏度高、重復性好，能夠有效避免非特異性擴增，可用于NDV的精準檢測和流行病預防。王靜靜等[19]針對國內(nèi)流行的基因Ⅵ型NDV F基因保守區(qū)域設計特異性引物和探針，建立了RT-dPCR方法，并考察了該方法的靈敏度、特異性和重復性。結(jié)果顯示，建立的方法線性關(guān)系良好，靈敏度高，最低檢測限為1.97 copies/μL；特異性強，重復性好。仇薪鑫等[20]建立了1種快速鑒別NDV強弱毒株的RT-PCR診斷方法，對傳染性法氏囊炎病毒（IBDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）和傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）的檢測結(jié)果均為陰性，對NDV強弱毒株最小RNA檢出量為0.01 mg/L。王通輝等[21]建立了NDV、IBDV和IBV三重RT-PCR檢測方法，該方法特異性、穩(wěn)定性良好。

ELISA試驗分為直接法、間接法、雙抗體夾心法、競爭法等，間接ELISA試驗具有時效高、便捷等優(yōu)點，適用于大范圍的臨床檢測，廣泛應用于抗原、抗體的檢測[22-25]。索南元旦[26]建立了1種快速檢測NDV抗體的間接ELISA診斷方法,靈敏度為1∶12 800，與血凝抑制試驗符合率為96.1%。孟凱等[27]采用商品化NDV ELISA檢測試劑盒和PCR法對50份臨床疑似新城疫病料進行檢測，以此驗證ELISA檢測方法的準確性和優(yōu)缺點。有研究采用原核表達純化方法獲得建立NDV LaSota株的核衣殼蛋白（NP），將其作為包被抗原建立NDV間接ELISA抗體檢測方法，該方法的靈敏度是血凝抑制試驗的50倍，組間重復性試驗的變異系數(shù)小于6%[28]。

1.6 防控

由于我國尚未研制出適用于本土禽類的APMV-1商品化特效藥，因此防控APMV-1最好的方法即加強飼養(yǎng)管理，制定科學合理的免疫程序，定期監(jiān)測雞群免疫水平。

1.6.1 加強日常飼養(yǎng)管理

日常飼養(yǎng)管理中，保證各階段雞群的營養(yǎng)需要，飲水清潔，適當通風，嚴格把控飼養(yǎng)密度，調(diào)節(jié)適宜溫度、濕度，建立良好的生物安全體系，定期消毒，避免長途運輸，減少應激，對病死雞和淘汰雞做好分群管理和無害化處理。

1.6.2 制定科學合理的免疫程序

國內(nèi)新城疫常用疫苗主要有減毒毒活疫苗如VGGA、LaSota、clone30等基因Ⅱ型疫苗株，主要通過滴鼻、飲水及氣霧的形式進行免疫。弱毒苗可同時誘導體液免疫和細胞免疫，產(chǎn)生抗體速度快，但抗體效價較低，而且免疫后易誘發(fā)呼吸道疾病。滅活苗主要是LaSota株和Ⅶd亞型A-Ⅶ株制備的兩種疫苗，雖然免疫抗體效價較高，但速度抗體生成速度較慢[28]。根據(jù)雞群的品種、年齡，養(yǎng)殖場的規(guī)模條件、飼養(yǎng)管理水平和該地區(qū)APMV-1的流行特點，制定相應的免疫程序。實時監(jiān)測雞群APMV-1的免疫狀態(tài)和抗體效價，提高信息化管理水平。首次免疫在孵化后的5～7 d內(nèi)進行，采用疫苗滴鼻、點眼的形式；第一次接種15 d后接種第二針疫苗。除滴鼻、點眼外，還可通過飲水的形式給藥，注意疫苗量要增加0.5～1.0倍。第2次免疫接種后25 d內(nèi)進行第3次免疫。嘔雞場規(guī)模較小、飼養(yǎng)管理條件較差，可適時進行第4次免疫。

1.6.3 排除其他疫病的影響

免疫接種能夠在一定程度上保護雞群，但要避免疫病傳播，就必須采取更嚴格的措施，如消毒、隔離、封閉等，從而消滅傳染源，切斷傳播途徑。養(yǎng)殖場內(nèi)應注意排除其他疫病的影響，防止雞群發(fā)生雞馬立克氏病、雞傳染性法氏囊病、雞白痢、雞慢性呼吸道病等。

2 APMV-4

2.1 病原學

APMV-4屬于副禽腮腺炎病毒屬，電鏡下可觀察到病毒顆粒呈圓形，表面有致密的纖突，內(nèi)部有被囊膜包裹的對稱螺旋核衣殼[29]。APMV-4基因組大小為15 054 nt，基因組順序為3'-N-P/V/W-M-F-HN-L-5'，含有6個非重疊基因，共編碼6種蛋白（F、L、M、N、P和HN）。其中HN蛋白和F蛋白是構(gòu)成病毒囊膜表面纖突的2種結(jié)構(gòu)蛋白，在APMV-4的發(fā)病過程中起到重要的作用。

2.2 流行病學

全球有8條候鳥遷徙路線，其中有3條途徑中國，中國作為候鳥的重要越冬地，有430多種遷徙的候鳥從中國過境種類，占世界的20%～25%[30]。野鳥遷徙生態(tài)系統(tǒng)被認為是APMV-4的主要傳播途徑，野鳥遷徙途中的棲息地是監(jiān)測野鳥病毒的重要場所。鳥類遷移成為病原體傳播擴散潛在威脅，可能影響疾病傳播的動態(tài)[31]。為更好地進行AMPV-4在全球范圍的傳播、進化、分布、生態(tài)學及流行病學研究，應加強對家禽及野生禽類種群的監(jiān)測。

2.3 臨床癥狀

蛋雞自然感染APMV-4會出現(xiàn)白殼蛋產(chǎn)量增加的現(xiàn)象，無其他明顯臨床癥狀。實驗室感染APMV-4可導致禽類出現(xiàn)輕度間質(zhì)性肺炎和卡他性氣管炎[7]，癥狀于感染后的5～9 d最明顯，之后逐漸恢復，且無其他明顯臨床表征。NDV與APMV-2是APMVs中導致禽類發(fā)病的主要血清型，由于APMV-4 F1亞基的N端與NDV強毒株、APMV-2相同，由此推測APMV-4也存在強致病性的可能[32]。

2.4 檢測方法

2.4.1 分子生物學檢測

APMV-4常用的分子生物學檢測方法有普通PCR、q PCR、RT-PCR等。其中RT-PCR的操作相對準確、簡便，在國內(nèi)外常用于病毒初期感染診斷和病毒的分離鑒定。2008年，Nayak等[33]對APMV-4鴨/香港/D3/75株的完整基因組進行了測序，并對含胚雞蛋進行檢測，分析其致病性。2014年，王靜靜等[34]建立了APMV-4熒光RT-PCR檢測方法。2017年，楊金興等[30]建立了特異性區(qū)分APMV-1和APMV-4的一步法RT-PCR檢測方法。張慧敏等[7]利用RT-PCR法對APMV-4新疆分離株的基因組進行了擴增，并對該毒株進行了遺傳進化分析。

2.4.2 血清學檢測

常用的APMV-4血清學檢測方法有HA與HI試驗、ELISA試驗、間接免疫熒光、免疫組織化學等。實驗室常用HA-HI試驗進行病毒的初步鑒定，該試驗方法具有操作方法簡單、檢測成本低廉的優(yōu)點。由于APMV-4感染細胞不產(chǎn)生明顯的細胞病變（CPE），HA-HI試驗對于APMV-4病毒滴度的測定具有重要意義。Alexander等[35]通過HAHI試驗，發(fā)現(xiàn)APMV-4分離株與NDV毒株存在低水平的單向交叉反應。張慧敏[7]利用HA-HI試驗，發(fā)現(xiàn)APMV-1的陽性血清在一定程度上可抑制APMV-4出現(xiàn)血凝現(xiàn)象，這一試驗結(jié)果與Alexander等[35]研究一致。

2.5 防控

通過實驗室研究發(fā)現(xiàn)，感染APMV-4并沒有明顯的臨床表征，目前國內(nèi)用于APMV-4的鑒別診斷技術(shù)甚少，也沒有太深入的研究。我國尚未研制出適用于本土禽的APMV-4的商品化疫苗與特效藥。

3 禽副黏病毒的生物學進展

反向遺傳學系統(tǒng)是一種強大的技術(shù)，通過該技術(shù)，感染性病毒可通過克隆DNA產(chǎn)生，并可提供預期修飾及將其引入病毒基因組。從cDNA克隆中回收重組APMVs，有助于了解更多APMV基因及其蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。目前，APMV-1病毒載體已應用于疫苗的開發(fā)和研制，APMV-2～APMV-4、APMV-7和APMV-9還可作為減毒病毒載體開發(fā)的候選物[36]。APMV-1和APMV-9對雞的致病性得以確定[37]，現(xiàn)已深入探討重組NDV的生物學功能，并單獨對其疫苗效價進行審查。有研究顯示，APMV-4中F蛋白切割位點的突變率增加會促進細胞感染、復制及形成合胞體。值得注意的是，APMV-7在細胞培養(yǎng)中不形成合胞體或噬斑，改變?nèi)诤锨懈钗稽c中的單個氨基酸可增加其細胞病變。

4 結(jié)論

APMVs是世界各地家禽業(yè)的主要威脅之一，在許多地區(qū)呈地方性感染。特別是APMV-1在鳥類物種間存在不同程度的感染，其毒力和致病性不斷循環(huán)。目前，APMV-1～APMV-4和APMV-7的反向遺傳學研究為更好的探索其生物學的意義奠定了研究基礎。但對于APMVs的生物學特性、流行率以及其對感染家禽的實際影響還有待進一步探究。此外，了解不同APMVs的完整基因組序列并調(diào)查流行病學可為后期疫苗研發(fā)做準備。