張汗青 張黎紅 顧國(guó)建

膽囊癌（Gallbladder carcinoma，GBC）是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，惡性程度較高。根據(jù)Globocan 2020 數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)，全球共有84 695 例與GBC 相關(guān)的死亡病例[1]。因?yàn)镚BC 患者早期癥狀不典型，被發(fā)現(xiàn)時(shí)通常已達(dá)晚期，故預(yù)后極差[2]。唯一有可能治愈GBC 的方法是早期根治性手術(shù)切除。然而，由于缺乏早期準(zhǔn)確檢測(cè)GBC 的非侵入性方法，根治性切除率較低[3，4]。因此，發(fā)現(xiàn)能夠早期診斷GBC 的標(biāo)志物對(duì)于患者制定最佳治療方案和改善預(yù)后具有重要意義。

孕酮和脂聯(lián)素受體3（PAQR3）基因分子量為37 kDa，位于染色體4q21 上。PAQR3 的N 末端朝向細(xì)胞質(zhì)，C 末端位于高爾基體，屬于PAQR 家族的第3 個(gè)成員[5～7]。研究發(fā)現(xiàn)，其在多種惡性腫瘤中低表達(dá)，如非小細(xì)胞肺癌、賁門癌、食管癌，可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、新生血管生成、侵襲力增強(qiáng)[8～10]。波形蛋白（Vimentin）是一種分子量為57kDa 的蛋白，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的典型標(biāo)志物，且高表達(dá)者預(yù)后不良[11，12]。

本研究通過探討PAQR3、Vimentin 與患者預(yù)后和臨床病理特征之間的關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)能用于診斷和判斷GBC 患者預(yù)后的指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集2019 年9 月～2022 年10 月于我院手術(shù)切除的77 例GBC 患者的癌組織標(biāo)本，患者年齡40～82 歲，平均64.9 歲。另將77 例患者中有癌旁組織標(biāo)本的23 例作為研究對(duì)照。術(shù)后病理類型均為腺癌。本研究獲得患者知情同意，術(shù)后隨訪3 年。

1.2 方法采用免疫組織化學(xué)SP 染色法，將所有石蠟標(biāo)本切成4μm 的連續(xù)薄片，使用二甲苯將標(biāo)本脫蠟15min，后梯度酒精水化5min；將標(biāo)本用3%H2O2孵育10min，后將標(biāo)本浸入檸檬酸緩沖液中煮沸。滴加一抗單克隆兔抗人PAQR3 或Vimentin 抗體（1：100，武漢博士德生物公司）適量過夜。第2天標(biāo)本在室溫下孵育30min，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3 次，每次3min。后滴加適量通用二抗（武漢博士德生物公司），室溫孵育15min。用PBS 清洗切片3 次，每次3min。在標(biāo)本上滴加適量的辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，室溫孵育30min。標(biāo)本上滴加適量的DAB 液，顯微鏡下觀察顯色。而后終止反應(yīng)，將切片蘇木素復(fù)染，最后脫水，封片[8]。

1.3 結(jié)果判定由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師對(duì)切片進(jìn)行雙盲閱片。根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：0分為無細(xì)胞染色，1 分為淺棕色顆粒，2 分為棕黃色顆粒，3 分為褐色顆粒。根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分：0 分為陽性細(xì)胞數(shù)1%～5%，1 分為陽性細(xì)胞數(shù)5%～50%，2 分為陽性細(xì)胞數(shù)51%～100%。將兩項(xiàng)得分相加即為最后得分，≤2 分為陰性（-）表達(dá)，>2分為陽性（+）表達(dá)[8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用n 和%表示，采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果腫瘤細(xì)胞漿被染成棕黃色或棕褐色為PAQR3 陽性表達(dá)細(xì)胞（見圖1A），胞漿無染色者為陰性表達(dá)細(xì)胞（見圖1C）。細(xì)胞漿被染成棕黃色或棕褐色為Vimentin 陽性表達(dá)細(xì)胞（見圖1B），胞漿無染色者為陰性表達(dá)細(xì)胞（見圖1D）。

2.2 PAQR3 和Vimentin 的表達(dá)PAQR3 在鄰近癌旁組織中的陽性表達(dá)率為78.3%，明顯高于GBC組織的48.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.011）；而Vimentin 在GBC 組織中的陽性表達(dá)率為59.7%，明顯高于癌旁組織的13.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；PAQR3 和Vimentin 陽性表達(dá)率與腫瘤的TNM 分期、病理分級(jí)、術(shù)后生存時(shí)間和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05），與患者的年齡和性別無關(guān)（P>0.05）。見表1。

圖1 PAQR3 和Vimentin 在GBC 組織中的表達(dá)（×200）

表1 GBC 組織中PAQR3 和Vimentin 蛋白的表達(dá)情況[n（%）]

2.3 相關(guān)性分析在77 例GBC 患者的癌組織標(biāo)本中，PAQR3 和Vimentin 均陽性表達(dá)的標(biāo)本11 例，均陰性表達(dá)的標(biāo)本5 例；37 例PAQR3 陽性標(biāo)本中，Vimentin 陰性表達(dá)26 例；46 例Vimentin 陽性表達(dá)標(biāo)本中，PAQR3 陰性表達(dá)35 例；PAQR3 和Vimentin 蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.589，P<0.001）。

3 討論

PAQR3 是一種具有抑制多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基因[6，7，9，13]，可能機(jī)制有：①PAQR3 在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)結(jié)合原癌基因絲氨酸/蘇氨酸激酶（B-Raf/C-Raf），并將其隔離在高爾基體上，干擾Raf 激酶與其上游和下游信號(hào)分子結(jié)合，進(jìn)而抑制大鼠肉瘤（Ras）/Raf/絲裂原活化蛋白激酶（MEK）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號(hào)通路[6，7]。②PAQR3 過表達(dá)后，可上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)，下調(diào)Vimentin 的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其可以通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad 信號(hào)通路進(jìn)而抑制EMT 過程[9]。③PAQR3 能夠抑制G 蛋白偶聯(lián)受體下游的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[13]。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PAQR3 在GBC 組織中的陽性率顯著低于鄰近癌旁組織，并且與TNM 分期、病理分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示PAQRS 參與GBC 的發(fā)生和進(jìn)展，可作為GBC 診斷的分子標(biāo)志物。有學(xué)者報(bào)道，與PAQR3 陰性表達(dá)患者相比，陽性表達(dá)患者的預(yù)后較好[5，9]，與本研究結(jié)果一致，提示PAQR3 可成為判斷GBC 患者預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。Tang 等[14]將PAQR3 過表達(dá)后，結(jié)果顯示，人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力明顯下降，提示PAQR3 基因可作為一個(gè)潛在的基因治療靶點(diǎn)。

EMT 是指上皮細(xì)胞通過特定程序成為具有基質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，其特征是細(xì)胞黏附性喪失和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)。EMT 是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程[15]。在EMT 過程中，細(xì)胞黏附分子（如E-鈣黏蛋白）的表達(dá)減少，細(xì)胞角蛋白轉(zhuǎn)化為基于Vimentin 的細(xì)胞骨架，其形態(tài)具有間充質(zhì)細(xì)胞的特征[10]。通過EMT，上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性及表型（如與基底膜的連接），并獲得高基質(zhì)表型，如遷移和侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Vimentin 在GBC 組織中的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，并且與TNM 分期、組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示其參與GBC 的發(fā)生和進(jìn)展，可作為GBC 診斷的分子標(biāo)志物。有研究發(fā)現(xiàn)，與Vimentin 陰性表達(dá)者相比，Vimentin 陽性表達(dá)者預(yù)后較差[11，12]，與本研究結(jié)果一致。

我們還發(fā)現(xiàn)，PAQR3 在GBC 組織中低表達(dá)，而Vimentin 在GBC 組織中高表達(dá)，二者呈負(fù)相關(guān)，提示PAQR3 對(duì)Vimentin 有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制可能與其參與腫瘤的EMT 過程有關(guān)[9]。

總之，PAQR3 下調(diào)或Vimentin 上調(diào)與GBC 發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)，提示PAQR3 和Vimentin 與GBC的生存和預(yù)后相關(guān)，今后可能成為GBC 患者診斷和預(yù)后的評(píng)價(jià)指標(biāo)。