曾煉坤 邱友燕 蔣嬋 熊靜妮 陳丹丹 李素燕 劉雪芳

肝癌是常見的高發(fā)病率和高致死率的惡性腫瘤，可導致肝功能受損，而肝臟屬于代謝器官，肝功能受損往往伴隨糖脂代謝異常情況發(fā)生[1]。因此，對其發(fā)生機制進一步研究并提出有效的防治對策具有重要意義。Ahn[2]在肝臟中發(fā)現(xiàn)了一個與肝臟丙酮酸激酶（LPK）啟動子區(qū)碳水化合物反應元件（ChoRE）結合的轉錄因子，稱為碳水化合物反應元件結合蛋白（ChREBP）。新近研究表明，在非胰島素信號通路的作用下，糖代謝物可通過ChREBP 調(diào)控糖酵解及脂質(zhì)合成關鍵酶的表達，進而影響肝內(nèi)脂質(zhì)沉積[3]。因此，本研究擬采用高血糖誘導的人HepG2 肝癌細胞，通過檢測肝臟脂肪沉積，ChREBP入核，以及檢測LPK 和脂肪酸合成酶（FAS）的表達，研究高濃度葡萄糖條件下肝脂質(zhì)沉積的可能機制，為臨床防治肝細胞癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞及培養(yǎng)人肝癌HepG2 細胞株購于上海細胞庫，目錄號：SCSP-510。采用RPMI1640 培養(yǎng)基（含有0.0625g/L 青霉素和0.1g/L 鏈霉素），在37℃、5%CO2飽和濕度的條件下，體外培養(yǎng)HepG2 肝癌細胞，當細胞貼壁率達到85%～90%后，再用0.25%的胰酶水溶液（含有0.02%的EDTA）對其進行酶解，通過臺盼藍拒染實驗檢測其存活率，其存活率在90%以上，再進行傳代[4]。

1.2 細胞分組及給藥根據(jù)文獻，將HepG2 肝癌細胞分為3 組：對照組（葡萄糖終濃度為11mmol/L）、中糖組（葡萄糖終濃度為18mmol/L）和高糖組（葡萄糖終濃度為25mmol/L）[5]。

1.3 細胞內(nèi)TG 含量的檢測分別于干預后24h、48h 收取細胞，用預冷的PBS 清洗2 次，加入RIPA細胞裂解液，混勻后于冰上裂解30min，取上清，按照TC、TG 檢測試劑盒說明書，采用GPO-PAP 法測定細胞內(nèi)TG 含量。

1.4 細胞內(nèi)脂滴含量的檢測將18mm×18mm 的蓋玻片放入6 孔板中，然后接種1×105個/mL 濃度的HepG2 肝癌細胞，1mL/孔，24h 后，給予25mmol/L的葡萄糖，分別作用24h 和48h，對照組與中糖組分別給予11mmol/L、18mmol/L 的葡萄糖，其他步驟與高糖組相同。通過PBS 沖洗、4%PVA 固定、油紅-O染色、蘇木素細胞核二次染色等方法，對細胞內(nèi)橙紅色的脂滴進行計數(shù)[6]。

1.5 細胞內(nèi)ChREBP 核轉位的觀察加入葡萄糖處理3、6、12、24h 后，參考 ChREBP 的細胞轉運工具包，進行細胞核轉運實驗。以100 個細胞為單位，選擇6 個高放大倍率的區(qū)域，對其進行核轉位檢測。

1.6 細胞LPK 基因mRNA 表達量的檢測應用RT-PCR 方法檢測。分別在0、12、24、36、48h 時，采用Trizol 法提取總RNA，以此為模板，測定其純度及完整性；應用RT-PCR 方法對LPK 基因進行擴增。LPK 的引物序列為：5'-CTCTGCCTACTGGACATTGACTCC-3'；5'-CTCTGCCTACTGGACATTGACTCC-3'；內(nèi)參β-actin 的引物序列為：5'-GGGGCCTGCTGCCTTCCTCCTTCCTGCTCCTG-3'，5'-CGTCATACTCCTGCTTCCTGCT-3'，全長540bp。所有引物由BauerBiology（大連）有限責任公司合成。在94 ℃下，進行5min 的PCR 反應。結果表明，在94℃下，樣品的變形時間為30s，在55℃下，樣品的熱處理時間為30s，在72℃下，樣品的延伸時間為30s，共35 次。在72 ℃時，可延長10min。用1.5%的瓊脂糖電泳對PCR 反應的結果進行鑒別，用溴化乙啶進行染色，用凝膠成像機進行顯像，用Quntityone 圖像分析軟件對PCR 反應的結果進行分析；將樣品與β-actin 的總光學密度之比作為LPK基因表達量。

1.7 細胞FAS 蛋白表達的檢測使用免疫印跡法檢測FAS 蛋白。在高糖環(huán)境下24h 和48h 后，以 BCA法檢測其含量，以6%的SDS-PAGE 電泳分離，再以5%的脫脂乳粉對其進行封閉。用1:1 000 稀釋的FAS 抗體在4℃下孵育過夜。PBST 進行3 次清洗，并添加對應的二抗（以1:5 000 稀釋的辣根過氧化物酶標記的小鼠抗兔IgG），并在室溫孵育90min。將 PBST 清洗3 遍，添加ECL 化學發(fā)光試劑1mL，使用1min，將薄膜上的試劑吸干，置于暗盒中曝光，顯影，定影；用Quntityone 影像分析軟件對其進行分析，并將其與樣品中β-actin 的積分光度之比作為其表達量。

1.8 統(tǒng)計學方法利用SPSS 22.0 軟件包進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以表示，多組對比采用單因素方差分析，兩兩組間對比采用t檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 葡萄糖對HepG2 肝癌細胞內(nèi)TG 含量的影響HepG2 肝癌細胞中TG 的含量隨葡萄糖濃度的升高和作用時間的延長而升高。中糖、高糖組在24h時TG 的濃度較對照組稍有增高（t=0.631，1.047；P=0.357，0.135）；中糖、高糖組的TG 水平在48h時較對照組顯著增高（t=5.352，5.896；P=0.0010，0.0008）。見表1。

2.2 葡萄糖對HepG2 肝癌細胞內(nèi)脂滴含量的影響油紅-O 染色后，在高糖環(huán)境下，脂肪細胞內(nèi)出現(xiàn)較多的橘黃色脂肪顆粒。另外，在不同的發(fā)酵階段，其油脂成分也有不同程度的增加。見圖1。

表1 葡萄糖作用時間對各組HepG2 肝癌細胞內(nèi)TG 含量的影響（μg/mg 總蛋白，，n=3）

表1 葡萄糖作用時間對各組HepG2 肝癌細胞內(nèi)TG 含量的影響（μg/mg 總蛋白，，n=3）

注：與對照組比較，aP<0.01；與中糖組比較，bP<0.01；與24h 比較，cP=0.0074；cP=0.0017

2.3 葡萄糖對HepG2 肝癌細胞內(nèi)ChREBP 核轉位的影響在不同時間點及高糖處理組0h，ChREBP 以胞漿定位為主。在高糖狀態(tài)下，3h 后，ChREBP 有緩慢的入核趨勢。在6、12h 時，兩組細胞的核移位顯著增加，核移位的比例在20%左右。在24h 后，ChREBP 在細胞的核漿中逐漸降低。

2.4 葡萄糖對HepG2 肝癌細胞LPK 基因mRNA相對表達量的影響RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，高糖組在不同時間點上LPK 基因mRNA 的表達水平明顯升高。高糖組LPK 基因的mRNA 表達量隨血糖處理時間的增加而增加，12h 達到峰值，之后有下降趨勢；在12（P=0.0014）、24（P=0.0020）及36h（P=0.0354）的表達水平均顯著高于對照組。見表2。

圖1 油紅-O 染色觀察HepG2 肝癌細胞內(nèi)脂滴的含量（×400）

表2 葡萄糖作用時間對各組HepG2 肝癌細胞LPK 基因mRNA 相對表達量的影響（）

表2 葡萄糖作用時間對各組HepG2 肝癌細胞LPK 基因mRNA 相對表達量的影響（）

注：與0h 比較，bP=0.0017；與24h 比較，cP=0.0119

2.5 葡萄糖對HepG2 肝癌細胞FAS 蛋白表達的影響Western blot 結果顯示，高糖組24、48h FAS 蛋白的表達水平明顯高于對照組，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P=0.0030、0.0001）。見圖2、表3。

圖2 Western blot 分析HepG2 肝癌細胞FAS 蛋白的表達

表3 葡萄糖作用時間對各組HepG2 肝癌細胞FAS 蛋白相對表達量的影響（）

表3 葡萄糖作用時間對各組HepG2 肝癌細胞FAS 蛋白相對表達量的影響（）

注：與24h 比較，cP<0.01

3 討論

ChREBP 是一種重要的轉錄因子，可直接活化LPK，進而調(diào)控肝細胞糖酵解。在離體實驗中，我們發(fā)現(xiàn) ChREBP 可促進小鼠肝臟 LPK 的表達。通過RNAi 沉默ChREBP，可以抑制25mmol/L 濃度的葡萄糖對LPK 的上調(diào)作用。ChREBP 可與 LPK 及其他下游基因啟動子區(qū)相結合[7]。既往研究發(fā)現(xiàn)正常膳食誘導的ChREBP-/-小鼠丙酮酸比例降低，丙酮酸生成減少，糖酵解受到抑制。在此過程中，6-磷酸葡萄糖在肝組織中的含量增加[8]。在高糖條件下，ChREBP-/-小鼠的肝重量較對照小鼠增加了40%左右，提示其肝組織中糖原積累增加[9]。此外，我們還發(fā)現(xiàn)小鼠肝組織中與糖異生有關的酶（如葡萄糖6-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸激酶等）表達顯著降低，提示其肝內(nèi)葡萄糖和糖原增加并非由于糖異生增加，而是由于糖酵解被抑制所致[10]。ChREBP 是調(diào)控肝臟果糖代謝的關鍵分子。在肝臟中，果糖的代謝途徑有別于肌肉、脂肪等組織。肌、脂等組織中的己糖激酶可磷酸化果糖，參與糖酵解或糖原合成，但在肝內(nèi)，葡萄糖激酶對果糖的親和力較弱，故依賴于肝內(nèi)特異的果糖激酶[11]。果糖激酶（1-磷酸）將果糖轉化為1-磷酸果糖（1-磷酸），將2-甘油醛（3-磷酸）轉化為甘油醛（3-磷酸），進而將3-磷酸轉化為糖原。我們前期工作發(fā)現(xiàn)，果糖代謝關鍵酶Glut5、Fructokinase 和 aldolaseB 均受到 ChREBP 的調(diào)節(jié)，且ChREBP 缺失導致果糖代謝紊亂和果糖不耐受。ChREBP-/-小鼠在高糖條件下數(shù)天就會死亡。高蔗糖日糧（能分解成葡萄糖、果糖）1 星期內(nèi)死亡率超過50%[4]。

為此，本項目擬構建人HepG2 肝癌細胞株，觀察高脂高糖條件下ChREBP、LPK 和FAS 的變化，明確高脂高糖誘導的ChREBP-LPK-FAS 信號途徑導致肝內(nèi)脂肪堆積的機制[12]。我們的實驗結果表明：與正常的葡萄糖濃度（11mmol/L）相比，高糖所致的實驗組大鼠HPG 肝細胞中的TG 水平明顯增高，說明其可引起肝脂肪堆積；為此，我們提出假說：高糖可使ChREBP 進入細胞核，并與LPK 和FAS 等啟動的ChoRE 相互作用，上調(diào)LPK 和FAS等基因的轉錄水平，從而上調(diào)其下游分子的轉錄水平。該研究與王欣等[13]的研究一致，課題組前期研究表明，在血糖敏感性的胰腺癌株832/13 中，ChREBP 在2h 后即表現(xiàn)出轉錄活力，3h 達高峰，且持續(xù)12h。血糖信號途徑是一條快速響應途徑，但是相對于其他途徑，血糖信號途徑不能產(chǎn)生快速的脫敏。ChREBP 作為一個重要的調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)節(jié)肝細胞的糖脂代謝。有研究指出，糖脂代謝紊亂相對于健康小鼠，其糖代謝和脂代謝通路中LPK、ACC、FAS 等蛋白水平顯著下降，肝內(nèi)脂肪含量顯著減少，糖耐量顯著增加，食欲顯著降低[14]。

綜上所述，ChREBP 是一個在糖脂代謝過程中發(fā)揮重要作用的轉錄因子，其可能是一個潛在的防治脂肪肝的新靶點。