王嚴(yán)嚴(yán)，蔣世云

1 廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院 廣西柳州 545006

2 廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)部 廣西柳州 545006

盆腔炎（pelvic inflammatory disease，PID）是臨床上常見的婦科疾病，其主要由微生物感染引起的炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致不孕癥、異位妊娠和慢性盆腔疼痛等后遺癥，嚴(yán)重影響女性健康[1]。臨床上常采用廣譜抗生素治療，但是長(zhǎng)期使用抗生素容易引起胃腸道反應(yīng)、耐藥性等不良反應(yīng)[2]。金雞膠囊（JinJi JiaoNang，JJJN）是在金雞沖服制劑的基礎(chǔ)上，更改技術(shù)工藝，是廣西靈峰藥業(yè)有限公司在國(guó)內(nèi)首創(chuàng)研發(fā)出的婦科用藥。由于中藥制劑成分較多且復(fù)雜，金雞膠囊所起療效的主要活性成分和作用機(jī)制還不是十分清楚。故本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，通過構(gòu)建金雞膠囊活性成分-作用靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，得到關(guān)鍵活性成分和核心靶點(diǎn)，初步闡明金雞膠囊治療PID 的作用機(jī)制，為后續(xù)增強(qiáng)其療效提供一定的科學(xué)依據(jù)。

資料與方法

1 金雞膠囊活性成分和靶點(diǎn)的搜集與篩選

基 于 數(shù) 據(jù) 庫(kù)ETCM[3]、HERB[4]、TCMSP[5]和 文獻(xiàn)[6]搜集金雞膠囊6 味中藥所有化學(xué)成分。以O(shè)B ≥30%，DL ≥0.18[7]和Lipinski 規(guī)則[8]作為藥物活性成分的篩選條件建立金雞膠囊藥物活性小分子庫(kù)。基于Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)[9]和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)[10]預(yù)測(cè)化合物作用靶點(diǎn)。

2 PID 疾病靶點(diǎn)的篩選

以關(guān)鍵詞“pelvic inflammatory disease”上傳至OMIM 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//www.omim.org/）、Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）進(jìn)行檢索，兩者合并去重復(fù)得到盆腔炎（PID）疾病作用靶點(diǎn)。

3 金雞膠囊治療PID 靶點(diǎn)蛋白相互作用分析

利用BioLadder 生物信息在線分析可視化云平臺(tái)（https：//www.bioladder.cn/web/#/pro/index） 分 析金雞膠囊化學(xué)成分作用靶點(diǎn)和PID 疾病作用靶點(diǎn)，得到交集靶點(diǎn)。利用String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.string-db.org/）初步分析蛋白之間的相互作用，并運(yùn)用Cytoscape 3.8.2 軟件對(duì)得到的tsv 格式進(jìn)一步分析，結(jié)合Network Analyzer 分析得到的度值大小排序和插件Cytohubba 中的MCC 算法得到的分?jǐn)?shù)排名較高的前30 位靶蛋白，取共同靶蛋白作為潛在的核心靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)的研究[11]。

4 核心靶蛋白的基因富集分析

運(yùn)用Cytoscape 3.8.2 軟件中的插件ClueGo[12]和Metescape 數(shù)據(jù)庫(kù)[13]對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體分析，物種選擇人類，P＜0.01，分析其主要的生物學(xué)過程和作用通路。通過構(gòu)建金雞膠囊活性成分-核心靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路圖，經(jīng)Network Analyzer 分析后根據(jù)度值、介數(shù)中心性和緊密性＞中位數(shù)反推測(cè)出起主要作用的藥物成分和作用靶點(diǎn)，進(jìn)一步從整體出發(fā)，探究金雞膠囊治療PID 的作用機(jī)制和活性成分。

5 分子對(duì)接研究

運(yùn)用Autodock 4.0 軟件對(duì)篩選出的5 個(gè)關(guān)鍵活性物質(zhì)和6 個(gè)核心靶蛋白進(jìn)行對(duì)接，初步驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的準(zhǔn)確性。利用Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)[9]和OpenBabel軟件完成關(guān)鍵活性成分結(jié)構(gòu)的下載和pdb 格式文件的轉(zhuǎn)換，作為小分子配體。利用PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）和Uniport 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）篩選并下載相應(yīng)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，作為分子對(duì)接的受體。使用AutoGrid 工具設(shè)置對(duì)接盒的參數(shù)，采用半柔性對(duì)接找到最佳對(duì)接條件，并記錄受體和配體的對(duì)接位置。將對(duì)接自由能絕對(duì)值＞8.0Kcal/mol 的作為優(yōu)勢(shì)構(gòu)象[14]，利用Pymol 軟件和PLIP 數(shù)據(jù)庫(kù)[15]進(jìn)行可視化繪制和分析。

結(jié) 果

1 金雞膠囊主要活性成分的篩選結(jié)果

結(jié) 合ETCM、HERB、TCMSP 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 和 文 獻(xiàn)，共檢索出金雞膠囊化學(xué)成分有712 種。同時(shí)滿足OB ≥30%、DL ≥0.18 和類藥五原則（MW（g/mol）＜500、Hdon＜5、Hacc＜10、Rbon ≤10、ALogP＜5）共有46 種。其中穿心蓮9 種、功勞木7 種、雞血藤17 種、兩面針15 種、千斤拔3 種、金櫻根1 種，見圖1 和表1。

表1 金雞膠囊化學(xué)成分

圖1 金雞膠囊活性成分網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

2 金雞膠囊化學(xué)成分作用靶點(diǎn)和PID 疾病靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

經(jīng)過SwissTargetPrediction 預(yù)測(cè)，得到金雞膠囊復(fù)方中穿心蓮、功勞木、雞血藤、兩面針、千斤拔和金櫻根作用靶點(diǎn)數(shù)目分別為282、284、368、376、81 和57，整理后得到金雞膠囊作用靶共618 個(gè)。對(duì)OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)和Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到PID 疾病靶點(diǎn)，經(jīng)去重復(fù)處理后得到510 個(gè)。利用BioLadder 在線分析，得到金雞膠囊治療PID 的作用靶點(diǎn)89 個(gè)，見圖2。

圖2 金雞膠囊治療PID 交集靶點(diǎn)

3 金雞膠囊治療PID 靶蛋白相互作用分析結(jié)果

經(jīng)String 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集靶蛋白初步分析得到相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，圖中共涉及78 個(gè)節(jié)點(diǎn)、245 條邊，見圖3。將tsv 格式上傳至Cytoscape 軟件，結(jié)合Network Analyzer 分析和MCC 算法運(yùn)算結(jié)果，對(duì)排名前30 名靶蛋白取交集，得到26 個(gè)交集靶蛋白，作為后續(xù)研究的核心靶蛋白，具體拓?fù)鋮?shù)見表2。

表2 金雞膠囊治療PID 核心靶蛋白網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/p>

圖3 金雞膠囊治療PID 蛋白相互作用分析

4 核心靶蛋白的GO、KEGG 分析結(jié)果

從整體看，經(jīng)ClueGo 插件對(duì)核心靶蛋白分析得到主要生物學(xué)過程包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和腺體發(fā)育、對(duì)活性氧的反應(yīng)、一氧化氮合酶活性的調(diào)節(jié)等，見圖4。KEGG 分析得到132 條作用通路，除廣泛的癌癥信號(hào)通路外，主要涉及HIF-1 信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、JAK-STAT 信號(hào)通路和C 型凝集素受體信號(hào)通路等炎癥信號(hào)通路。根據(jù)P＜0.01 和基因數(shù)量選擇前20 個(gè)作用通路做可視化分析，見圖5。

圖4 ClueGo 功能分析核心靶點(diǎn)生物學(xué)過程網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

圖5 核心靶蛋白作用通路富集分析

5 金雞膠囊活性成分-核心靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路的構(gòu)建結(jié)果分析

利用Cytoscape 3.8.2 軟件繪制“金雞膠囊活性成分-核心靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路圖”，經(jīng)Network Analyzer 分析后得到89 個(gè)節(jié)點(diǎn)，269 條邊，活性成分的度值中位數(shù)為5.35135，靶蛋白度值中位數(shù)為15.07692。根據(jù)度值排序，金雞膠囊中前5 個(gè)化學(xué)成分14-去氧-12-甲氧基穿心蓮內(nèi)酯（JJJN3）、穿心蓮黃酮（JJJN5）、甘草查爾酮A（JJJN20）、遠(yuǎn)志酮I（JJJN25）和千層紙素A（JJJN2）作為主要活性成分。6 個(gè)靶蛋白EGFR、PIK3CA、ESR1、AKT1、MTOR、MAPK1 作為最核心的靶點(diǎn)發(fā)揮作用，見表3。

表3 金雞膠囊主要活性成分和核心靶點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)

6 分子對(duì)接結(jié)果

利用Autodock 軟件將5 個(gè)關(guān)鍵化合物（14- 去氧-12-甲氧基穿心蓮內(nèi)酯、穿心蓮黃酮、甘草查爾酮A、遠(yuǎn)志酮I、千層紙素A）和6 個(gè)核心靶蛋白（EGFR、PIK3CA、ESR1、AKT1、MTOR、MAPK1）進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)果以熱圖顯示，見圖6。從圖中可以看出，化合物與靶蛋白結(jié)合自由能均小于零，說明兩者可進(jìn)行自由結(jié)合，且結(jié)合能值越低代表兩者結(jié)合越牢固，結(jié)合效果越好[17]。其中化合物14-去氧-12-甲氧基穿心蓮內(nèi)酯與靶蛋白ESR1 結(jié)合自由能值最小，為-9.65Kcal/mol，說明該化合物可能是通過靶蛋白ESR1 對(duì)PID 發(fā)揮治療作用。利用Pymol 軟件和PLIP數(shù)據(jù)庫(kù)分析優(yōu)勢(shì)構(gòu)象之間的相互作用，見表4。

表4 優(yōu)勢(shì)構(gòu)象對(duì)接結(jié)果

圖6 金雞膠囊中關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果

討 論

金雞膠囊是婦科常用藥，臨床上常用于治療濕熱下注引起的PID 疾病。在該制劑中金櫻根能夠除濕熱、止帶，為君藥；雞血藤行血通絡(luò)，千斤拔利濕、消瘀、解毒，功勞木、穿心蓮清熱解毒，共為臣藥；兩面針行氣止痛、解毒消腫，為佐藥[18]。本研究對(duì)金雞膠囊治療PID 的主要活性成分和作用機(jī)制進(jìn)行了初步預(yù)測(cè)和分析，其中化合物14-去氧-12-甲氧基穿心蓮內(nèi)酯、穿心蓮黃酮和千層紙素A 為穿心蓮化學(xué)成分，甘草查爾酮A 和遠(yuǎn)志酮I 為雞血藤化學(xué)成分，這也正說明了君臣藥中所含有的化學(xué)成分可能在治療PID 的過程中起較大作用。靶蛋白EGFR、PIK3CA、ESR1 等6 個(gè)作用靶蛋白可能為主要的作用靶點(diǎn)，主要作用于HIF-1信號(hào)通路等炎癥信號(hào)通路發(fā)揮治療作用。

化合物14-去氧-12-甲氧基穿心蓮內(nèi)酯屬于半日花烷型二萜內(nèi)酯類，該類化合物具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種藥理活性作用[19]。但是目前對(duì)此化合物的藥理活性研究暫未見相關(guān)報(bào)道。結(jié)合分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)該化合物與靶蛋白ESR1 結(jié)合自由能最小，后續(xù)可在確保藥物的安全性及可靠性的情況下，著重研究其藥理學(xué)活性和新型靶向制劑等。研究發(fā)現(xiàn)，穿心蓮黃酮能夠強(qiáng)抑制血小板聚集，具有活血化瘀的作用[20]。Li MT 等[21]通過整理甘草查爾酮A 的藥理活性，發(fā)現(xiàn)其具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗寄生蟲等多種藥理活性?；衔镞h(yuǎn)志酮I 屬于氧雜蒽酮衍生物，研究發(fā)現(xiàn)，基于氧雜蒽酮為母體衍生出來的化合物，具有抗腫瘤、抗凝血、抗血小板、抗炎等多種藥理活性[22]。但是對(duì)于該化合物，是否具有抗炎、抗菌等功效還是有待驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)，千層紙素A 可通過抑制NO 產(chǎn)生和COX-2 酶的表達(dá)發(fā)揮基礎(chǔ)抗炎作用，通過對(duì)血管舒張、抵抗血管脫落和抗血管增生發(fā)揮對(duì)血管組織和細(xì)胞的保護(hù)作用，此外還有可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞以及抗病毒作用[23]。

結(jié)合PPI 蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖篩選出6 個(gè)核心靶蛋白。其中靶蛋白EGFR 是一種酪氨酸激酶，參與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，影響體內(nèi)細(xì)胞發(fā)育過程，以及血管生成和腫瘤的發(fā)生[24]。靶蛋白PIK3CA、AKT1、MTOR可參與PI3K/AKT/MTOR 信號(hào)通路，該信號(hào)通路參與調(diào)控體內(nèi)細(xì)胞過程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、分化和遷移等[25]。研究發(fā)現(xiàn)，甘草查爾酮A 可以激活該信號(hào)通路，抑制腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)過程，包括細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并可以誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞發(fā)生自噬[26]。靶蛋白ESR1為雌激素受體，當(dāng)與雌激素配體結(jié)合后，可釋放疼痛因子和炎癥因子，可導(dǎo)致慢性PID 疼痛[27]。MAP 激酶可作為幾種生化信號(hào)通路的整合點(diǎn)，參與各種細(xì)胞過程，如細(xì)胞凋亡，炎癥和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[28]。分子對(duì)接顯示六個(gè)核心靶蛋白與五個(gè)關(guān)鍵化合物都有一定的結(jié)合口袋，且結(jié)合自由能在-9.65Kcal/mol ～-5.56Kcal/mol。其中化合物14-去氧-12-甲氧基穿心蓮內(nèi)酯和甘草查爾酮 A 與靶點(diǎn)ESR1、AKT1 均具有較好的結(jié)合能力，能夠形成穩(wěn)定的復(fù)合結(jié)構(gòu)，故推測(cè)這兩個(gè)靶點(diǎn)和化合物可能在金雞膠囊治療PID 過程中起主要作用。

GO 富集分析表明金雞膠囊治療PID 參與了細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和腺體發(fā)育、對(duì)活性氧的反應(yīng)以及一氧化氮合酶活性的調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn)，低至中等活性氧的濃度可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)來發(fā)揮其作用，能夠?qū)ιL(zhǎng)因子的刺激做出反應(yīng)以及控制炎癥的發(fā)生[29]。NO 作為體內(nèi)急性和慢性炎癥疾病的重要調(diào)節(jié)劑之一，調(diào)節(jié)一氧化氮合酶活性是生物體內(nèi)非常重要的生物過程之一[30]。KEGG 富集分析表明金雞膠囊治療PID 的作用機(jī)制與HIF-1 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、JAK-STAT 信號(hào)通路、C 型凝集素受體信號(hào)通路等炎癥信號(hào)通路有關(guān)。結(jié)合文獻(xiàn)[31]可知，PID 現(xiàn)代發(fā)病機(jī)制與炎癥免疫反應(yīng)、氧自由基、性激素、細(xì)胞凋亡機(jī)制和血液流變等有很大的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)HIF-1 能夠參與自身免疫疾病的發(fā)生和發(fā)展，比如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和強(qiáng)直性脊柱炎等[32]。其中HIF-1α 是該信號(hào)通路中的關(guān)鍵靶基因，在缺氧狀態(tài)下能夠廣泛的存在機(jī)體內(nèi)，研究發(fā)現(xiàn)該基因均可在免疫性炎癥疾病中、細(xì)菌性和病毒性感染和脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞代謝等炎癥性疾病中檢測(cè)到[33]。PI3K-Akt 信號(hào)通路是體內(nèi)重要通路之一，研究發(fā)現(xiàn)，通過下調(diào)PI3K-p110 蛋白水平的表達(dá)，可以降低PI3K-p85 和AKT 磷酸化水平，抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中的PI3K-Akt 信號(hào)通路的活化，起到抗炎的作用[34]。JAK-STAT 信號(hào)通路是機(jī)體內(nèi)非常重要的信號(hào)通路之一，在促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生中起著關(guān)鍵作用[35]。C 型凝集素受體（CLRs）是一大類蛋白質(zhì)超家族，可以產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，觸發(fā)對(duì)病原體的先天性和適應(yīng)性免疫，從而起到抗真菌的作用[36]。

綜上所述，本研究通過運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)金雞膠囊治療PID 的活性成分和作用機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果表明金雞膠囊通過作用于多靶點(diǎn)、多條通路治療PID，為金雞膠囊治療PID 作用機(jī)制提出了一定的參考依據(jù)。