阮 明，肖友平，黃從軍，范 凱，婁 強

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550003）

在中老年男性中經(jīng)常因為前列腺增生導(dǎo)致排尿功能障礙，其臨床癥狀包括尿頻、尿急、排尿不暢，甚至發(fā)生尿潴留等，上述這些癥狀常常對患者的生活質(zhì)量造成嚴重的影響，那么如何改善患者的臨床癥狀，提升患者的生活質(zhì)量，是目前研究的熱點之一，α 受體阻滯劑和5α 還原酶抑制劑是治療前列腺增生的一線用藥，但二者皆存在治療效果有限，且有一定副作用的不足[1]。中藥性質(zhì)溫和、靶點廣泛、副作用小，而中藥復(fù)方具有多組分協(xié)同、系統(tǒng)調(diào)控的特點[2]，已被越來越多的患者所認可及接受，然而其成分復(fù)雜，作用機制尚不清楚。本課題的研究旨在通過動物實驗的方式，觀察益氣活血方對前列腺增生模型大鼠前列腺增生組織中Bax 基因表達的影響，探究其治療良性前列腺增生的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD 大鼠90 只，10～12 周齡，體重在180～220g 之間，由中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)提供，許可證號：SCXK-（軍）2012-0011，本實驗獲得貴州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準，倫理批準號：KY2019098，符合中國倫理委員會指導(dǎo)原則。實驗開始前先進行適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。在養(yǎng)殖期間，確保室內(nèi)溫度在22～26℃之間，空氣濕度保持在40% ～60% 之間，并提供為期12 小時的光照時間，實驗動物可以自由進食和飲水。

1.2 主要藥物及試劑

丙 酸 睪 酮 注 射 液（ 規(guī) 格1mL、25mg 批 號：100602）由上海通用醫(yī)藥股份有限公司提供；非那雄胺片（規(guī)格5mg/ 片批號：II021224）由杭州默沙東制藥有限公司提供；益氣活血中藥顆粒劑由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院顆粒藥房提供，中藥藥物組成（黃芪30g、桃仁20g、桂枝15g、茯苓15g、丹皮15g、川牛膝15g、荔枝核10g、肉桂6g），共126g，每126g 生藥制成顆粒劑后重量為10.29g。

1.3 主要實驗材料與儀器

HE 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號20180622）、BAX 試劑盒（福州邁新生物科技有限 公 司， 批 號MAB02-54）、OLYMPUS 生 物 顯 微鏡（北京瑞科中意科技有限公司，DXS1000）、電子分析天平（上海贊維衡器有限公司，ZA120R4）、帆船牌載玻片（北京盛坤海利科技發(fā)展有限公司，25.4mm×76.2mm），組織包埋盒、（江蘇世泰實驗設(shè)備有限公司，31050102W）。

1.4 實驗方法

（1）分組與造模：前列腺增生模型大鼠的造模方式參照已發(fā)表文獻[3]，對90 只健康、雄性性成熟的SD 鼠進行隨機數(shù)字表法分組，其中空白組15 只，實驗組75 只，空白組每只大鼠每天用2mL 橄欖油皮下注射，實驗組大鼠每天皮下注射丙酸睪酮（5mg/kg，溶2mL 橄欖油），連續(xù)給藥28 天。

（2）干預(yù)方法：造模完成后，采用隨機數(shù)字表法將實驗組的75 只前列腺增生模型大鼠分為模型組、非那雄胺組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組5 個組，其中空白組和模型組大鼠接受的是每天5mL 的生理鹽水灌胃，而非那雄胺組實驗動物給予8mg/kg 的非那雄胺灌胃每天一次（溶解于5mL 的生理鹽水之中）。對中藥低、中、高劑量組大鼠分別給予中藥0.85g/kg、1.7g/kg、2.55g/kg，使其溶于5mL生理鹽水，連服28 天。

（3）觀察指標：連續(xù)給藥28 天后，大鼠禁食24h 后，脫頸處死，重新稱重，迅速打開腹腔取出前列腺，將周圍多余組織剔除，表面的水分用吸水紙吸干即可，每一組大鼠的前列腺組織進行HE 染色，觀察其組織病理形態(tài)，利用免疫組化技術(shù)，測定每組大鼠前列腺組織內(nèi)Bax 蛋白的表達程度。

前列腺組織HE 染色：先取前列腺組織的一部分切片，浸泡在蒸餾水中一段時間，再用蘇木素水溶液浸染幾分鐘，最后用酸水和氨水進行顏色分離。將試樣水洗1h 后，再放入蒸餾水中浸泡數(shù)秒，再用70%和90% 的乙醇各脫水10min，接下來對樣品進行酒精伊紅染色處理，時間為2～3min，然后再進行漸變乙醇脫水，二甲苯（Dialene）透明處理，將材料周圍多余的液體清除，加入適量的中性樹膠，蓋玻片覆蓋，最后在生物顯微鏡下觀察其前列腺組織的病理形態(tài)。

免疫組化法檢測Bax 蛋白表達：用4% 以上的多聚甲醛溶液固定剩余前列腺組織20h，再經(jīng)過脫水處理，用石蠟包裹埋藏，最終組織切片，遵照檢測試劑盒的說明，在清洗樣品的過程中加入抗磷酸鹽緩沖液（PBS），再加入二抗體，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，后復(fù)染蘇木素，二甲苯透明后中性樹膠封片，生物顯微鏡下觀察其陽性情況（見圖1），Bax 的陽性顆粒通常在前列腺上皮細胞的細胞質(zhì)中表達，陽性顆粒通常呈黃色或棕黃色。我們采用IMAGE 技術(shù)，結(jié)合J 圖像分析軟件，對每組大鼠的Bax 蛋白質(zhì)進行平均光密度檢測。

圖1 益氣活血中藥對模型大鼠前列腺組織病理形態(tài)學(xué)的影響（HE，×400）

圖2 各組前列腺組織中Bax 蛋白的表達情況(×400）

（4）統(tǒng)計方法：本研究所采用的統(tǒng)計方法是利用SPSS23.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，獲取有關(guān)統(tǒng)計信息。對于測量資料，若符合正態(tài)分布，則采用單因素方差分析；如果不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗分析，P＜0.05 則提示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 益氣活血方對前列腺增生模型大鼠前列腺組織病理的影響

由圖1 可見，空白組前列腺腺體及細胞排列整齊有序，呈大小一致的單層矮柱狀，在顯微鏡下觀察腺腔內(nèi)未見擴張，腺體內(nèi)腺上皮細胞向腺腔突出、排列緊密有序、表面光滑、未見明顯分泌物。核內(nèi)核仁呈暗色，著色較深；模型組前列腺腺體緊密聚積，腺腔擴張，腺體上皮細胞向內(nèi)突出呈乳頭狀或鋸齒狀，表現(xiàn)為復(fù)層或假復(fù)層排列，間質(zhì)和小血管水腫，同時分泌物增多；中藥治療組光鏡可見腺體增生不明顯，腺體排列較整齊，小部分腺體細胞腺腔變大，但腺腔基本光滑，腺上皮細胞大多呈單層柱狀排列，僅有少量腺上皮細胞突入腔內(nèi)，間質(zhì)和血管擴張充血水腫較輕。

2.2 益氣活血方對前列腺增殖模型大鼠前列腺Bax 蛋白的影響

模型組Bax 和空白組相比較（P＜0.05），說明本實驗成功復(fù)制了前列腺增生模型，同時模型組Bax光密度值明顯低于空白組，說明在前列腺增生時Bax作為細胞凋亡促進基因很難發(fā)揮其作用。非那雄胺組及中藥高劑量組其Bax 平均灰度值與模型組相比較（P＜0.05），中藥高劑量組與非那雄胺組相比較說明兩藥效果相當（見表1）。

表1 各實驗組前列腺組織中Bax 蛋白的表達水平（± s)

表1 各實驗組前列腺組織中Bax 蛋白的表達水平（± s)

注：* 與空白組比較P ＜0.05 ；Δ 與前列腺增生模型組比較P ＜0.05 ：# 與非那雄胺組比較P ＜0.05。

組別 數(shù)量（n） 光密度值（IU）空白組 15 0.2113±0.02355前列腺增生模型組 15 0.1115±0.00644*非那雄胺組 15 0.1770±0.00795*Δ中藥低劑量組 15 0.1277±0.00444*Δ#中藥中劑量組 15 0.1301±0.00802*Δ#中藥高劑量組 15 0.1756±0.00846*Δ

3 討論

前列腺增生屬于中醫(yī)“癃閉”“精癃”范疇，早在2000 年前的《黃帝內(nèi)經(jīng)》就有關(guān)于“癃閉”的論述，后世醫(yī)家不斷總結(jié)，提出“小便不暢，點滴短少，病情較緩者為癃；排尿困難，點滴不通，病情較急者為閉”。中醫(yī)學(xué)指出，癃閉的病因在于腎氣虧虛，導(dǎo)致膀胱氣化失司，同時還伴隨著血瘀、濕熱、氣滯等病理因素[4-5]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)家對該疾病的認知逐漸加深，他們更加強調(diào)了“精氣奪則虛”的觀點，即腎虛血瘀是導(dǎo)致該疾病發(fā)生的根本原因。因此，益氣利水、活血化瘀是治療癃閉的基本方法，通過疏通積聚、通暢水道，可以使癃閉的臨床癥狀得到很大的緩解[6]。采用益氣活血、清熱利濕的療法，可有效降低前列腺指數(shù)，從而促進增生的前列腺萎縮[7]，同時還可以改善患者排尿困難等癥狀。桂枝茯苓丸出自《金匱要略·婦女妊娠病脈證并治》，起初用來治療婦女宿有血塊、瘀血經(jīng)閉、月經(jīng)腹痛、產(chǎn)后惡露不暢等癥，能活血、化瘀、消腫。近年來，大量的臨床研究表明，桂枝茯苓丸在治療良性前列腺增生方面具有顯著的療效[8-10]，貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科長期從事前列腺增生的研究工作，并在桂枝茯苓丸原方的基礎(chǔ)上進行加減，從而形成自己的協(xié)定方，命名為“益氣活血方”。近年來，細胞凋亡的研究在前列腺增生癥的發(fā)病過程中逐步深入，Bax 蛋白、Caspase-3 酶和Bcl-2 蛋白在細胞凋亡過程中的不平衡相互作用是一個非常重要的因素[11]，這些因素參與了增殖分化期的調(diào)節(jié)與控制，而最終導(dǎo)致細胞死亡或壞死。Bax 和Bcl-2 的表達動態(tài)平衡對于維持前列腺組織形態(tài)的正常，以及在前列腺增生的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后方面扮演著至關(guān)重要的角色[12]。在前列腺增生的過程中，Bax基因的表達水平顯著降低，這是由于其在促進細胞凋亡方面的作用受到了抑制。在本次實驗中，模型組的Bax 表達水平顯著低于其他組，這表明Bax 基因在促進前列腺腺體增生時的細胞凋亡作用明顯減弱。在正常組織中，Bax 基因的表達量顯著高于其他組，這表明只有當Bax 的表達量達到較高水平時，才能維持組織細胞的正常新陳代謝。通過治療后非那雄胺組、中藥高劑量組和模型組相比較，其Bax 表達水平明顯升高，說明非那雄胺及益氣活血方均能增加Bax 的表達，促進前列腺細胞的凋亡，抑制前列腺腺體增殖，進而對前列腺增生起到治療作用。

綜上所述，本研究以益氣活血為法則，遴選出黃芪、桃仁、桂枝等8 味中藥對前列腺增生模型大鼠進行治療，并從組織病理形態(tài)，以及對Bax 基因表達等方面進行研究，證實了益氣活血中藥對前列腺增生具有良好的治療作用。同時也進一步證實細胞凋亡在前列腺增生的發(fā)病過程中起著重要的作用，益氣活血法對前列腺增生的治療是通過調(diào)節(jié)凋亡抑制基因及凋亡促進基因的表達從而發(fā)揮其治療作用的，為中藥治療前列腺增生提供了新的依據(jù)。