焦云琦, 徐丹亞, 梅 潔, 馬 慧, 劉鳳蘭, 孔令明

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院1,烏魯木齊 830000)(新疆林科院經(jīng)濟林研究所2,烏魯木齊 830000)

結(jié)構(gòu)脂是在油脂代謝及營養(yǎng)學(xué)研究的基礎(chǔ)上開發(fā)的一類新型油脂,通過改變甘油三酯的骨架上脂肪酸的組成和位置的分布,可以將有特殊的營養(yǎng)功能或生理功能的脂肪酸結(jié)合到指定位置,充分發(fā)揮其營養(yǎng)功能和生理功能[1-5]。中長鏈結(jié)構(gòu)脂一方面通過中鏈脂肪酸提供機體所需的能量,另一方面通過長鏈脂肪酸為機體提供營養(yǎng)。目前已有以芝麻油、花生油、菜籽油、金槍魚油和大豆油、玉米油等為原料生產(chǎn)結(jié)構(gòu)脂[6-13],而以核桃油為原料的研究相對較少,并且目前大部分研究關(guān)注結(jié)構(gòu)脂的功能特性,忽略了其原料油脂本身的營養(yǎng)特性,對結(jié)構(gòu)脂制備的原料油脂的篩選研究較少。核桃油是一種高營養(yǎng)的食用油,不飽和脂肪酸含量極高且有較好的油酸比例,適合人體吸收。除此之外,還含有豐富的微量成分如維生素、磷脂等,具備多種生物活性,如健腦、消除炎癥、改善Ⅱ型糖尿病患者的脂質(zhì)狀況等[14-16]。因此,以核桃油為原料制備核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂對于提高結(jié)構(gòu)脂的營養(yǎng)功能及生理功能有重要意義。

以核桃油為原料油,加入辛酸并利用固定化脂肪酶Lipozyme TL IM 進行催化,發(fā)生酸解反應(yīng),將核桃油轉(zhuǎn)化為核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂,通過單因素實驗對核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂的影響,并進行響應(yīng)面優(yōu)化核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂的制備,從而獲得核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與主要試劑

核桃油:實驗室以新疆溫185品質(zhì)核桃為原料壓榨而成;固定化脂肪酶Lipozyme TL IM,固定化脂肪酶Lipozyme RM IM,固定化脂肪酶Novozym 435,購自諾維信公司;正辛酸,冰乙酸,三氯甲烷,韋氏試劑,環(huán)己烷,硫代硫酸鈉標(biāo)液。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

TDL-5-A離心機,PL203電子天平,恒溫水浴搖床,氣相色譜儀Aglient 7890。

1.2 實驗方法

1.2.1 核桃油與辛酸的酸解反應(yīng)單因素實驗

將核桃油與辛酸以一定比例的底物摩爾比混合,并加入一定量脂肪酶完全融合后,在無溶劑體系中,一定溫度條件下密閉振蕩反應(yīng)一段時間,反應(yīng)結(jié)束后在4 500 r/min條件下離心15 min除去脂肪酶,得到核桃油結(jié)構(gòu)脂。采用單因素實驗探究底物摩爾比辛酸∶核桃油(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1和5∶1),酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)(8%～16%),不同的反應(yīng)時間(6～12 h),不同的反應(yīng)溫度(35～75 ℃)對于核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂中辛酸插入率[17-20]的影響。

1.2.2 酸解法合成-辛酸結(jié)構(gòu)脂響應(yīng)面優(yōu)化實驗

運用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計法,在單因素實驗基礎(chǔ)上,每個因素選取 3 個水平,以底物摩爾比(A)、加酶量(B)、反應(yīng)時間(C)、反應(yīng)溫度(D)3個因素為考察對象,以辛酸插入率為參考值Y,建立酶催化核桃油與辛酸酸解反應(yīng)的二次回歸數(shù)學(xué)模型。

1.3 核桃油甲酯化

稱取 50 uL 核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂樣品于 15 mL試管中,加 0.3 mL的乙醚與0.7 mL的正己烷溶解油樣,再用移液槍加入1.0 mL甲醇溶液,加入甲醇-氫氧化鉀溶液10 mL與油樣混勻,再加入 2.0 mL飽和氯化鈉水溶液,渦旋振蕩混勻,靜置 20 min使其分層。在 3 000 r/min離心 5 min,吸取上層清液用于GC分析。

1.4 氣相色譜檢測條件

色譜柱:HP-88 毛細管柱(100 m×0.25 mm;膜厚 0.25 μm);檢測器為氫火焰離子化檢測器(FID),進樣口的溫度設(shè)置為 260 ℃,檢測器溫度設(shè)置為 280 ℃。升溫程序:120 ℃保持 1 min,然后以 20 ℃/min升溫至 175 ℃并保持 10 min,最后以 1 ℃/min升至200 ℃保持 10 min。載氣為氫氣(純度>99.9%);進樣量 1 μL,分流比為 50∶1。氮氣流速:30 mL/min,空氣流速 400 mL/min,氫氣流速 40 mL/min。

1.5 理化性質(zhì)的測定

過氧化值參考GB 5009.227—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中過氧化值的測定》。

碘值參考GB/T 5532—2008《動植物油脂碘值的測定》。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃油總脂肪酸組成與含量

核桃油在甲酯化法處理后經(jīng)過氣相色譜測定,對混合脂肪酸甲酯進行定性和定量分析,對核桃油的營養(yǎng)價值進行科學(xué)評價,根據(jù)氣相色譜圖譜核桃油脂肪酸組成含量如表1所示。

表1 核桃油總脂肪酸組成

從表1可以看出,核桃油中各脂肪酸甲酯分離情況較好,雜峰比較少,對比37種脂肪酸甲酯混標(biāo)與樣品的保留時間進行定性,發(fā)現(xiàn)在核桃油中得到6種脂肪酸甲酯混合物。核桃油中的脂肪酸組成與含量,其中含有6種脂肪酸分別是棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸,主要以不飽和脂肪酸為主,不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為89.83%,其中單不飽和脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.13%,多不飽和脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70.69%,與前人的研究結(jié)果基本一致[17,21]。

2.2 酸解法制備核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂單因素實驗結(jié)果分析

2.2.1 酶的種類對核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂脂肪酸種類及含量的影響

為篩選出通過無溶劑體系能夠?qū)⑿了嶙畲蟪潭扰c核桃油結(jié)合的固定化脂肪酶,選用商業(yè)固定化脂肪酶 Novozym 435、Lipozyme TL IM、Lipozyme RM IM 進行實驗,考察其對核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂合成的催化活性。不同酶進行酸解反應(yīng)核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂的脂肪酸組成及含量對比如表2所示。

表2 不同酶進行酸解反應(yīng)核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂的脂肪酸組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%

表2可知,通過酸解反應(yīng),不同的脂肪酶作為催化劑對核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂中脂肪酸組成有不同的影響,當(dāng)脂肪酶 Lipozyme TL IM 和脂肪酶 Lipozyme RM IM 參與反應(yīng)時,核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂的脂肪酸種類相較于核桃油發(fā)生了變化,增加了辛酸及少量羊蠟酸,而當(dāng)脂肪酶Novozym 435參與反應(yīng)時,脂肪酸種類增加了辛酸及二十碳烯酸,辛酸的插入量相較于其他2種固定化脂肪酶低。辛酸插入率從高到低的順序為:脂肪酶 Lipozyme TL IM>脂肪酶 Lipozyme RM IM>脂肪酶Novozym 435,范圍從2.02%到27.88%。從成本及辛酸插入率兩個方面考慮,最終選擇脂肪酶 Lipozyme TL IM作為后續(xù)的反應(yīng)催化劑,與前人研究結(jié)果一致[18,19,22,23]。

過氧化值越高說明油脂酸敗程度越高,核桃油本身的過氧化值符合GB/T 22327—2008 核桃油的要求。由圖1可知,使用不同種類的脂肪酶都對核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂的過氧化值有一定的影響,并且使用脂肪酶Lipozyme TL IM 作為催化劑時,其過氧化值最低,說明其油脂酸敗的程度最低。

圖1 不同脂肪酶對核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂的碘值及過氧化值的影響

由圖2可以看出,使用脂肪酶Lipozyme TL IM 、脂肪酶Lipozyme RM IM 和Novozym 435這3種酶作為催化劑時,其碘值相差不大。碘值越高說明油脂的不飽和程度越高,結(jié)合表3,相較于核桃油,核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂中的不飽和脂肪酸含量降低,總脂肪酸組成及含量發(fā)生了變化,同時也反映出核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂較純核桃油具有更高的氧化穩(wěn)定性。

圖2 不同底物摩爾比對核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂的辛酸插入率及碘值的影響

表3 響應(yīng)面實驗因素水平表

2.2.2 底物摩爾比對核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂的辛酸插入率及碘值的影響

由圖2可知,在底物摩爾比為1∶1時,辛酸插入率較低,酸解反應(yīng)不完全,可能是由于提供的?；w較少,隨著底物摩爾比的增加,辛酸插入率逐漸增加。當(dāng)?shù)孜锬柋仍黾拥?∶1時,辛酸插入率達到最高,碘值最低;這是因為在脂肪酸比例相對較低,隨著脂肪酸供體比例的增加,辛酸的插入率也在提高。進一步增加摩爾比到4∶1和5∶1,辛酸插入率并沒有因為辛酸含量的增加而繼續(xù)增加,反而略微下降,而碘值則呈一定的上升趨勢,可能是由于適當(dāng)?shù)牡孜锬柋扔欣诜磻?yīng)平衡并增加底物和催化劑之間的碰撞比例。較高比例的底物摩爾比對于核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂的合成無益[20,24],結(jié)合經(jīng)濟角度考慮,選擇摩爾比3∶1作為最佳底物摩爾比,與前人的研究結(jié)果一致[21,25]。

2.2.3 酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂的辛酸插入率的影響

在底物足夠,其他條件固定的條件下,反應(yīng)系統(tǒng)中不含有抑制酶活性的物質(zhì)及其他不利于酶發(fā)揮作用的因素時,酶促反應(yīng)的速度與酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)成正比。

由圖3可知,隨著酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,辛酸插入率逐漸增加,碘值逐漸下降,這表示出核桃油-辛酸的飽和脂肪酸含量在不斷的增加;但當(dāng)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過10%以后呈現(xiàn)平緩下降的趨勢,由于當(dāng)酶相對于底物的切點過多時,過高的酶濃度導(dǎo)致酶分子之間的競爭抑制[22,26],引起辛酸插入率的下降。過高的酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對核桃油-辛酸的合成無益[23,27],結(jié)合辛酸插入率以及經(jīng)濟角度考慮,選擇酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%作為最佳酶質(zhì)量分?jǐn)?shù),與前人研究結(jié)果一致[23,24,27,28]。

圖3 酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂的辛酸插入率的影響

2.2.4 反應(yīng)溫度對核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂的辛酸插入率的影響

酶促反應(yīng)在一定溫度范圍內(nèi)反應(yīng)速度隨溫度的升高而加快;但當(dāng)溫度升高到一定限度時,酶促反應(yīng)速度不僅不再加快反而隨著溫度的升高而下降。

圖4可知,隨著反應(yīng)溫度的增加,辛酸插入率呈上升的趨勢,當(dāng)溫度為45 ℃時,辛酸插入率最大,達到27.37%;當(dāng)溫度超過45 ℃時,辛酸插入率逐漸下降,當(dāng)反應(yīng)溫度為75 ℃時,辛酸插入率最低,為16.00%。脂肪酶Lizyome TL IM酶的最適溫度范圍為55～75 ℃,可能是由于反應(yīng)時間較長,導(dǎo)致酶的最適溫度下降,適當(dāng)?shù)靥岣邷囟?有助于提高酶的活性和加快反應(yīng)的速度,而過高的溫度使酶活性降低,從而減緩反應(yīng)的速度,因此,選擇45 ℃為后續(xù)的反應(yīng)溫度,與前人研究結(jié)果一致[25,29]。

圖4 反應(yīng)溫度對核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂辛酸插入率及碘值的影響

2.2.5 反應(yīng)時間對核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂的辛酸插入率的影響

由圖5可知,隨著反應(yīng)時間的延長,辛酸插入率逐漸增加,但當(dāng)反應(yīng)時間超過12 h以后,辛酸插入率的含量開始有些下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是隨著反應(yīng)時間的延長,反應(yīng)逐漸達到動態(tài)平衡狀態(tài)[22,26],由此可知,過長的反應(yīng)時間對辛酸插入核桃油的合成無益,結(jié)合辛酸插入率及能源消耗考慮,選擇反應(yīng)時間為12 h作為最佳反應(yīng)時間,與前人研究結(jié)果一致[26,30]。

圖5 反應(yīng)時間對核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂辛酸插入率的影響

2.3 響應(yīng)面實驗結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果,采用 Design-Expert 8.0 軟件,以辛酸插入率為響應(yīng)值,以底物摩爾比、加水量、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度4個因素為自變量,設(shè)計4因素3水平共 29 點的響應(yīng)面實驗(其中 24個析因點,5個中心點)。因子水平編碼見表 5。表3中-1,0,1分別代表因素的低、中、高水平。

2.3.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果與討論

響應(yīng)面實驗結(jié)果與討論如表4所示。

表4 實驗設(shè)計及結(jié)果

2.3.3 回歸模型的顯著性檢驗及方差分析

利用Design-Expert.8.0.6.1軟件對表4數(shù)據(jù)進行分析,得到核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂的辛酸插入率與各因素之間的二次多元回歸擬合方程為:

Y=32.93+2.48A+2.36B+1.48C-0.72D+1.20AB-2.56AC-1.88AD+1.62BC+2.19BD+1.39CD-7.09A2-9.95B2-2.05C2-2.34D2。

2.3.4 響應(yīng)面多因素交互作用分析

底物摩爾比、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)時間及反應(yīng)溫度4個因素對響應(yīng)值的影響顯著性可用F值來評價,F值越大,說明該因素對辛酸插入率的影響越大。由表6可知,F(A)=24.86,F(B)=22.53,F(C)=8.83,F(D)=2.11,辛酸插入率知受各因素影響程度大小依次為底物摩爾比(A)>酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)>反應(yīng)時間(C)>反應(yīng)溫度(D),其中底物摩爾比和酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂的辛酸插入率的影響極顯著(P<0.001),反應(yīng)時間C對核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂的辛酸插入率的影響顯著(P<0.05),但反應(yīng)溫度D對核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂的辛酸插入率的影響不顯著(P>0.05)。由表5可知,交互項AC、AD、BD(P<0.05),表示底物摩爾比與反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度的交互作用對響應(yīng)值的影響顯著、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)與反應(yīng)溫度的交互作用對響應(yīng)值的影響顯著,響應(yīng)面坡度越大,響應(yīng)值對不同條件的變化越敏感。反之,坡度越平緩,對響應(yīng)值的影響越小。

表5 響應(yīng)面回歸模型的顯著性檢驗及方差分析

2.3.5 最佳條件的確定及驗證實驗

根據(jù)響應(yīng)面分析得到核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂的辛酸插入率最佳的酸解條件為:底物摩爾比(辛酸∶核桃油)為3.14∶1,酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.3%,反應(yīng)時間為12.64 h,反應(yīng)溫度為44.79 ℃,在這個條件下,核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂的辛酸插入率可以達到33.53%。考慮到實際操作性上,將實際實驗條件調(diào)整為底物摩爾比(辛酸∶核桃油)為3∶1,酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%,反應(yīng)時間為12.6 h,反應(yīng)溫度為44.8 ℃,在此條件下重復(fù)3次實驗,取平均值得到核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂的辛酸插入率為32.37%,接近軟件優(yōu)化的最大值,因此采用響應(yīng)面分析法得到核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂較高辛酸插入率的最佳制備工藝的條件是可行的。實驗結(jié)果與預(yù)測值結(jié)果相符良好,說明響應(yīng)面模型預(yù)測結(jié)果是有效的。

3 結(jié)論

通過篩選選擇固定化脂肪酶Lipozyme TL IM 制備核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂,通過響應(yīng)面結(jié)果可以得出酸解法制備核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂的最佳條件為底物摩爾比(辛酸∶核桃油)為3∶1,酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%,反應(yīng)時間為12.6 h,反應(yīng)溫度為44.8 ℃,在此條件下,辛酸插入率為32.37%。該條件適于制備核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂,通過對核桃油-辛酸結(jié)構(gòu)脂制備工藝可為新型結(jié)構(gòu)脂的研究與開發(fā)提供參考。