張建明,張德志,舒德斌,田甜,饒軍,蘇巍
(1.中國長江三峽集團有限公司中華鱘研究所,湖北 宜昌 443100;2.三峽工程魚類資源保護湖北省重點實驗室,湖北 宜昌 443100)
長江鱘(Acipenser dabryanus)是我國特有的淡水定居性鱘[1]。過度捕撈、水體污染、棲息地破壞等原因使野生長江鱘資源量急劇下降,已被列為國家Ⅰ級重點保護動物和極瀕危物種[2,3]。目前,主要通過建立禁捕、設立保護區(qū)、人工增殖放流等措施保護長江鱘物種。關(guān)于長江鱘的保護研究主要包括早期發(fā)育、人工繁殖、營養(yǎng)需求及分子生物學等方面[4-8]。近年來,水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)向著規(guī)?;⒓s化迅猛發(fā)展,養(yǎng)殖過程中傳統(tǒng)的抗生素治療方法起到了很好的緩解魚病發(fā)生的作用,但同時導致病原菌耐藥性及難防難治、魚類抗生素依賴性及免疫力下降、藥物殘留及環(huán)境污染等問題,因此,尋找能替代抗生素并促進生長發(fā)育、提高魚體免疫和抗病能力的中草藥成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。
中草藥是我國的瑰寶,具有資源豐富、價格低廉、加工方便、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點[9],能提高魚類增重率,促進魚類生長[10];改善消化吸收功能[11];增強動物免疫機能,提高抗病能力[12];有效抑制病原微生物,保護機體健康[13]。冒樹泉等[9]研究指出,復方中草藥可促進大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus)生長,提高抗氧化能力,其中復方Ⅰ組(板藍根、大黃)和復方Ⅲ組(黃芪、黃柏)效果最佳。路晶晶等[14]研究表明,復方中草藥可顯著提高大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼魚的增重率,降低飼料系數(shù),調(diào)節(jié)血脂,同時顯著提高大菱鲆血清中過氧化物酶活力。邢玉娟等[15]研究結(jié)果顯示,復合中草藥可提高草魚(Ctenopharyngodon idella)白細胞吞噬能力、提高組織溶菌酶(LSZ)及超氧化物歧化酶(SOD)活性。方珍珍等[10]研究顯示,飼料中添加金銀花、黃芪能夠一定程度提高錦鯉(Cyprinus carpio)過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力,增強機體的抗氧化和免疫能力。在飼料中添加復方中草藥改善了閃光鱘(Acipenser stellatus)體內(nèi)部分血液生理生化指標,并初步篩選出了對閃光鱘生長和生化指標具有促進作用的復方中草藥(復方1:貫眾、大青葉、山豆根、桔梗等;復方2:黃芪、茯苓等;復方3:板藍根、大黃等;復方4:紫草、桑葉、金銀花等)[16]。朱莉等[17]研究表明,中草藥復方(首烏、黃芪、甘草)和穿心蓮可顯著促進羅非魚(Oreochromis mossambicus)生長、抗氧化性能。王凡等[18]研究顯示,在飼料中添加復方中草藥可提高虹鱒(Oncorhynchus mykiss)非抗氧化和特異性免疫功能。石和榮等[19]研究表明,復方中草藥添加劑能有效促進虎龍雜交石斑魚(Epinephelus fuscoguttatus♀× E.lanceolatus ♂)生長,具有一定的增強免疫效果。盛竹梅等[20]研究指出,復方中草藥對黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)非特異性免疫機能與抗病力具有增強作用。截至目前,未見中草藥對長江鱘生長和免疫影響的報道。
為篩選對長江鱘具有促進生長、改善免疫指標作用的復方中草藥,本試驗研究了4 種復方中草藥對長江鱘幼魚生長和免疫指標的影響,旨在為長江鱘幼魚養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中中草藥的應用積累基礎數(shù)據(jù)。
2020 年4 月在中國長江三峽集團有限公司中華鱘研究所對人工馴養(yǎng)的長江鱘親魚進行人工催產(chǎn),擠壓腹部獲得成熟卵子和精子,干法授精獲得受精卵,流水孵化獲得長江鱘仔魚,經(jīng)過人工投喂飼養(yǎng)獲得10 月齡長江鱘幼魚,體質(zhì)量(1 000±53)g。2021 年2 月選取魚體完整、健康無傷的長江鱘幼魚開展四種復方中草藥對長江鱘幼魚免疫指標影響的實驗。
試驗所用基礎飼料營養(yǎng)成分:粗蛋白≥43%,粗脂肪≥5.0%,粗纖維≤5%,粗灰分≤18%,鈣2.0%~5.0%,磷1.0%~3.0%,賴氨酸≥2.0%?;A飼料為粉料。試驗所用中草藥均購自湖北省宜昌市益豐大藥房,藥材烘干粉碎后,按照中草藥組方配比混勻,在長江鱘基礎飼料中按設計的添加量添加。中草藥添加劑量參考王凡(2021)[18]、路晶晶(2018)[14]、齊茜(2016)[16]等試驗設計。添加復方中草藥配方及添加量見表1。
試驗在直徑2 m、水深0.6 m 的玻纖缸中采用流水單養(yǎng)14 d。實驗用水為經(jīng)過曝氣和靜止沉淀后的井水。實驗期間水溫16 ℃~18 ℃。每天監(jiān)測養(yǎng)殖水體溶解氧、氨氮、亞硝酸鹽含量等水質(zhì)指標。通過換水、排污,及時清除殘餌和糞便等,保持良好的養(yǎng)殖水環(huán)境(溶解氧>6.0 mg/L、氨氮<0.2 mg/L、亞硝酸氮<0.05 mg/L),每天8:00、12:00、18:00 監(jiān)測并記錄養(yǎng)殖池水溫和溶解氧含量。
實驗分為五組,按照中醫(yī)配伍理論設計4 組復方中草藥配方:A、B、C、D 組分別投喂復方一、二、三和四;E 組不添加中草藥為對照組,每個組10 尾魚,每組兩個重復。實驗前暫養(yǎng)階段五組實驗魚均通過灌服的方式投喂基礎飼料(日投喂量0.5%),7 d 后開始進行正式實驗,按照中草藥投喂量,配置實驗飼料,用水稀釋成糊狀,每天灌服方式投喂一次,連續(xù)投喂14 d,在第7 d 和第14 d 采樣,經(jīng)低溫麻醉后,測量魚體長、體質(zhì)量等生物學指標;從每個試驗組中隨機取魚5 尾,尾靜脈采血,將血液離心(2 500 r/min、15 min),血清樣本置于-80 ℃冰箱待測;試驗結(jié)束后,統(tǒng)計成活率,計算下列指標。
式中,W1、W2 分別為每尾魚實驗初始體質(zhì)量和最終體質(zhì)量(g);S1、S2 分別為實驗魚成活的數(shù)量和總數(shù)量(尾)。
血樣檢測指標包括GHRH、IGF-1、GH、GnRH、IgG、IgM、C3、C4、LZM、抗菌肽、IFN-r。酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司,參照說明書步驟進行指標檢測。
采用Spass25.0 和Excel 統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù),利用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan’s多重比較檢驗復方中草藥對各項指標影響的顯著性,差異的顯著性以P<0.05 為標準,結(jié)果以平均值±標準差(Mean±SD)表示。
由表2 可知,試驗結(jié)束時,復方三組和復方四組試驗魚平均體質(zhì)量顯著高于復方一組、二組及對照組(P<0.05);復方三組和四組試驗魚增重明顯;各試驗組成活率均為100%。
與對照組相比(表3),在試驗第7 d 和第14 d,復方一組、二組生長激素釋放激素(GHRH)含量沒有顯著變化(P>0.05);復方三組在試驗第7 d 生長激素釋放激素(GHRH)含量沒有顯著變化(P>0.05),第14 d 顯著升高(P<0.05);復方四組生長激素釋放激素(GHRH)含量在整個試驗階段持續(xù)上升,具有顯著變化(P<0.05)。
表3 復方中草藥對血清GHRH 的影響Tab.3 Effect of compound Chinese herbal medicine on serum GHRH content單位unit:ng/mL
表4 復方中草藥對血清IGF-1 的影響Tab.4 Effect of compound Chinese herbal medicine on serum IGF-1 content單位unit:ng/mL
與對照組相比,在試驗第7 d,復方二組、三組和四組胰島素樣生長因子1(IGF-1)含量顯著升高(P<0.05);在試驗第14 d,除復方四組胰島素樣生長因子1(IGF-1)含量顯著升高(P<0.05),其他三個試驗組均沒有顯著變化(P>0.05)。
由表5 可知,與對照組相比,在試驗第7 d,復方一組、二組和四組生長激素(GH)含量沒有顯著變化(P>0.05),而復方三組生長激素(GH)含量在試驗第7 d 顯著升高(P<0.05);在試驗第14 d,復方三組和四組生長激素(GH)含量顯著升高(P<0.05)。
表5 復方中草藥對血清GH 的影響Tab.5 Effect of compound Chinese herbal medicine on serum GH content單位unit:ng/mL
由表6 可知,與對照組相比,復方一組、二組、三組在試驗第7 d 和14 d 促性腺激素釋放激素(GnRH)均沒有顯著變化(P>0.05),復方四組在試驗第14 d 促性腺激素釋放激素(GnRH)含量顯著升高(P<0.05)。
表6 復方中草藥對血清GnRH 的影響Tab.6 Effect of compound Chinese herbal medicine on serum GnRH content單位unit:mIU/mL
與對照組相比,在試驗第7 d,各復方組血清IgG 含量沒有顯著變化(P>0.05);在試驗第14 d,復方一組、二組沒有顯著變化(P>0.05),而復方三組、四組顯著升高(P<0.05)。與對照組相比,在試驗第7 d,復方一組和二組血清IgM含量變化不顯著(P>0.05),復方三組和四組血清IgM含量顯著升高(P<0.05);在試驗第14 d,復方一組、二組和三組血清IgM含量變化不顯著(P>0.05),復方四組血清IgM含量顯著升高(P<0.05)(表7)。
表7 復方中草藥對血清IgG 和IgM 的影響Tab.7 Effect of compound Chinese herbal medicine on serum IgG and IgM content單位unit:mg/mL
與對照組相比,在試驗第7 d,各復方組血清C3含量均沒有顯著變化(P>0.05),但復方一組、三組和四組升高;在試驗第14 d,復方三組與四組的C3顯著升高(P<0.05)。與對照組相比,在試驗第7 d,各復方組血清C4 含量均沒有顯著變化(P>0.05),但復方一組、三組和四組升高;在試驗第14 d,復方三組和四組的C4 顯著升高(P<0.05),其他組差異不顯著(表8)。
表8 復方中草藥對血清C3 和C4 的影響Tab.8 Effect of compound Chinese herbal medicine on serum C3 and C4 content單位unit:μg/mL
與對照組相比,在試驗第7 d,復方一組和二組血清溶菌酶活性沒有顯著變化(P>0.05),而復方三組和四組血清溶菌酶活性顯著升高(P<0.05);在試驗第14 d,復方一組血清溶菌酶活性沒有顯著變化(P>0.05),而復方二組、三組和四組血清溶菌酶活性顯著升高(P<0.05)(表9)。
與對照組相比,在試驗第7 d 和第14 d,復方一組和二組血清抗菌肽含量均沒有顯著變化(P>0.05),而復方三組和四組血清抗菌肽含量均顯著升高(P<0.05)(表10)。
與對照組相比,四個復方試驗組在試驗第7 d和第14 d 血清干擾素(IFN-r)含量均沒有顯著變化(P>0.05)(表11)。
表11 復方中草藥對血清IFN-r 的影響Tab.11 The effect of compound Chinese herbal medicine on serum IFN-r content單位unit:pg/mL
中草藥的成分豐富,含有蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、多糖、油脂類以及一些促生長因子,合理運用中草藥之間的關(guān)系,可以有效提高水產(chǎn)動物營養(yǎng)水平、攝食水平、維生素含量、激素含量,提高水產(chǎn)動物的免疫機能和抗氧化、抗應激能力[16,21,22]。魚類的生長受到生長激素、生長激素釋放激素、胰島素樣生長因子和促性腺激素釋放激素等因子的影響。生長激素是由垂體前葉合成和分泌的一種單鏈多肽類激素,其分泌和合成除受到生長激素釋放激素的正調(diào)節(jié)和生長激素抑制激素的負調(diào)節(jié)外,還受到血糖含量、營養(yǎng)狀態(tài)等因素的影響[23]。胰島素樣生長因子是一類促進有絲分裂功能和胰島素樣代謝的多肽類激素,具有促進生長、調(diào)節(jié)滲透壓、促進細胞分裂分化、參與炎癥反應等作用[24]。促性腺激素釋放激素是刺激腦垂體促性腺激素GtH 釋放的主要激素,不僅影響生長激素的釋放,也對其合成具有一定的調(diào)節(jié)作用[25]。本研究中的復方二組、三組和四組對長江鱘幼魚生長激素、生長激素釋放激素、胰島素樣生長因子、促性腺激素釋放激素等因子產(chǎn)生不同程度的影響,其中復方三組和四組對長江鱘幼魚生長指標具有較強的促進作用,尤其以復方四組的作用效果更佳,推測可能復方三組和四組中草藥配伍組合能夠有效激發(fā)長江鱘幼魚生長相關(guān)激素水平的有效提升,促進了長江鱘幼魚的生長激素含量的提高。復方中草藥對試驗魚增重率也驗證復方三組和四組中草藥配伍組合能夠有效促進體重生長。本試驗中各試驗組試驗魚成活率均為100%,表明試驗設計中草藥組方和使用劑量沒有對試驗魚產(chǎn)生負面影響,具有科學性。
本試驗按照中醫(yī)配伍理論設計的4 個組方,其中組方一以黃芪補中益氣升陽固表,扶助正氣提高機體抗逆性為君藥,魚腥草、金銀花為清熱解毒藥,二藥合用祛除邪毒,茯苓配大黃使病邪走水糞道而出,利于排毒,甘草為國老調(diào)和諸藥;組方二以黨參補中益氣,五加皮祛濕補肝腎,二藥相合培元固本,板藍根清熱解毒,大黃涼血解毒、瀉熱通腸、破積行瘀。組方三以金銀花、大青葉、山豆根清熱解毒,強力祛邪為君藥,杏仁止咳平喘潤腸通便,桔梗宣肺利咽排膿,貫眾治濕熱毒瘡;組方四以黨參補中黃芪實表五味子生津固腎,三藥合用使抗逆性增強,山楂健脾消食降脂,黃柏瀉三焦之火,大黃瀉熱通腸、破積行瘀,甘草調(diào)和諸藥,方中有補有瀉,補而不膩,瀉而不虛,陰陽平衡,精神乃治。本試驗設計的四個中草藥復方試驗組,均以提高長江鱘幼魚生長和免疫指標為目的,用藥以溫補祛邪、清熱解毒為主,配伍遵循“相須相使”的原則,試驗研究結(jié)果得出,四個中草藥復方組對提高長江鱘幼魚生長和免疫指標的結(jié)果存在差異。復方三組和四組能夠促進長江鱘幼魚血清生長激素釋放激素(GHRH)、胰島素樣生長因子1(IGF-1)、生長激素(GH)等指標含量的顯著升高,復方二組僅對胰島素樣生長因子1(IGF-1)含量產(chǎn)生影響,復方四組同時對促性腺激素釋放激素(GnRH)含量的升高產(chǎn)生顯著影響,復方一組效果甚微。復方三組和四組明顯提高了長江鱘幼魚血清免疫球蛋白IgG 和IgM、補體C3 和C4、抗菌肽等指標的含量,復方二組、三組和四組能顯著提升血清溶菌酶活性,而復方一組對免疫指標的影響較??;研究結(jié)果提示,復方三組和四組能提高長江鱘幼魚生長和免疫指標。不同中草藥配伍組方對魚類的生長、消化、抗應激、抗氧化、免疫等指標產(chǎn)生的效果存在一定的差異[9,14,26]。本文關(guān)于中草藥對長江鱘幼魚生長和免疫指標的影響研究也得出類似的結(jié)果,這可能與中草藥組方配伍、中草藥產(chǎn)地、試驗條件及方法、試驗魚種類等因素有關(guān),針對不同種類魚的適宜組方及使用方法有待深入研究,以達到中草藥組方的最佳效果。
截止目前,自然界中一共發(fā)現(xiàn)了五類具有免疫功能的球蛋白,即IgG、IgA、IgM、IgE、IgD。真骨魚類血清中只存在一種免疫球蛋白,類似于哺乳動物的IgM;而軟骨魚類血清中存在兩種免疫球蛋白,一種分子量為90 KDa 的免疫球蛋白與人類的IgM 相似,另一種分子量為18 KDa 的免疫球蛋白與人類的IgG 相似[27]。王煜恒等[28]關(guān)于黃芪多糖對雜交鱧(Channa maculate♀×C.argus ♂)免疫影響的研究結(jié)果顯示,在基礎飼料中添加黃芪多糖可顯著提高IgM的含量,提高免疫力和抗病力。本研究中,復方四組中草藥制劑可以顯著提高長江鱘幼魚血清內(nèi)IgM和IgG 含量,提高魚體的特異性免疫能力,表明復方四組的中草藥配伍及配比在長江鱘幼魚免疫球蛋白含量方面具有積極作用。
水生動物的免疫系統(tǒng)發(fā)育不夠完善,甲殼類動物甚至沒有特異性免疫系統(tǒng)。因此水生動物的非特異性免疫系統(tǒng)在抵抗病原體入侵和感染過程中具有至關(guān)重要的作用[29]。非特異性免疫因子主要有:溶菌酶、干擾素、補體、抗菌肽、白細胞介素、趨化因子等,主要功效為抑制病原體繁衍、中和病原菌、增加吞噬細胞的吞噬量[30]。補體系統(tǒng)廣泛參與機體的防御反應及免疫調(diào)節(jié),在魚類免疫體系中具有提高基礎免疫水平、吞噬和降解靶細胞、參與炎癥反應、清除免疫復合物等作用[30,31]。補體C3、C4 是補體系統(tǒng)中的重要組成成分,具有抵御病原體、促進炎癥反應等重要作用[32]。曲木等[33]發(fā)現(xiàn),以添加黨參、黃芪、野菊花的飼料投喂黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco),可顯著提升血清中補體C3、C4 的含量。盛竹梅等[20]發(fā)現(xiàn),用富含復方中草藥(麻黃、苦參、黃芩、五倍子)的飼料可以增強黃顙魚血清中補體C3 和C4的活性。本研究中,投喂復方三組和四組14d,可以顯著提升長江鱘血清中補體C3 和C4 含量,改善魚體免疫力。
溶菌酶是魚體生理防御水平的重要標志和堿性水解酶,能夠破壞細菌、病毒、寄生物等結(jié)構(gòu)[19,34]。血清中溶菌酶活性可以因機體接觸免疫增強劑或抗原性物質(zhì)而上升,測定溶菌酶的活性,可以反映魚體非特異性免疫狀態(tài)[29]。有關(guān)中草藥對魚類溶菌酶活性調(diào)節(jié)的報道很多。邢玉娟等[15]研究發(fā)現(xiàn),投喂中草藥制劑可以提高草魚(Ctenopharyngodon idellus)肝胰臟、血清、鰓中溶菌酶活性。李梅芳等[35]采用黃芪、黃芩等中草藥投喂大黃魚(Pseudosciaena crocea),魚體溶菌酶活性顯著上升。王凡等[18]將紅棗、黃芪和山藥制成復合中草藥飼料,投喂虹鱒(Oncorhynchus mykiss)56 d,明顯提高血清溶菌酶活性。本研究中,復方三組和四組血清溶菌酶活性顯著高于對照組。這表明,飼料中添加以上兩組中草藥制劑可以激活長江鱘的免疫系統(tǒng),隨著投喂時間的延長,溶菌酶活性升高,提高了魚體的非特異性免疫能力。水產(chǎn)動物非特異性免疫系統(tǒng)的重要成份抗菌肽,多存在于皮膚黏液、腸道、血液等組織中,對細菌、病毒、真菌和寄生蟲具有較強的抑制或殺傷作用[36,37]。Peng 等[38]研究表明,尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)5 種抗菌肽中的TP3 和TP4對革蘭氏陰性菌和陽性菌具有抗菌活性。Mu 等[39]報道,大黃魚(Larimichthys crocea)5 種成熟肽純化合成物對革蘭氏陰性菌和陽性菌均具有一定的抗菌活性。晉高偉[40]從鯰(Silurus asotus)體表粘液提取物中分離得到抗菌肽,顯示能有效減緩大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長速度。胡世康等[41]報道,投喂添加抗菌肽的飼料一段時間后,可以提高凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)感染副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)和白斑綜合征的成活率。本研究中,投喂復方三組和四組的長江鱘在試驗期間血清抗菌肽活性呈現(xiàn)不斷上升的趨勢,且與對照組呈現(xiàn)顯著差異性。這表明,投喂以上兩組復方中草藥制劑可以有效提高魚體血清中的抗菌肽含量,在一定的投喂時間內(nèi)投喂時間和抗菌肽含量呈現(xiàn)正相關(guān)。干擾素是一類能夠誘導動物細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白的分泌型細胞因子,可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型干擾素[42]。Ⅱ型干擾素,又稱為IFN-r,能夠促使宿主細胞產(chǎn)生大量的抗病毒蛋白或誘導巨噬細胞產(chǎn)生有毒物質(zhì),此外還可以調(diào)節(jié)T 細胞增殖和分化、介導白細胞聚集,進而促使機體呈現(xiàn)抗病毒狀態(tài)[43]。目前已在斑馬魚(Brachydanio rerio var)、斑點叉尾(Ictalurus punctatus)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、河豚(Tetraodontidae)、青魚(Mylopharyngodon piceus)等多種魚類中克隆得到[44-48]。雖然魚類與哺乳動物γ-干擾素基因同源性相比較低,但免疫應答調(diào)節(jié)和抗病毒方面的作用差異不大。本研究表明,與對照組相比,四個復方試驗組在整個試驗過程中血清γ-干擾素含量無顯著性差異。這可能與γ-干擾素的性質(zhì)相關(guān),γ-干擾素是一種誘生蛋白,上述四組中草藥配方不能作為誘生劑激活其表達,如何利用中草藥激活γ-干擾素的表達需要進一步研究。
結(jié)論
試驗設計的4 種復方中草藥不同程度地影響長江鱘幼魚的生長指標和免疫機能。其中,復方三組(金銀花、杏仁、貫眾、大青葉、山豆根、桔梗)和復方四組(黃芪、黃柏、甘草、山楂、五味子、大黃、黨參)改善了長江鱘幼魚血清生長指標(GHRH、IGF-1、GH 和GnRH)和免疫指標(IgG、IgM、C3、C4、LZM、抗菌肽),表明投喂適宜配方的中草藥添加劑對長江鱘幼魚的生長和免疫指標有顯著促進作用,尤以復方四效果最佳。綜上所述,在飼料中添加適宜配方的復方中草藥能有效改善長江鱘幼魚的免疫和生長指標,促進生長、增強免疫效果。