游小燕，何琦琳，范驍玲，葛良鵬

1.重慶市畜牧科學院，重慶 榮昌 402460；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部養(yǎng)豬科學重點實驗室，重慶 榮昌 402460；3.養(yǎng)豬科學重慶市市級重點實驗室，重慶 榮昌 402460

相對動物模型來說,體外培養(yǎng)的細胞模型排除了遺傳、營養(yǎng)、環(huán)境等因素的影響,實驗結(jié)果重復性好[1-2],還減少了實驗研究對動物模型的依賴[3-4]．自20世紀50年代以來,胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)作為最常用、最有效的添加物,在世界范圍內(nèi)被廣泛應用于體外細胞培養(yǎng)[5]．胎牛血清富含血漿蛋白、多肽、激素、生長因子等活性成分,能改變培養(yǎng)基的黏度、滲透壓、緩沖能力等理化性質(zhì)[6],可促進細胞的生長與增殖[7]．細胞生長的好壞與胎牛血清密切相關,在細胞體外培養(yǎng)過程中,若血清選擇不當,不僅會導致實驗結(jié)果不可用,還造成人力、物力等資源的浪費．

胎牛血清是一種成分復雜的混合物,雖然其組份大部分已知,但仍有部分活性物質(zhì)因濃度低無法檢測或缺乏相關活性物質(zhì)檢測標準等因素至今仍不清楚[8]．目前尚不能通過檢測胎牛血清活性成分組成與含量直接判斷血清質(zhì)量好壞,也沒有標準表明某類型細胞適合什么樣的胎牛血清,特別是不同來源的胎牛血清,其補體、內(nèi)毒素等含量差異較大,會直接影響細胞的生長與死亡,因此不同細胞類別選擇合適的胎牛血清便成為一個重要的問題．本文通過使用不同來源的胎牛血清培養(yǎng)小鼠骨髓瘤細胞(Sp2/0)與豬胎兒成纖維細胞(porcine fetal fibroblasts,PFF),探索細胞系與原代細胞對胎牛血清需求的差異,以期篩選出這兩種細胞的最佳血清,為這兩種細胞模型的研究與應用提供保障．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

Sp2/0購自美國細胞培養(yǎng)物收藏中心(ATCC),PFF來源于重慶市畜牧科學院自制的35胎齡榮昌豬胎兒成纖維細胞．

1.1.2 主要試劑

DMEM(Gibco,10829-018),Advanced RPMI 1640(Gibco,12633-012),GLutaMAX (Gibco,35050-061),NEAA (Gibco,11140-050),Sodium Pyruvate (Gibco,11360-070),Pen Step (Gibco,15140-122),FBS1(賽業(yè),特級胎牛血清),FBS2 (BI,04-002-1C),FBS2-1(BI,04-002-1C,2052257),FBS2-2 (BI,04-002-1C,2053268),FBS2-3(BI,04-002-1C,1826596),0.05%胰酶(Gibco,25300-062)．

1.1.3 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱,Thermo fisher scientifle;倒置熒光顯微鏡,Leica;細胞計數(shù)儀,上海睿鈺生物科技有限公司．

1.2 方法

1.2.1 Sp2/0復蘇及培養(yǎng)

根據(jù)胎牛血清來源分別配制含10%FBS,1mmol/L Sodium Pyruvate,1x GLutaMAX,1x NEAA,1x Pen Step的RPMI1640完全培養(yǎng)基．從液氮中取出Sp2/0,38.5 ℃水浴快速解凍,加入預熱的RPMI1640完全培養(yǎng)基5 mL混勻,5 000 r/min 離心5 min,收集細胞．用1 mL預熱的RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸細胞,將細胞接種至6孔板內(nèi),置于37 ℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．

1.2.2 PFF復蘇及培養(yǎng)

根據(jù)胎牛血清來源和批次分別配制含10%FBS,1mmol/L Sodium Pyruvate,1x GLutaMAX,1x NEAA,1x Pen Step的DMEM完全培養(yǎng)基．從液氮中取出PFF,38.5 ℃水浴快速解凍,加入預熱的DMEM完全培養(yǎng)基5 mL混勻,5 000 r/min 離心5 min,收集細胞．用1 mL預熱的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細胞,將細胞接種至6孔板內(nèi),置于38.5 ℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．

1.2.3 Sp2/0細胞克隆培養(yǎng)

Sp2/0生長至65%融合時,用槍頭輕輕吹打細胞,收集細胞,用1 mL預熱的RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸細胞,并利用細胞計數(shù)儀進行細胞計數(shù),將細胞按100個/孔,接種至6孔板內(nèi),根據(jù)血清來源分為2組,每組3個重復孔,6孔板置于37 ℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．

1.2.4 PFF細胞克隆培養(yǎng)

PFF生長至85%融合時,用0.05%胰酶消化收集細胞,用1 mL預熱的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細胞,并利用細胞計數(shù)儀進行細胞計數(shù),將細胞按500個/孔,接種至6孔板內(nèi),根據(jù)血清來源和批次分別分為2組和3組,每組3個重復孔,6孔板置于38.5 ℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．

1.2.5 細胞克隆觀察與計數(shù)

每天用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況和克隆大小,在細胞接種培養(yǎng)的第7 d,拍照記錄細胞克隆大小,并在顯微鏡下用記號筆圈出細胞克隆,進行細胞克隆計數(shù)．

1.2.6 細胞數(shù)量與活率檢測

在細胞接種培養(yǎng)的第10 d,收集細胞,5 000 r/min 離心5 min,用1 mL溫熱的完全培養(yǎng)基重懸細胞,取20 μL細胞樣本與0.2%的Trypan Blue按1∶1混合,取20 μL混合樣本自動檢測細胞濃度與活率,利用細胞計數(shù)儀檢測細胞濃度,按照公式換算出細胞數(shù)量(N)：

N=D×V

式中,D表示細胞濃度,V表示細胞體積．

1.2.7 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源血清對細胞生長性能的影響

由表1可知,無論采用國產(chǎn)FBS1還是進口FBS2培養(yǎng)Sp2/0,其細胞克隆數(shù)、細胞數(shù)量和細胞活率差異均無統(tǒng)計學意義(p>0.05),但進口FBS2培養(yǎng)的PFF,其細胞克隆數(shù)、細胞數(shù)量和細胞活率顯著高于國產(chǎn)FBS1,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)．

表1 細胞生長性能測定

2.2 不同批次血清對PFF細胞克隆的影響

PFF細胞培養(yǎng)第7 d,通過倒置顯微鏡可以觀察到：每個批次的血清都有細胞克隆出現(xiàn),但FBS2-1的細胞克隆明顯小于其他組(圖1和圖2),且FBS2-1的細胞克隆數(shù)極顯著低于FBS2-2和FBS2-3(p<0.01),FBS2-2培養(yǎng)的細胞克隆數(shù)極顯著低于FBS2-3(p<0.01),但FBS2-2的細胞克隆大．

圖1 培養(yǎng)7 d的細胞克隆

***表示p<0.001,差異有統(tǒng)計學意義．圖2 細胞克隆數(shù)統(tǒng)計圖

2.3 不同批次血清對PFF細胞數(shù)量的影響

PFF細胞培養(yǎng)10 d,消化收集細胞,利用細胞計數(shù)儀檢測細胞濃度,并換算出細胞數(shù)量．由圖3可知,FBS2-1培養(yǎng)的細胞數(shù)量極顯著低于FBS2-2和FBS2-3(p<0.01),FBS2-3培養(yǎng)的細胞數(shù)量極顯著低于FBS2-2(p<0.01)．

2.4 不同批次血清對PFF細胞活率的影響

PFF細胞培養(yǎng)10 d,消化收集細胞,臺盼藍染色,細胞計數(shù)儀檢測細胞活率．由圖4可知,FBS2-1培養(yǎng)的細胞活率僅為37.27%,極顯著低于FBS2-2和FBS2-3(p<0.01);FBS2-2與FBS2-3培養(yǎng)的細胞活率差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)．

***表示p<0.001,差異有統(tǒng)計學意義．圖3 細胞數(shù)量統(tǒng)計圖

***表示p<0.001,差異有統(tǒng)計學意義．圖4 細胞活率統(tǒng)計圖

3 討論與結(jié)論

血清含有人工合成營養(yǎng)液所缺乏的生長激素、生長因子等,為體外細胞培養(yǎng)提供了賴以生存和增殖的物質(zhì)基礎,參與調(diào)控細胞生長、增殖、分化等多種生命活動,被廣泛應用于細胞的體外培養(yǎng)．根據(jù)動物品種不同,血清可分為兔血清、馬血清、牛血清等．牛屬于大動物,血清來源較為豐富,根據(jù)牛日齡的差異,血清又可分為小牛血清、新生牛血清和胎牛血清,其中胎牛因未與外界接觸,病原微生物少,血液中富含促生長因子,免疫球蛋白和補體因子(如γ-球蛋白)等[9-10]．血清中還含有近1 800種蛋白[11-12],4 000余種代謝物[13],且血清有助于提高培養(yǎng)基的pH緩沖能力,減少細胞因移液、吹打、消化等造成的物理損傷[14]．自Puck等[15]將胎牛血清添加到培養(yǎng)基中以來,胎牛血清已廣泛應用于人、動物以及昆蟲的細胞培養(yǎng)．

在本次研究中,無論采用國產(chǎn)還是進口的胎牛血清培養(yǎng)Sp2/0,其細胞克隆數(shù)、細胞數(shù)量和細胞活率差異均無統(tǒng)計學意義(p>0.05)．這與李自良等[16]的研究結(jié)果相類似．究其原因可能是Sp2/0與MDCK同屬細胞系,部分遺傳物質(zhì)已發(fā)生改變,且?guī)в邪┳兊奶攸c,能在體外培養(yǎng)條件下無限制地傳代,對血清的依賴降低,因此能在各類型血清中較好地生長增殖．研究中還發(fā)現(xiàn)：進口胎牛血清培養(yǎng)的豬胎兒成纖維細胞,其細胞克隆數(shù)、細胞數(shù)量和活率均極顯著高于國產(chǎn)胎牛血清(p<0.01)．劉瑞風等[17]利用不同來源胎牛血清培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞,發(fā)現(xiàn)在使用FBS1培養(yǎng)過程中,骨髓間充質(zhì)干細胞逐漸死亡,而FBS2培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞不但能很快貼壁和迅速增殖,而且傳代培養(yǎng)后能保持很強的分裂增殖能力．推測可能是因為豬胎兒成纖維細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞屬于原代細胞,保持了體內(nèi)的生物學特性．因不同來源胎牛血清,其采集方式與生產(chǎn)加工工藝不同,所含促細胞生長因子等活性物質(zhì)的組份與比例也有所不同,導致原代細胞的生長、增殖受血清來源影響較大．

不同來源胎牛血清質(zhì)量差異大,即使同一品牌、同一貨號,因供血動物性別、生理、營養(yǎng)等條件不同,也會存在批次間的差異[18]．本次研究利用豬胎兒成纖維細胞對同一品牌、同一貨號,3個不同批次的胎牛血清進行了測試,結(jié)果顯示：FBS2-1形成的細胞克隆小,且細胞克隆數(shù)極顯著低于FBS2-2和FBS2-3(p<0.01);培養(yǎng)10 d后,FBS2-1的細胞數(shù)量和細胞活率極顯著低于FBS2-2和FBS2-3(p<0.01),雖然FBS2-2的細胞克隆數(shù)極顯著低于FBS2-3(p<0.01),但是FBS2-2的細胞克隆大,且細胞數(shù)量極顯著高于FBS2-3(p<0.01)．本次實驗篩選出FBS2-2是豬胎兒成纖維細胞的最適血清,可大量采購,為豬胎兒成纖維細胞的培養(yǎng)與應用提供物質(zhì)保障．