游小燕，何琦琳，范驍玲，葛良鵬

1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 榮昌 402460；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 榮昌 402460；3.養(yǎng)豬科學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 榮昌 402460

相對(duì)動(dòng)物模型來(lái)說(shuō),體外培養(yǎng)的細(xì)胞模型排除了遺傳、營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境等因素的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好[1-2],還減少了實(shí)驗(yàn)研究對(duì)動(dòng)物模型的依賴[3-4]．自20世紀(jì)50年代以來(lái),胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)作為最常用、最有效的添加物,在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用于體外細(xì)胞培養(yǎng)[5]．胎牛血清富含血漿蛋白、多肽、激素、生長(zhǎng)因子等活性成分,能改變培養(yǎng)基的黏度、滲透壓、緩沖能力等理化性質(zhì)[6],可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖[7]．細(xì)胞生長(zhǎng)的好壞與胎牛血清密切相關(guān),在細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中,若血清選擇不當(dāng),不僅會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可用,還造成人力、物力等資源的浪費(fèi)．

胎牛血清是一種成分復(fù)雜的混合物,雖然其組份大部分已知,但仍有部分活性物質(zhì)因濃度低無(wú)法檢測(cè)或缺乏相關(guān)活性物質(zhì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)等因素至今仍不清楚[8]．目前尚不能通過(guò)檢測(cè)胎牛血清活性成分組成與含量直接判斷血清質(zhì)量好壞,也沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)表明某類型細(xì)胞適合什么樣的胎牛血清,特別是不同來(lái)源的胎牛血清,其補(bǔ)體、內(nèi)毒素等含量差異較大,會(huì)直接影響細(xì)胞的生長(zhǎng)與死亡,因此不同細(xì)胞類別選擇合適的胎牛血清便成為一個(gè)重要的問(wèn)題．本文通過(guò)使用不同來(lái)源的胎牛血清培養(yǎng)小鼠骨髓瘤細(xì)胞(Sp2/0)與豬胎兒成纖維細(xì)胞(porcine fetal fibroblasts,PFF),探索細(xì)胞系與原代細(xì)胞對(duì)胎牛血清需求的差異,以期篩選出這兩種細(xì)胞的最佳血清,為這兩種細(xì)胞模型的研究與應(yīng)用提供保障．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

Sp2/0購(gòu)自美國(guó)細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心(ATCC),PFF來(lái)源于重慶市畜牧科學(xué)院自制的35胎齡榮昌豬胎兒成纖維細(xì)胞．

1.1.2 主要試劑

DMEM(Gibco,10829-018),Advanced RPMI 1640(Gibco,12633-012),GLutaMAX (Gibco,35050-061),NEAA (Gibco,11140-050),Sodium Pyruvate (Gibco,11360-070),Pen Step (Gibco,15140-122),FBS1(賽業(yè),特級(jí)胎牛血清),FBS2 (BI,04-002-1C),FBS2-1(BI,04-002-1C,2052257),FBS2-2 (BI,04-002-1C,2053268),FBS2-3(BI,04-002-1C,1826596),0.05%胰酶(Gibco,25300-062)．

1.1.3 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱,Thermo fisher scientifle;倒置熒光顯微鏡,Leica;細(xì)胞計(jì)數(shù)儀,上海睿鈺生物科技有限公司．

1.2 方法

1.2.1 Sp2/0復(fù)蘇及培養(yǎng)

根據(jù)胎牛血清來(lái)源分別配制含10%FBS,1mmol/L Sodium Pyruvate,1x GLutaMAX,1x NEAA,1x Pen Step的RPMI1640完全培養(yǎng)基．從液氮中取出Sp2/0,38.5 ℃水浴快速解凍,加入預(yù)熱的RPMI1640完全培養(yǎng)基5 mL混勻,5 000 r/min 離心5 min,收集細(xì)胞．用1 mL預(yù)熱的RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,將細(xì)胞接種至6孔板內(nèi),置于37 ℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．

1.2.2 PFF復(fù)蘇及培養(yǎng)

根據(jù)胎牛血清來(lái)源和批次分別配制含10%FBS,1mmol/L Sodium Pyruvate,1x GLutaMAX,1x NEAA,1x Pen Step的DMEM完全培養(yǎng)基．從液氮中取出PFF,38.5 ℃水浴快速解凍,加入預(yù)熱的DMEM完全培養(yǎng)基5 mL混勻,5 000 r/min 離心5 min,收集細(xì)胞．用1 mL預(yù)熱的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,將細(xì)胞接種至6孔板內(nèi),置于38.5 ℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．

1.2.3 Sp2/0細(xì)胞克隆培養(yǎng)

Sp2/0生長(zhǎng)至65%融合時(shí),用槍頭輕輕吹打細(xì)胞,收集細(xì)胞,用1 mL預(yù)熱的RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,并利用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),將細(xì)胞按100個(gè)/孔,接種至6孔板內(nèi),根據(jù)血清來(lái)源分為2組,每組3個(gè)重復(fù)孔,6孔板置于37 ℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．

1.2.4 PFF細(xì)胞克隆培養(yǎng)

PFF生長(zhǎng)至85%融合時(shí),用0.05%胰酶消化收集細(xì)胞,用1 mL預(yù)熱的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,并利用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),將細(xì)胞按500個(gè)/孔,接種至6孔板內(nèi),根據(jù)血清來(lái)源和批次分別分為2組和3組,每組3個(gè)重復(fù)孔,6孔板置于38.5 ℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．

1.2.5 細(xì)胞克隆觀察與計(jì)數(shù)

每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和克隆大小,在細(xì)胞接種培養(yǎng)的第7 d,拍照記錄細(xì)胞克隆大小,并在顯微鏡下用記號(hào)筆圈出細(xì)胞克隆,進(jìn)行細(xì)胞克隆計(jì)數(shù)．

1.2.6 細(xì)胞數(shù)量與活率檢測(cè)

在細(xì)胞接種培養(yǎng)的第10 d,收集細(xì)胞,5 000 r/min 離心5 min,用1 mL溫?zé)岬耐耆囵B(yǎng)基重懸細(xì)胞,取20 μL細(xì)胞樣本與0.2%的Trypan Blue按1∶1混合,取20 μL混合樣本自動(dòng)檢測(cè)細(xì)胞濃度與活率,利用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞濃度,按照公式換算出細(xì)胞數(shù)量(N)：

N=D×V

式中,D表示細(xì)胞濃度,V表示細(xì)胞體積．

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來(lái)源血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)性能的影響

由表1可知,無(wú)論采用國(guó)產(chǎn)FBS1還是進(jìn)口FBS2培養(yǎng)Sp2/0,其細(xì)胞克隆數(shù)、細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05),但進(jìn)口FBS2培養(yǎng)的PFF,其細(xì)胞克隆數(shù)、細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活率顯著高于國(guó)產(chǎn)FBS1,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)．

表1 細(xì)胞生長(zhǎng)性能測(cè)定

2.2 不同批次血清對(duì)PFF細(xì)胞克隆的影響

PFF細(xì)胞培養(yǎng)第7 d,通過(guò)倒置顯微鏡可以觀察到：每個(gè)批次的血清都有細(xì)胞克隆出現(xiàn),但FBS2-1的細(xì)胞克隆明顯小于其他組(圖1和圖2),且FBS2-1的細(xì)胞克隆數(shù)極顯著低于FBS2-2和FBS2-3(p<0.01),FBS2-2培養(yǎng)的細(xì)胞克隆數(shù)極顯著低于FBS2-3(p<0.01),但FBS2-2的細(xì)胞克隆大．

圖1 培養(yǎng)7 d的細(xì)胞克隆

***表示p<0.001,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．圖2 細(xì)胞克隆數(shù)統(tǒng)計(jì)圖

2.3 不同批次血清對(duì)PFF細(xì)胞數(shù)量的影響

PFF細(xì)胞培養(yǎng)10 d,消化收集細(xì)胞,利用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞濃度,并換算出細(xì)胞數(shù)量．由圖3可知,FBS2-1培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量極顯著低于FBS2-2和FBS2-3(p<0.01),FBS2-3培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量極顯著低于FBS2-2(p<0.01)．

2.4 不同批次血清對(duì)PFF細(xì)胞活率的影響

PFF細(xì)胞培養(yǎng)10 d,消化收集細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)染色,細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞活率．由圖4可知,FBS2-1培養(yǎng)的細(xì)胞活率僅為37.27%,極顯著低于FBS2-2和FBS2-3(p<0.01);FBS2-2與FBS2-3培養(yǎng)的細(xì)胞活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)．

***表示p<0.001,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．圖3 細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖

***表示p<0.001,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．圖4 細(xì)胞活率統(tǒng)計(jì)圖

3 討論與結(jié)論

血清含有人工合成營(yíng)養(yǎng)液所缺乏的生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)因子等,為體外細(xì)胞培養(yǎng)提供了賴以生存和增殖的物質(zhì)基礎(chǔ),參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化等多種生命活動(dòng),被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞的體外培養(yǎng)．根據(jù)動(dòng)物品種不同,血清可分為兔血清、馬血清、牛血清等．牛屬于大動(dòng)物,血清來(lái)源較為豐富,根據(jù)牛日齡的差異,血清又可分為小牛血清、新生牛血清和胎牛血清,其中胎牛因未與外界接觸,病原微生物少,血液中富含促生長(zhǎng)因子,免疫球蛋白和補(bǔ)體因子(如γ-球蛋白)等[9-10]．血清中還含有近1 800種蛋白[11-12],4 000余種代謝物[13],且血清有助于提高培養(yǎng)基的pH緩沖能力,減少細(xì)胞因移液、吹打、消化等造成的物理?yè)p傷[14]．自Puck等[15]將胎牛血清添加到培養(yǎng)基中以來(lái),胎牛血清已廣泛應(yīng)用于人、動(dòng)物以及昆蟲的細(xì)胞培養(yǎng)．

在本次研究中,無(wú)論采用國(guó)產(chǎn)還是進(jìn)口的胎牛血清培養(yǎng)Sp2/0,其細(xì)胞克隆數(shù)、細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)．這與李自良等[16]的研究結(jié)果相類似．究其原因可能是Sp2/0與MDCK同屬細(xì)胞系,部分遺傳物質(zhì)已發(fā)生改變,且?guī)в邪┳兊奶攸c(diǎn),能在體外培養(yǎng)條件下無(wú)限制地傳代,對(duì)血清的依賴降低,因此能在各類型血清中較好地生長(zhǎng)增殖．研究中還發(fā)現(xiàn)：進(jìn)口胎牛血清培養(yǎng)的豬胎兒成纖維細(xì)胞,其細(xì)胞克隆數(shù)、細(xì)胞數(shù)量和活率均極顯著高于國(guó)產(chǎn)胎牛血清(p<0.01)．劉瑞風(fēng)等[17]利用不同來(lái)源胎牛血清培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)在使用FBS1培養(yǎng)過(guò)程中,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞逐漸死亡,而FBS2培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不但能很快貼壁和迅速增殖,而且傳代培養(yǎng)后能保持很強(qiáng)的分裂增殖能力．推測(cè)可能是因?yàn)樨i胎兒成纖維細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞屬于原代細(xì)胞,保持了體內(nèi)的生物學(xué)特性．因不同來(lái)源胎牛血清,其采集方式與生產(chǎn)加工工藝不同,所含促細(xì)胞生長(zhǎng)因子等活性物質(zhì)的組份與比例也有所不同,導(dǎo)致原代細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖受血清來(lái)源影響較大．

不同來(lái)源胎牛血清質(zhì)量差異大,即使同一品牌、同一貨號(hào),因供血?jiǎng)游镄詣e、生理、營(yíng)養(yǎng)等條件不同,也會(huì)存在批次間的差異[18]．本次研究利用豬胎兒成纖維細(xì)胞對(duì)同一品牌、同一貨號(hào),3個(gè)不同批次的胎牛血清進(jìn)行了測(cè)試,結(jié)果顯示：FBS2-1形成的細(xì)胞克隆小,且細(xì)胞克隆數(shù)極顯著低于FBS2-2和FBS2-3(p<0.01);培養(yǎng)10 d后,FBS2-1的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活率極顯著低于FBS2-2和FBS2-3(p<0.01),雖然FBS2-2的細(xì)胞克隆數(shù)極顯著低于FBS2-3(p<0.01),但是FBS2-2的細(xì)胞克隆大,且細(xì)胞數(shù)量極顯著高于FBS2-3(p<0.01)．本次實(shí)驗(yàn)篩選出FBS2-2是豬胎兒成纖維細(xì)胞的最適血清,可大量采購(gòu),為豬胎兒成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與應(yīng)用提供物質(zhì)保障．