李忠濤,瞿 良,陶 娜,依南溫

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二〇醫(yī)院：1.醫(yī)學工程科;2.檢驗科,云南 昆明 650032)

目前,國內(nèi)外用于診斷感染性病原體的血培養(yǎng)方法至今仍然是直接從血中檢出病原菌和進行藥敏試驗的“金標準”。但國內(nèi)醫(yī)院血培養(yǎng)系統(tǒng)不同檢測手段的局限性,以及國內(nèi)的研究現(xiàn)狀和軍隊野外駐訓、國際維和、抗震救災(zāi)等突發(fā)事件對感染性血液感染的診療較困難。當前,國內(nèi)醫(yī)院血培養(yǎng)瓶大多數(shù)采用美國BD 公司和法國梅里埃公司生產(chǎn)的全自動血液培養(yǎng)系統(tǒng)配套產(chǎn)品,由于設(shè)備和配套耗材價格昂貴的原因,小醫(yī)院仍然采用傳統(tǒng)手工血培養(yǎng)瓶,采集2次以上血液進行培養(yǎng),導(dǎo)致檢驗試劑成本、人力成本、耗材成本及污染率等升高。據(jù)統(tǒng)計,新生兒血流感染是由于病原體侵入患兒血液所引起的全身感染性疾病,是新生兒死亡的重要原因之一[1]。新生兒復(fù)數(shù)菌血流感染與多方面因素有關(guān),臨床防治應(yīng)從其主要相關(guān)危險因素入手,減少采集血液培養(yǎng)困惑,減少醫(yī)院內(nèi)感染的發(fā)生,合理使用抗菌藥物,關(guān)注早產(chǎn)兒與危重患兒救治是減少新生兒復(fù)數(shù)菌血流感染的主要措施[2]。由于采集的血液被污染的因素有很多種,如住院時間延長、藥物成本增加等,從而引起假陽性血培養(yǎng)率達0.6%～6.0%[3]。受污染的血液培養(yǎng)對就診患者有兩方面的影響：(1)臨床治療時間、療效等;(2)經(jīng)濟方面的支出增加。為有效控制血培養(yǎng)被污染,比較好的方法是監(jiān)測和反饋污染率,如采用干預(yù)方法,污染率大約減少了50%[4]。KELLY等[5]通過研究污染率減少的簡單信息干預(yù)的效果評估發(fā)現(xiàn),干預(yù)前血培養(yǎng)污染率為2.59%,干預(yù)后為2.23%。不同地區(qū)血培養(yǎng)病原菌分布情況的差異可能與不同地區(qū)兒童常見疾病類型、細菌流行種類,以及抗菌藥物的使用種類、強度等有關(guān),這也為該地區(qū)醫(yī)療機構(gòu)合理使用抗菌藥物提供了借鑒[6]。為減少血培養(yǎng)污染,醫(yī)療工作者近年來在這方面做了很多的努力。主觀方面包括防止人員將外源細菌帶入血培養(yǎng)瓶和加強對采血者的培訓;客觀方面包括采用降低陽性血液培養(yǎng)中病原體污染物的方法。本研究旨在實現(xiàn)立足血培養(yǎng)瓶國產(chǎn)化并提高檢驗效率、減少不必要的一些步驟,從而避免污染,降低耗材和人力成本,提升臨床病原微生物診斷的檢驗功效。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1材料 瓶體、培養(yǎng)基、瓶蓋、玻璃紙、紗布、細線等。自制負壓血培養(yǎng)瓶構(gòu)造體包括瓶體和瓶蓋,瓶內(nèi)溫度為-10～65 ℃,濕度為小于或等于85%,壓力為-50～-30 kPa,在瓶口處有包裹瓶口的玻璃紙,玻璃紙外面包裹紗布,瓶內(nèi)有血培養(yǎng)基,容量為30 mL。自制負壓血培養(yǎng)瓶結(jié)構(gòu)示意圖和剖析圖見圖1。

注：A.示意圖;B.剖析圖;1.瓶體;2.培養(yǎng)基;3.瓶蓋;4.玻璃紙;5.紗布;6.細線。

1.1.2血培養(yǎng)基配方 包括胰蛋白胨0.15 g、酪蛋白胨0.45 g、牛肉膏0.09 g、氯化鈉0.15 g、葡萄糖0.01 g、枸櫞酸鈉0.09 g、七水硫酸鎂0.15 g、0.5%對氨基苯甲酸 1 mL、酵母浸液2 mL、酚紅0.4% 0.5 mL、肌醇0.01 g、甘油0.5 mL、非離子活性劑1 mL、鹽酸吡哆醛0.01 g、含鐵的檸檬酸銨0.01 g、磷酸鉀0.03 g、非離子吸附樹脂1.00 g、陽離子交換樹脂1.00 g、精氨酸0.05 g、重碳酸鈉0.03 g等。

1.2方法

1.2.1自制負壓血培養(yǎng)瓶的制備

1.2.1.1準備實驗材料 用醫(yī)院常用的100 mL玻璃輸液瓶,瓶子和瓶蓋清洗干凈,高溫121 ℃消毒5 min后備用。

1.2.1.2實驗方法 (1)除對氨基苯甲酸、硫酸鎂、酚紅外所有血培養(yǎng)基的配方物質(zhì)均稱好,煮化充分溶解后調(diào)整pH為7.4±0.5;加酚紅前必須調(diào)整好pH;(2)在無菌條件下加入硫酸鎂、對氨基苯甲酸;(3)余量為蒸餾水補充至30 mL。血培養(yǎng)基pH為7.4±0.5,121 ℃消毒15 min后備用。

1.2.1.3瓶子制成負壓狀態(tài) 負壓的壓力控制為-50～-30 kPa,用2層玻璃紙包裹后再包裹紗布,用細線固定后制成負壓血培養(yǎng)基。

1.2.2采用本院臨床常見血培養(yǎng)微生物進行留樣驗證 將留樣菌株從-80 ℃低溫冰箱取出后接種于相應(yīng)平板上(血平板、巧克力平板、沙保弱平板),于35 ℃、5%二氧化碳環(huán)境下過夜培養(yǎng),且所有菌株傳代2次以確定為純培養(yǎng)并經(jīng)質(zhì)譜驗證。見表1。

表1 本院臨床常見血培養(yǎng)微生物構(gòu)成情況

1.2.3無菌實驗 參照《中華人民共和國藥典》2005年版的無菌檢查方法[7]。采用薄膜過濾法,將自制負壓血培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基過濾,沖洗(沖洗液為pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液),沖洗量為每張膜400 mL,沖洗50 mL,每次抽干,以大腸埃希菌為陽性對照菌。培養(yǎng)條件為硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基桶30～35 ℃培養(yǎng),真菌培養(yǎng)基23～28 ℃培養(yǎng)。各管置于規(guī)定的溫度培養(yǎng)5 d,逐日記錄結(jié)果。

1.2.4有菌試驗 采用表面菌落計數(shù)法進行有菌試驗,用無菌棉簽將自制負壓血培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基涂抹在營養(yǎng)瓊脂表面,采用平板菌落計數(shù)法統(tǒng)計菌落數(shù)目。根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的現(xiàn)象進行的,也就是說一個菌落即代表一個單細胞。計數(shù)時先將待測樣品進行一系列稀釋,再取一定量的稀釋菌液接種到培養(yǎng)皿中,使其均勻分布于平皿中的培養(yǎng)基內(nèi),經(jīng)培養(yǎng)后由單個細胞生長繁殖形成菌落,即可換算出樣品中的含菌數(shù)。這種計數(shù)法的優(yōu)點是能測出樣品中的活菌數(shù)。

1.2.5性能驗證 根據(jù)中國合格評定國家認可委員會分布的《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則》(CNAS-CLO2 CNAS-CLO2：2012)[8]和《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則在臨床微生物學檢驗領(lǐng)域的應(yīng)用說明》(CNAS-CLO2-A005：2018)[9]中有關(guān)血培養(yǎng)臨床微生物檢驗程序要求進行負壓培養(yǎng)瓶的性能驗證。(1)模擬臨床血流感染患者的細菌含量,挑取留樣菌株單個菌落并用生理鹽水配制成0.5麥氏單位(0.5麥氏單位=1.5×10 CFU/mL)的菌懸液,其理論濃度為1×106～5×106CFU/mL[3];(2)取0.2 mL菌懸液于1.8 mL無菌生理鹽水中10倍稀釋為1×105～5×105CFU/mL,同法繼續(xù)分別稀釋為1×104～5×104、1×103～5× 103、1×102～5×102CFU/mL,以1×102～5×102CFU/mL為最低檢出限;(3)隨機分別取1 mL濃度為1×102～1×105CFU/mL接種于Bactec9120血培養(yǎng)瓶、傳統(tǒng)手工血培養(yǎng)瓶和自制負壓血培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃孵箱,分別按細菌特點進行需氧、厭氧、真菌及苛氧菌培養(yǎng)。

1.2.6臨床驗證 血培養(yǎng)基配方參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第4版進行調(diào)試、消毒、負壓制備等環(huán)節(jié),進行臨床性能驗證實驗。選取本院就診患者210例作為臨床患者血培養(yǎng)標本,選取本院住院患者618例作為比對驗證血培養(yǎng)標本,患者必須簽署本研究知情同意書后建檔,然后進入研究流程。臨床護士根據(jù)醫(yī)生申請檢驗項目,與其他檢驗采集真空管一樣,一次性消毒,逐次采集血樣,包括自制負壓血培養(yǎng)瓶,根據(jù)瓶上標注兒童瓶“5 mL”、成人瓶 “8 mL”刻度進行血量采集。按正常檢驗培養(yǎng)流程進行試驗。

1.3統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示,采用χ2檢驗;3種血培養(yǎng)瓶對不同濃度標準菌株檢出時間比較進行單因素和多因素非條件logistic回歸模型分析,采用相關(guān)系數(shù)(R)表示培養(yǎng)瓶檢出細菌的相關(guān)性。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1無菌試驗結(jié)果 接種陽性對照菌(大腸埃希菌)的培養(yǎng)基呈現(xiàn)生長;自制負壓血培養(yǎng)瓶無細菌和真菌生長。見表2。

表2 無菌試驗結(jié)果

2.23種血培養(yǎng)瓶有菌試驗結(jié)果及最低檢測濃度、最低檢出時間比較 3種血培養(yǎng)瓶有菌試驗及最低檢測濃度見表3。自制負壓血培養(yǎng)瓶在所有菌株的最低濃度級別時均培養(yǎng)出陽性,陽性符合率為100%。3種血培養(yǎng)瓶最低檢出時間比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表3 3種血培養(yǎng)瓶有菌試驗及最低檢測濃度

表4 3種血培養(yǎng)瓶最低檢出時間比較

2.3臨床患者血培養(yǎng)標本檢驗結(jié)果比較 Bactec9120血培養(yǎng)瓶檢出細菌10種,陽性患者28例;傳統(tǒng)手工血培養(yǎng)瓶檢出細菌11種,陽性患者29例;自制負壓血培養(yǎng)瓶檢出細菌10種,陽性患者28例。見表5。

表5 臨床患者血培養(yǎng)標本檢驗結(jié)果比較[n(%),n=210]

2.4比對驗證血培養(yǎng)標本檢驗結(jié)果比較 Bactec9120血培養(yǎng)瓶、傳統(tǒng)手工血培養(yǎng)瓶、自制負壓血培養(yǎng)瓶分別檢出49例(7.93%)、44例(7.12%)、50例(8.09%)。三者陽性率比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表6。

表6 比對驗證血培養(yǎng)標本檢驗結(jié)果比較(n=618)

3 討 論

感染性疾病主要由傳統(tǒng)的、寄生蟲病及各種機會性感染性疾病組成的生物病原體侵入機體引起的疾病[10]。感染性疾病是導(dǎo)致人們身體不健康或亞健康的因素之一[11-13]。血培養(yǎng)是采集患者血液標本并接種到培養(yǎng)瓶中的病原微生物,是診斷菌血癥和真菌血癥的基本方法[14]。血流感染、感染性心內(nèi)膜炎及臨床不明原因感染等疾病的診斷可通過血培養(yǎng)的檢驗技術(shù)來實現(xiàn)[15]。因此,血培養(yǎng)檢驗在血流感染和膿毒癥確診,尤其是在診治中具有舉足輕重的作用[16]。

一般的其他就診患者在住院期間如發(fā)生血流感染會導(dǎo)致住院時間延長、治療費用增加、治療康復(fù)也可能達不到預(yù)期效果[17]。血培養(yǎng)在臨床及時診斷血流感染和用藥方面具有非常重要的指導(dǎo)意義[18]。本研究自制的負壓血培養(yǎng)瓶采集血液時與其他檢驗項目的負壓管一起,一次穿刺,減少二次損傷和降低污染率,在臨床病原微生物檢驗中具有現(xiàn)實的臨床價值,分別接種1×102～1×105CFU/mL金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌3種標準參考質(zhì)控菌株于Bactec9120血培養(yǎng)瓶、傳統(tǒng)手工血培養(yǎng)瓶和自制負壓血培養(yǎng)瓶中進行性能比對實驗,陽性符合率為100%。

對成年人來說,根據(jù)國際慣例,一般的操作是在較短時間內(nèi)連續(xù)采血,采血量為16～30 mL,每瓶血培養(yǎng)需要的血液為8～10 mL[19]。血培養(yǎng)的陽性率與血培養(yǎng)瓶的數(shù)量和采血量頻次等多因素相關(guān)[20]。血培養(yǎng)組合的多次檢出率是與血培養(yǎng)采樣次數(shù)的增加呈一定比例關(guān)系[21],血量為2～30 mL血培養(yǎng)的病原菌陽性率增減與血量增減是一致的[22]。血培養(yǎng)仍然是菌血癥檢驗的“金標準”,而臨床微生物實驗室血培養(yǎng)是用傳統(tǒng)的培養(yǎng)模式,即通過肉眼觀察培養(yǎng)液渾濁、溶血、菌膜及指示劑是否因產(chǎn)酸變色等情況提示有菌生長,從而產(chǎn)生不利因素[23]。因此,需研究生產(chǎn)一種負壓血培養(yǎng)瓶來解決這個問題。本研究對618例臨床患者的3種培養(yǎng)瓶陽性檢出率比較發(fā)現(xiàn),差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這種在血培養(yǎng)技術(shù)中革命性的變革,顯著減輕了實驗室的工作量,并可使血培養(yǎng)報告時間比手工瓶提前。雖然血培養(yǎng)儀有諸多優(yōu)點,是今后的發(fā)展方向,但進口血培養(yǎng)儀及相應(yīng)的血培養(yǎng)瓶價格非常昂貴,目前,國內(nèi)僅部分大醫(yī)院使用,且從國內(nèi)情況看其對需氧菌的檢出效果并不明顯。近年來,國外已證實Bactec、Bact/Alert等市場較廣使用的血培養(yǎng)儀仍存在某些漏檢(主要是銅綠假單胞菌和白色念珠菌等專性需氧菌),且原因至今尚未完全查明。本研究自制的負壓血培養(yǎng)瓶,為提高病原微生物檢驗效率,減少不必要的一些步驟,從而避免污染,降低耗材和人力成本,提升臨床病原微生物診斷檢驗功效,具有重要的臨床價值,值得推廣應(yīng)用。