蔣奕斌,張夢翊,王朋佳,胡 泉,苗 葉,錢 晶,2△

(1.湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院,浙江 湖州 313000;2.浙江省媒介生物學(xué)與病原控制重點實驗室,浙江 湖州 313000)

腎透明細(xì)胞癌(KIRC)是腎細(xì)胞癌中的最常見亞型,是一種源自腎小管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤,占腎惡性腫瘤發(fā)病率的近90%,占成人惡性腫瘤發(fā)病率的近3%[1]。KIRC患者是所有腎細(xì)胞癌患者中預(yù)后最差者,具有高侵襲性和高轉(zhuǎn)移性[2]。由于KIRC缺乏有效的早期診斷方法,大約30%的患者在診斷時已為晚期,由于KIRC對放、化療的天然抵抗力,預(yù)后非常差。目前,對KIRC患者進(jìn)行手術(shù)切除仍是最有效的治療方法[3]。因此,全面了解KIRC的分子機(jī)制并開發(fā)有效的早期檢測方法具有重要意義。

在生物體內(nèi)細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的最常見原因。近年來,基于對細(xì)胞死亡機(jī)制的大量研究,最近提出了新的細(xì)胞死亡機(jī)制——壞死性凋亡。由于大多數(shù)腫瘤固有的抗凋亡作用,誘導(dǎo)其他細(xì)胞死亡,其越來越被認(rèn)為是一種有前途的治療策略[4]。壞死性凋亡是一種獨立于細(xì)胞凋亡的特殊受調(diào)控細(xì)胞壞死,可通過激活腫瘤微環(huán)境(TME)中的RIPK1、3提高CD8+白細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫力。同時,一種壞死性凋亡癌細(xì)胞模擬的納米疫苗可通過刺激NKG2D+和CD8+T淋巴細(xì)胞增殖提高小鼠的抗腫瘤免疫力[2]。有研究表明,壞死性凋亡與腎細(xì)胞癌、卵巢癌、乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展相關(guān)[5]。因此,尋找更多參與壞死性凋亡的生物標(biāo)志物,以理解涉及KIRC壞死性凋亡的相互作用尤為重要。

目前,長非編碼RNA(lncRNA)被認(rèn)為是關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子,并參與多種生物學(xué)過程,包括表觀遺傳重塑、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)、RNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié),以及作為微小RNA海綿的功能等[5]。然而,目前關(guān)于壞死性凋亡相關(guān)(NR)的lncRNA的文獻(xiàn)報道很少見,并且NR lncRNA在KIRC預(yù)后中的作用仍未知。本研究旨在揭示KIRC與NR lncRNA的關(guān)系,并構(gòu)建一個具有預(yù)后意義的與KIRC預(yù)后相關(guān)的NR lncRNA模型。

1 資料與方法

1.1資料來源 從TCGA數(shù)據(jù)庫(https：//portal.gdc.cancer.gov/)中下載539 個KIRC腫瘤樣本和72個正常樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。 同時,剔除臨床數(shù)據(jù)缺失或不完整的樣本。

1.2方法

1.2.1篩選NR lncRNA 使用R語言(4.1.2版)中的“DESeq2”包進(jìn)行差異分析,篩選出在腫瘤樣本和正常樣本中表達(dá)有差異的lncRNA。篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2fold change(FC)|>1.0 和P<0.05。P值經(jīng)假陽性發(fā)生率校正。另外,將67個基因作為NR基因,包括壞死性凋亡基因集M24779.GMT和基因組富集分析(http：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)獲得的8個壞死性凋亡基因。隨后,使用 67個壞死性凋亡基因和差異表達(dá)的lncRNA 進(jìn)行共表達(dá)分析,篩選得到KIRC患者NR lncRNA。 篩選標(biāo)準(zhǔn)為Pearson相關(guān)系數(shù)大于0.8 和P<0.001。

1.2.3分析MYSOLID、LINC02362、MANCR與KIRC患者預(yù)后的關(guān)系 在TCGA的Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA)數(shù)據(jù)庫(http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html)中設(shè)定檢索條件：(1)Single Gene Analysis選項,Enter gene name輸入基因名CLEC16A、LINC02362和MANCR;(2)Dataset選擇 KIRC;(3)在 Survival 欄中選擇Overall Survival;(4)在Datasets Selection(Cancer name)欄中選擇KIRC點擊 Plot。

1.2.4基于3個NR lncRNA的腫瘤分群 使用“clusterplus”R軟件包,依據(jù)風(fēng)險模型中l(wèi)ncRNA的表達(dá)水平確定潛在KIRC的集群,同時,檢驗KIRC對免疫治療的反應(yīng)[7]。 應(yīng)用“RTSNE”R包進(jìn)行主成分分析(PCA)、T分布隨機(jī)鄰域嵌入(t-SNE)和Kaplan-Meier生存分析。另外,使用“GSVA Base”進(jìn)行免疫檢查點分析和計算不同集群KIRC的免疫細(xì)胞浸潤。并區(qū)分冷、熱腫瘤。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用R語言(4.1.2版)和GEPIA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用χ2檢驗和Kaplan-Meier生存分析檢驗NR lncRNA模型,以評估NR lncRNA模型的預(yù)后價值。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1KIRC患者中差異表達(dá)的NR lncRNA 基于67個NR基因得到97個差異表達(dá)的lncRNA,其中13個上調(diào),84個下調(diào)。NR基因(如GATA3和CDKN2A)與lncRNA之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系見圖1。

注：A.KIRC NR lncRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(相關(guān)系數(shù)大于0.8,P<0.001);B、C.97個差異表達(dá)的NR lncRNA的熱圖和火山圖。

2.2模型的構(gòu)建與檢驗 10個NR lncRNA與KIRC患者總生存率相關(guān)(P<0.05)。見圖2A、B。3個與KIRC預(yù)后相關(guān)的NR lncRNA。見圖2C、 D。?；鶊D發(fā)現(xiàn)3個lncRNA均被下調(diào)。見圖2E。高風(fēng)險組有著不良的預(yù)后。見圖3。

注：A.通過單變量Cox回歸分析篩選的預(yù)后NR lncRNA;B.10個預(yù)后NR lncRNA的表達(dá)熱圖;C.10折交叉驗證Lasso模型;D.3個預(yù)后NR lncRNA的Lasso系數(shù)圖;E.壞死凋亡相關(guān)基因和lncRNA關(guān)系的桑基圖。

2.3MYSOLID、LINC02362、MANCR與KIRC患者預(yù)后的關(guān)系 MYSOLID、LINC02362、MANCR低表達(dá)組患者總生存率均明顯高于高表達(dá)組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。低表達(dá)組患者相較于高表達(dá)組具有更高的生存率。見圖4。

圖4 MYSOLID、LINC02362、MANCR與KIRC患者預(yù)后的關(guān)系

2.4區(qū)分冷、熱腫瘤 KIRC 患者重新分組為2個亞型。見圖5A。t-SNE顯示2個亞型可以清楚地區(qū)分。見圖5C。此外,獲得風(fēng)險組和亞型的PCA圖。見圖5E、F。亞型 1患者總生存率高于亞型2,提示預(yù)后較好。見圖5B。亞型1與低風(fēng)險組和高風(fēng)險組均相關(guān),而亞型2幾乎與高風(fēng)險組相關(guān)。見圖5D。亞型2較亞型1具有更高的基質(zhì)、免疫評分。見圖5G～I(xiàn)。亞型2具有更高水平的免疫細(xì)胞浸潤。見圖5J。幾乎所有的免疫檢查點均在亞型2中表現(xiàn)出更多的活性,如 IDO1、PDCD1 和 CD44。見圖5K。因此,將亞型2視為熱腫瘤,亞型1視為冷腫瘤。

注：A.KIRC患者被“ConsensusClusterPlus”R包分為2個亞型;B.Kaplan-Meier生存率分析2個亞型之間的總體生存率;C.2個亞型的t-SNE;D.風(fēng)險評分和亞型關(guān)系的?；鶊D;E、F.KIRC患者風(fēng)險評分和亞型的PCA;G～I(xiàn).TME分析;J.亞型1、2免疫細(xì)胞浸潤的熱圖;K.36個基因檢查點在亞型1、2中的表達(dá)水平。

3 討 論

免疫療法可改善腫瘤患者的預(yù)后,但其只對部分腫瘤有效[7-8]。 由于免疫抑制TME,免疫治療對一些患者無效。GALON等[9]提出了冷、熱腫瘤的概念以增強(qiáng)免疫治療。其是基于免疫的腫瘤分類,而不是傳統(tǒng)的基于癌癥分類,具有高免疫評分的腫瘤通常被稱為“熱”,而具有低免疫評分的非侵入性腫瘤被稱為“冷”?？赏ㄟ^T淋巴細(xì)胞靶向免疫療法、微生物組調(diào)節(jié)或其他免疫藥物治療熱腫瘤。然而,因T淋巴細(xì)胞預(yù)先存在的免疫力無法釋放,這對冷腫瘤來說就很復(fù)雜。CD8+T淋巴細(xì)胞可通過釋放 PRF1、GNLY 或 GZM 等細(xì)胞因子殺死癌細(xì)胞,并作為一種預(yù)先存在的免疫反應(yīng)打破耐受性和通過PD-1/PD-L1免疫抑制軸增強(qiáng)免疫治療。因此,臨床治療中謹(jǐn)慎的做法是將冷腫瘤轉(zhuǎn)化為熱腫瘤,而不是簡單地進(jìn)行其他治療[2]。

本研究確定了3種與KIRC患者預(yù)后相關(guān)的NR lncRNA,并由此構(gòu)建了NR lncRNA模型,對患者進(jìn)行風(fēng)險評分,試圖區(qū)分冷、熱腫瘤。 通過風(fēng)險模型,患者被重新分組為低風(fēng)險組和高風(fēng)險組,并進(jìn)行了多項分析,包括 Kaplan-Meier生存分析和χ2檢驗。有研究表明,分子亞型又稱為集群,與腫瘤免疫抑制和微環(huán)境有關(guān)[10-11]。不同的亞型具有不同的免疫效應(yīng)和 TME評分,進(jìn)而亞型間具有不同的預(yù)后和免疫治療反應(yīng)[12-14]。因此,根據(jù)NR lncRNA模型中l(wèi)ncRNA的表達(dá)將患者分為2個亞型,其具有不同的免疫微環(huán)境。亞型1 具有免疫抑制性,相比之下,亞型2具有更密集的CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤,更活躍的促炎功能,更高的免疫評分及TIM3、LAG3、PD-L1活性。因此,亞型1可歸類為冷腫瘤,亞型2可歸類為熱腫瘤。

此外,本研究在?；鶊D中發(fā)現(xiàn)了一些NR lncRNA,如ZBP1。 MANCR、MYOSLID 均與 CDKN2A相關(guān)。CDKN2A表達(dá)水平與許多腫瘤中的腫瘤突變負(fù)荷及許多腫瘤中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性顯著相關(guān)[15]。指導(dǎo)癌癥和其他疾病治療策略的ZBP與 LINC02362相關(guān),后者也與細(xì)胞凋亡有關(guān),可克服免疫治療失敗,并保持持久的抗腫瘤反應(yīng)[16]。近年來,發(fā)現(xiàn)MANCR在癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力中發(fā)揮重要作用[17],其體外過度表達(dá)在一些研究中與腫瘤發(fā)生有關(guān)[18]。RAB13可能促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)生,而 MYOSLID 刺激微小RNA-1286 以增加RAB13表達(dá)[19]。

本研究與既往利用體外實驗技術(shù)分析研究腫瘤發(fā)生及發(fā)展模式不同,通過在線數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)挖掘分析,減小由于樣本量不足導(dǎo)致的結(jié)果誤差,相關(guān)結(jié)果可作為臨床試驗的前瞻研究與重要補(bǔ)充、指導(dǎo)。但本研究缺乏實驗基礎(chǔ),MYSOLID、LINC02362、MANCR在KIRC發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮的機(jī)制和作用仍需進(jìn)一步驗證。