羅澤偉 武戈 陳摯 鄧馳楠 萬(wàn)蓉 楊濤 莊正飛 陳同生?

1)(華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院,教育部激光生命科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510631)

2)(華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院,廣東省激光生命科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510631)

基于結(jié)構(gòu)光照明(structured illumination,SI) 的超分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移(super resolution fluorescence resonance energy transfer,SR-FRET) 成像技術(shù)(SISR-FRET) 可以通過(guò)解析活細(xì)胞內(nèi)亞衍射區(qū)域的FRET 信號(hào)來(lái)研究細(xì)胞器精細(xì)結(jié)構(gòu)上的分子結(jié)構(gòu)與功能.SISR-FRET 成像中激發(fā)發(fā)射通道切換導(dǎo)致成像速度較慢,限制了SISR-FRET 在快速成像中的應(yīng)用.針對(duì)此問(wèn)題,本文提出一種雙通道結(jié)構(gòu)光照明超分辨定量FRET 成像系統(tǒng)和方法,通過(guò)在成像光路中加入FRET 雙通道成像和配準(zhǔn)模塊,實(shí)現(xiàn)了SISR-FRET 激發(fā)發(fā)射通道的空分切換以及通道復(fù)用.結(jié)合通道亞像素配準(zhǔn)校正的圖像重建算法,雙通道SISR-FRET 可以在保持定量超分辨FRET 分析的同時(shí)提升了3.5 倍時(shí)間分辨率.利用搭建的多色SIM 系統(tǒng)進(jìn)行了活細(xì)胞表達(dá)靶向線粒體外膜FRET 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的超分辨成像實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了雙通道SISR-FRET 的時(shí)空分辨率增強(qiáng)和FRET 定量分析的保真度.

1 引言

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET) 顯微成像術(shù)在活細(xì)胞中原位定量檢測(cè)生物大分子間動(dòng)態(tài)相互作用及空間分布方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì).在細(xì)胞生命活動(dòng)中,蛋白質(zhì)與其他生物分子形成復(fù)雜相互作用和調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),原位研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的時(shí)空分布和功能關(guān)系是目前生命科學(xué)的重要課題之一[1,2].盡管熒光顯微成像技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用提供了有利的條件,目前已有的蛋白間互作研究方法仍無(wú)法在活細(xì)胞內(nèi)同時(shí)實(shí)現(xiàn)蛋白結(jié)構(gòu)功能和空間分布動(dòng)態(tài)變化的解析[3].FRET 利用分子間共振能量轉(zhuǎn)移速率與距離6 次方反比的關(guān)系來(lái)度量1—10 nm 尺度分子的接近程度,該物理過(guò)程非常適合于表征分子構(gòu)象變化和分子間相互作用[4].通過(guò)定量計(jì)算FRET 表觀效率(ED,EA) 和總受體與供體的濃度比(RC),定量FRET 實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)蛋白互作的“可視化”,并為揭示蛋白復(fù)合物形成過(guò)程中親和力和化學(xué)計(jì)量比的測(cè)量提供了獨(dú)特見解[5,6].以上優(yōu)勢(shì)使得定量FRET 顯微成像技術(shù)正成為研究蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、疾病機(jī)制和藥物篩選的重要工具[7-9].

超分辨FRET 顯微成像術(shù)(super resolution FRET,SR-FRET) 為研究亞細(xì)胞器精細(xì)結(jié)構(gòu)上的分子結(jié)構(gòu)及其功能開辟了新道路.受限于衍射極限對(duì)顯微成像空間分辨率的約束,FRET 顯微成像分辨能力存在瓶頸,這使得傳統(tǒng)FRET 顯微成像在觀測(cè)亞細(xì)胞區(qū)域內(nèi)蛋白分子相互作用及空間定位時(shí)只能解析常規(guī)熒光顯微鏡分辨率約束下多分子事件的平均行為[10].近年來(lái)超分辨熒光顯微成像技術(shù)的發(fā)展極大提升了亞細(xì)胞器精細(xì)結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化的解析力,因此將超分辨顯微與FRET 成像功能融合并實(shí)現(xiàn)SR-FRET 顯微成像獲得了學(xué)界的廣泛關(guān)注[11,12].實(shí)現(xiàn)超分辨FRET 顯微成像的難點(diǎn)主要包括:1) 如何從重新分布的超分辨光場(chǎng)中定量解析出FRET 信號(hào);2)如何在有限光通量和光漂白條件下平衡時(shí)空分辨率提升與FRET 定量計(jì)算保真度.目前,基于單分子定位顯微術(shù)(single molecule localization microscopy,SMLM) 和受激發(fā)射耗盡顯微術(shù)(stimulated emission depletion microscopy,STED) 的SR-FRET 成像技術(shù)利用有機(jī)熒光染料標(biāo)記的FRET 固定樣品實(shí)現(xiàn)了FRET信號(hào)的超分辨解析[13-15].然而基于SMLM 的SRFRET需要收集供體和受體分子同時(shí)處于光激發(fā)活化狀態(tài)時(shí)的FRET 信號(hào),這對(duì)于互相獨(dú)立閃爍的供受體對(duì)來(lái)說(shuō)十分困難,極長(zhǎng)的成像時(shí)間也使得該技術(shù)與研究活細(xì)胞中發(fā)生的動(dòng)態(tài)過(guò)程很難兼容[10].對(duì)于基于STED 的SR-FRET,STED 損耗光改變了供體的激發(fā)態(tài)壽命并導(dǎo)致供體和受體分子的不均勻光漂白,這種調(diào)制過(guò)程使得STED FRET 只能得到半定量的FRET 指數(shù)而不能完成定量FRET測(cè)量[15].針對(duì)以上問(wèn)題,本課題組開展了結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)(structured illumination microscopy,SIM)和定量FRET 融合的探索[16].由于SIM 顯微術(shù)相比其他SR 成像技術(shù)具有照明光強(qiáng)度低、成像速度快的優(yōu)勢(shì),融合SIM 和FRET 技術(shù)可能實(shí)現(xiàn)目前最佳平衡時(shí)空分辨率和光漂白影響的SR-FRET成像術(shù)[17-22].為了消除SIM 重建偽影對(duì)定量FRET的影響,本課題組設(shè)計(jì)了一種基于結(jié)構(gòu)光照明超分辨FRET 兩步重建方法(SISR-FRET),該方法依次完成三通道SIM 圖像的線性重建和基于共同定位掩模濾波的FRET 定量解析.兩步過(guò)程可以確保重建的SR-FRET 信號(hào)的保真度,同時(shí)可以精確去除由SIM 偽影引起的假陽(yáng)性FRET 信號(hào).與傳統(tǒng)的寬場(chǎng)FRET 成像相比,SISR-FRET 保持了定量特性并實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞中120 nm 空間分辨率解析亞細(xì)胞器精細(xì)結(jié)構(gòu)上的FRET 信號(hào)[23].

實(shí)現(xiàn)快速結(jié)構(gòu)光照明超分辨定量FRET 成像是目前活細(xì)胞SR-FRET 研究的迫切需要.對(duì)于SISR-FRET,完成一次成像需要采集結(jié)構(gòu)光調(diào)制下的三通道27 張?jiān)紙D像組,如果被成像的FRET樣本在拍攝總時(shí)間內(nèi)移動(dòng)距離超出了系統(tǒng)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(point spread function,PSF) 范圍,則重建的超分辨圖像就會(huì)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)偽影并導(dǎo)致FRET 結(jié)果失真[24].盡管傳統(tǒng)基于濾光片轉(zhuǎn)輪的時(shí)分FRET三通道切換方案具有切換靈活、無(wú)需通道對(duì)準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn),機(jī)械轉(zhuǎn)盤切換速度慢的缺點(diǎn)限制了SISR-FRET快速成像[25].針對(duì)以上問(wèn)題,本文提出一種雙通道結(jié)構(gòu)光照明超分辨定量FRET 成像系統(tǒng)和方法,通過(guò)在成像光路中引入FRET 雙通道探測(cè)和對(duì)準(zhǔn)模塊,雙通道SISR-FRET 系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了FRET 通道的空分切換.進(jìn)一步地,通過(guò)優(yōu)化系統(tǒng)時(shí)序控制以及加入通道亞像素對(duì)準(zhǔn)算法,雙通道SISR-FRET系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了快速三通道成像并保持通道亞像素精度對(duì)準(zhǔn),最終相比于基于濾光片轉(zhuǎn)輪的時(shí)分FRET三通道切換方案有效提升了3.5 倍的時(shí)間分辨率.利用該系統(tǒng)對(duì)活細(xì)胞表達(dá)靶向線粒體外膜的FRET標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行成像,驗(yàn)證了雙通道SISR-FRET 的時(shí)空分辨率增強(qiáng)和FRET 定量分析的保真度.

2 雙通道SISR-FRET 系統(tǒng)與方法

2.1 成像系統(tǒng)設(shè)計(jì)與搭建

完成一次SISR-FRET 成像首先需要收集供體激發(fā)供體發(fā)射(DD 通道)、供體激發(fā)受體發(fā)射(DA 通道) 和受體激發(fā)受體發(fā)射(AA 通道) 3 個(gè)通道結(jié)構(gòu)光照明調(diào)制的原始圖像組.每一個(gè)激發(fā)發(fā)射通道的原始圖像組由3 個(gè)不同結(jié)構(gòu)光方向角,每個(gè)結(jié)構(gòu)光方位角包含3 個(gè)不同相位差的余弦結(jié)構(gòu)光調(diào)制的寬場(chǎng)熒光圖像構(gòu)成.三通道原始數(shù)據(jù)的強(qiáng)度分布可以由下式表示:

其中下標(biāo)θ(1,2,3)和n(-1,0,1) 表示余弦照明的方向角和相位差,上標(biāo)X(=DD,DA,AA) 表示FRET 通道,S(r) 表示樣本熒光信號(hào)的空間分布,分別是余弦結(jié)構(gòu)光場(chǎng)的調(diào)制深度、照明頻率矢量和初相位,HX(r) 表示不同F(xiàn)RET 通道X(=DD,DA,AA) 對(duì)應(yīng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF).

圖1 雙通道SISR-FRET 系統(tǒng)光路示意圖Fig.1.Schematic diagram of dual-channel SISR-FRET system.

2.2 雙通道SISR-FRET 重構(gòu)方法

在進(jìn)一步FRET 計(jì)算之前,需要對(duì)三通道SRFRET 圖像進(jìn)行預(yù)處理.由于雙通道成像系統(tǒng)存在通道配準(zhǔn)的問(wèn)題,除了在系統(tǒng)硬件配準(zhǔn)模塊上進(jìn)行像素級(jí)別的通道對(duì)準(zhǔn),還需要通過(guò)配準(zhǔn)算法實(shí)現(xiàn)FRET 三通道進(jìn)一步的亞像素級(jí)對(duì)準(zhǔn),以保證FRET逐像素計(jì)算時(shí)的精度.DA 和AA 通道圖像由于通道的復(fù)用關(guān)系不需要額外對(duì)準(zhǔn),因此配準(zhǔn)算法以DD通道SR 重建圖像為基準(zhǔn),通過(guò)將DA,AA 通道圖像與仿射變換相乘來(lái)實(shí)現(xiàn)與DD 通道圖像的亞像素級(jí)對(duì)準(zhǔn).仿射變換矩陣T通過(guò)以下最優(yōu)化方法獲得:

其中xt,yt為仿射變換矩陣的平移參數(shù),θ,s分別表示旋轉(zhuǎn)和縮放補(bǔ)償參數(shù).

另一方面,FRET 定量計(jì)算需要考慮背景灰度的影響.實(shí)驗(yàn)中對(duì)每個(gè)FRET 成像通道的超分辨圖像進(jìn)行逐像素灰度值統(tǒng)計(jì),并以灰度值直方圖中第1 個(gè)峰值對(duì)應(yīng)的灰度值作為該視野的背景灰度值(XDD,DA,AA).接著對(duì)圖像進(jìn)行背景修正并將負(fù)的像素灰度值置零,得到每個(gè)成像通道的修正圖像.具體過(guò)程表示為

FRET 三通道原始圖像組在采集過(guò)程中不可避免產(chǎn)生噪聲,這些噪聲會(huì)經(jīng)過(guò)SR-SIM 線性重建放大產(chǎn)生重建偽影并嚴(yán)重影響FRET 定量分析.由于噪聲偽影是隨機(jī)疊加在FRET 三通道圖像上,其空間分布彼此獨(dú)立,因此這種偽影在三通道圖像間具有非常低的相關(guān)性.相反,當(dāng)FRET 發(fā)生的必要條件是供受體熒光分子靠近到10 nm 尺度內(nèi),這樣供體和受體分布將展現(xiàn)出極強(qiáng)的共定位特征,即超過(guò)隨機(jī)噪聲圖像間的強(qiáng)相關(guān)性.因此可以利用以上先驗(yàn)信息設(shè)計(jì)共同定位掩模來(lái)抑制重建偽影的干擾.為了定量表征FRET 信號(hào)和噪聲在不同成像通道之間差異,逐像素的共定位分析可以表示如下:

其中 PCCmap(r) 是供體和受體圖像中每個(gè)像素對(duì)皮爾遜相關(guān)系數(shù)(PCC)的權(quán)重分布圖,MOCmap(r)是供體和受體圖像中每個(gè)像素對(duì)曼德斯相關(guān)系數(shù)(MOC)的權(quán)重分布圖.是經(jīng)過(guò)背景扣除后的DD 通道圖像的灰度平均值,經(jīng)過(guò)背景扣除后的AA 通道圖像的灰度平均值.將 PCCmap(r) 和MOCmap(r)相乘得到混合共定位權(quán)重矩陣,并通過(guò)自適應(yīng)閾值處理算法進(jìn)行混合共定位權(quán)重矩陣的分割生成二值化掩膜板Bcolocalmask(r),可以如下表示:

經(jīng)過(guò)以上圖像預(yù)處理后,SISR-FRET 計(jì)算供體為中心的FRET 表觀效率ED和總受體與供體的濃度比RC由如下公式得到:

其中,FcSIM為受體敏化發(fā)射熒光強(qiáng)度,G為敏化淬滅轉(zhuǎn)化因子,K為供受體濃度轉(zhuǎn)化因子,a,b,c,d為系統(tǒng)串?dāng)_系數(shù).

總結(jié)雙通道SISR-FRET 算法流程圖如圖2所示,實(shí)施SISR-FRET 需要以下3 個(gè)步驟:1)使用三通道原始數(shù)據(jù)重建三通道SR 圖像(XDD,DA,AA);2) 通過(guò)圖像預(yù)處理過(guò)程,對(duì)重建的三通道SR 圖像進(jìn)行背景扣除,通道對(duì)準(zhǔn)和共定位掩膜濾波模板生成;3) 對(duì)預(yù)處理后的三通道SR 圖像中定量計(jì)算FRET 效率(ED)和受供體濃度比(RC).

圖2 雙通道SISR-FRET 的算法流程圖Fig.2.Flow chart of dual-channel SISR-FRET algorithm.

2.3 控制系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與優(yōu)化

根據(jù)2.1 和2.2 節(jié)的內(nèi)容,完成一次SISRFRET 成像需要采集結(jié)構(gòu)光調(diào)制下的三通道27 張?jiān)紙D像組.其中一組典型的FERT 三通道原始數(shù)據(jù)采集時(shí)序如圖3 所示.采集過(guò)程首先由上位機(jī)發(fā)送指令給下位機(jī),隨后下位機(jī)發(fā)出精確同步控制信號(hào)給SLM、激光器、機(jī)械轉(zhuǎn)盤以及兩臺(tái)sCMOS相機(jī).對(duì)于單通道SISR-FRET,下位機(jī)發(fā)出同步信號(hào)給SLM 進(jìn)行結(jié)構(gòu)化圖案顯示,同時(shí)開啟激光器并打開相機(jī)曝光完成一次拍攝.在等待相機(jī)讀出以及SLM 暗圖像刷新的時(shí)間內(nèi),下位機(jī)發(fā)送觸發(fā)信號(hào)關(guān)閉激光器并使能機(jī)械轉(zhuǎn)盤完成FRET 通道切換,重復(fù)以上過(guò)程3次,即可完成一組FERT 原始數(shù)據(jù)采集并將數(shù)據(jù)傳輸給上位機(jī).為了加快轉(zhuǎn)盤切換速度,單通道SISR-FRET 采用快速機(jī)械轉(zhuǎn)盤(FW103,Throlabs),該器件的最小通道的切換時(shí)間為50 ms.根據(jù)經(jīng)驗(yàn)設(shè)定相機(jī)典型單幀曝光時(shí)間為10 ms,圖像采集區(qū)域大小為512×512@16 bit,此時(shí)轉(zhuǎn)盤完成切換的時(shí)間制約了整個(gè)系統(tǒng)成像速度,該方案可實(shí)現(xiàn)的一組FERT 三通道原始數(shù)據(jù)采集時(shí)間為140 ms(圖3(a)).由于雙通道SISRFRET 將基于濾光片轉(zhuǎn)輪的時(shí)分FRET 三通道切換方案替換為基于二項(xiàng)色鏡分光的空分方案,期間無(wú)需轉(zhuǎn)動(dòng)機(jī)械轉(zhuǎn)輪來(lái)切換不同波長(zhǎng)的發(fā)射濾光片,此時(shí)制約成像系統(tǒng)進(jìn)行下一組曝光的等待時(shí)間則由相機(jī)的讀出時(shí)間和SLM 的負(fù)圖像顯示時(shí)間來(lái)確定.另一方面,由采用雙通道方案,一次激發(fā)可以在兩個(gè)發(fā)射通道實(shí)現(xiàn)同時(shí)成像(DD&DA).相比傳統(tǒng)基于濾光片轉(zhuǎn)輪的時(shí)分FRET 三通道切換方案需要切換3 次才能完成圖像采集,雙通道FRET成像系統(tǒng)只需兩次成像即可完成,從而將相機(jī)曝光讀出時(shí)間占比進(jìn)一步減少了1/3.在此方案下,雙通道方案在曝光時(shí)間相同的情況下完成一組FRET三通道原始數(shù)據(jù)采集時(shí)間為40 ms,相應(yīng)系統(tǒng)時(shí)間分辨率從原來(lái)的約1 幀/s 提升為3 幀/s,實(shí)現(xiàn)了約3.5 倍的時(shí)間分辨率提升.

圖3 雙通道SISR-FRET 與單通道SISR-FRET 時(shí)序圖對(duì)比(a)單通道SISR-FRET 在一個(gè)FRET 采集周期的時(shí)序圖;(b)雙通道SISR-FRET 相同周期的時(shí)序圖Fig.3.Comparison of timing sequence of dual-channel SISR-FRET and single-channel SISR-FRET:(a) Timing sequence of singlechannel SISR-FRET in one FRET acquisition cycle;(b) timing sequence of dual-channel SISR-FRET in the same cycle.

3 成像結(jié)果與討論

為了驗(yàn)證雙通道SISR-FRET 系統(tǒng)在活細(xì)胞中超分辨FRET 成像能力,使用表達(dá)靶向線粒體外膜的FRET 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(ActA-G17M) 的MCF-7 細(xì)胞樣本進(jìn)行系統(tǒng)測(cè)試.ActA-G17M 融合了線粒體外膜靶向蛋白ActA 和FRET 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒G17M,其中G17M 由GFP 和mCherry 之間連接17 個(gè)氨基酸構(gòu)成.該質(zhì)粒的理論FRET 表觀效率(ED)為0.2,受體與供體的濃度比(RC) 為1.

利用該樣本首先對(duì)系統(tǒng)雙相機(jī)超分辨成像結(jié)果的通道對(duì)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)定,結(jié)果如圖4 所示.圖4(a)為樣本在DD 和AA 通道超分辨成像的偽彩圖,圖4(b)為DD 和AA 通道超分辨成像只經(jīng)過(guò)系統(tǒng)硬件進(jìn)行通道對(duì)準(zhǔn)時(shí)的疊加效果圖,可以明顯觀察到AA 通道對(duì)比DD 通道圖像像素的整體向下的錯(cuò)位.經(jīng)過(guò)雙通道SISR-FRET 圖像對(duì)準(zhǔn)算法處理后,可計(jì)算得到最優(yōu)對(duì)準(zhǔn)效果的仿射變換矩陣T為[1,0,-0.85],[0,1,-3.32],[0,0,1].此時(shí)經(jīng)過(guò)仿射變換矩陣校正后的DD&AA 疊加效果圖如圖4(c) 所示,其相比于圖4(b) 對(duì)準(zhǔn)效果明顯提升,在整個(gè)視野內(nèi)DD&AA 通道線粒體外膜精細(xì)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出很好的重合,證明了對(duì)準(zhǔn)算法在進(jìn)行亞像素精度對(duì)準(zhǔn)的有效性以及SISR-FRET 成像系統(tǒng)的成像質(zhì)量.

圖4 雙通道SISR-FRET 通道對(duì)準(zhǔn)效果(a) DD 通道和AA通道成像結(jié)果的偽彩圖,綠色為DD 通道,紅色為AA 通道;(b)未經(jīng)過(guò)算法對(duì)準(zhǔn)的DD 通道和AA 通道成像結(jié)果疊加圖;(c)經(jīng)過(guò)仿射變換矩陣對(duì)準(zhǔn)的DD 通道和AA 通道成像結(jié)果疊加圖.比例尺:2 μmFig.4.Dual-channel SISR-FRET alignment results:(a) Pseudo-color image of DD channel and AA channel imaging results,green is DD channel,red is AA channel;(b) overlay of the imaging results of DD channel and AA channel without algorithm alignment;(c) overlay of DD channel and AA channel imaging results after affine transformation matrix alignment.Scale bar:2 μm.

為了測(cè)試雙通道SISR-FRET 系統(tǒng)的超分辨成像能力,對(duì)表達(dá)ActA-G17M 質(zhì)粒的MCF7 細(xì)胞進(jìn)行了定量超分辨FRET 成像.為獲得采樣速度和收集光子計(jì)數(shù)之間的最佳平衡,單幀圖像的曝光時(shí)間設(shè)置為10 ms,相應(yīng)總的雙通道SISR-FRET測(cè)量時(shí)間分辨率約360 ms.在此參數(shù)設(shè)置下,三通道超分辨圖像重建結(jié)果如圖5 所示.圖5(a)—(c)分別為DD,DA,AA 通道對(duì)ActA-G17 M 寬場(chǎng)成像結(jié)果,圖5(d)—(f) 分別為DD,DA,AA 通道對(duì)ActA-G17M 超分辨成像結(jié)果.一些在寬場(chǎng)成像中無(wú)法區(qū)分的相鄰線粒體外膜精細(xì)結(jié)構(gòu)在超分辨圖像得到清晰解析.證明當(dāng)前系統(tǒng)進(jìn)行FRET 三通道超分辨成像時(shí)分辨率提升的有效性.

圖5 雙通道SISR-FRET 成像系統(tǒng)對(duì)ActA-G17 M 樣本成像結(jié)果(a)—(c) DD,DA,AA 通道寬場(chǎng)成像結(jié)果;(d)—(f) DD,DA,AA 通道超分辨成像結(jié)果.比例尺:2 μmFig.5.Imagingresultsofthedual-channelSISR-FRETimaging systemfor the ActA-G17Msample:(a)-(c)Wide-fieldimagingresults intheDD,DA,andAAchannels;(d)-(f)super-resolution imagingresults in theDD,DA,and AAchannels.Scalebar:2μm.

為了測(cè)試雙通道SISR-FRET 系統(tǒng)的超分辨定量FRET 分析能力,對(duì)圖5 中三通道超分辨FRET圖像進(jìn)一步進(jìn)行定量FRET 分析,結(jié)果如圖6 所示.圖6(a) 和圖6(c) 分別展示了寬場(chǎng)FRET 和超分辨FRET 效率ED和受供體濃度比RC的空間分布,可以清晰看到雙通道SISR-FRET 重建算法對(duì)FRET 空間分辨能力的提升.另一方面圖6(b),(d)分別展示了寬場(chǎng)FRET 和超分辨FRET 效率ED和受供體濃度比RC的逐像素統(tǒng)計(jì)結(jié)果,可以看出SISR-FRET 和寬場(chǎng)FRET 一樣可以正確解析ActA-G17 M 質(zhì)粒的ED和RC,但是由于SISRFRET 組DA 通道的信噪比較低,最終導(dǎo)致SISRFRET 統(tǒng)計(jì)直方圖的半高全寬相比傳統(tǒng)寬場(chǎng)FRET 結(jié)果得到了展寬.

圖6 雙通道SISR-FRET 成像定量FRET 分析結(jié)果對(duì)比(a)寬場(chǎng)FRET 和超分辨FRET 效率ED 的偽彩圖;(b)圖(a)中結(jié)果的統(tǒng)計(jì)直方圖;(c)寬場(chǎng)FRET 和超分辨FRET 受供體濃度比 RC 的偽彩圖;(d) 圖(c)中結(jié)果的統(tǒng)計(jì)直方圖.比例尺:2 μmFig.6.Comparison of quantitative FRET analysis results from dual-channel SISR-FRET imaging:(a) Pseudo-color map of ED for wide-field FRET and super-resolution FRET;(b) corresponding statistical histograms;(c) pseudo-color plot of RC for wide-field FRET and super-resolution FRET;(d) corresponding statistical histograms.Scale bars:2 μm.

為了定量比較雙通道SISR-FRET 成像分辨率對(duì)比寬場(chǎng)FRET 的提升,現(xiàn)將圖5 和圖6 結(jié)果進(jìn)行了重疊比較,結(jié)果如圖7(a),(b) 所示,線粒體外膜的結(jié)構(gòu)分布和經(jīng)過(guò)共定位掩膜濾波的FRET效率空間分布有著良好的重合,證明SISR-FRET具備在活細(xì)胞中定量解析精細(xì)結(jié)構(gòu)上FRET 信號(hào)的能力.其中圖7(a),(b) 局部放大的線粒體外膜結(jié)構(gòu)FRET 信號(hào)在寬場(chǎng)FRET 成像下無(wú)法分辨,而在SISR-FRET 成像下可以清晰區(qū)分(圖7(c)—(f)).

4 結(jié)論

本文提出和搭建了一套雙通道結(jié)構(gòu)光照明超分辨定量FRET 成像系統(tǒng).該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了SISRFRET 激發(fā)發(fā)射通道的空分切換以及通道復(fù)用,提升了約3.5 倍的時(shí)間分辨率.相比傳統(tǒng)的寬場(chǎng)FRET 技術(shù),雙通道SISR-FRET 具有更高的時(shí)空分辨率,能夠更準(zhǔn)確地定位和解析供受體之間的FRET 信號(hào),從而提高解析活細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)上分子互作的能力.通過(guò)將雙通道SISR-FRET 技術(shù)應(yīng)用于亞細(xì)胞器尺度的蛋白相互作用過(guò)程的精確定量檢測(cè)中,可以直觀地展示亞細(xì)胞器的空間結(jié)構(gòu)變化以及蛋白的定位關(guān)系.這對(duì)于揭示活細(xì)胞中細(xì)胞核、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等生物大分子生成和執(zhí)行功能的場(chǎng)所精細(xì)結(jié)構(gòu)上的分子結(jié)構(gòu)及其功能具有重要意義.通過(guò)這項(xiàng)技術(shù),能更深入地了解細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的分子動(dòng)態(tài)過(guò)程,為研究生物體的功能和機(jī)制提供有力的工具.