羅孔, 張春華, 歐朝蓉, 阮長(zhǎng)明, 孫永玉*, 王猛*
1. 西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 云南 昆明 650233;
2. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院高原林業(yè)研究所, 云南 昆明 650233;
3. 云南元謀干熱河谷生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家定位觀測(cè)研究站, 云南 昆明 650233
干旱作為植物逆境脅迫影響眾多環(huán)境因子中的最普遍、最主要形式,是影響種子萌發(fā)的關(guān)鍵因素[1]。種子萌發(fā)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)理如避旱或適旱萌發(fā),從側(cè)面反映了其適應(yīng)某一類環(huán)境的生態(tài)機(jī)制。用PEG-6 000溶液滲透方法探討植物種子對(duì)干旱脅迫萌發(fā)特性的響應(yīng),具有簡(jiǎn)單易行、周期短、重復(fù)性好等特點(diǎn),近年來被廣泛地用于植物種子萌發(fā)期的耐旱性研究[2-5]。巖柿(Diospyros dumetorum)是柿科(Ebenaceae)柿屬(Diospyros)常綠小喬木,又名烏木果(文山),烏木(麗江、寧蒗、祿勸),烏木樹(武定),紫藿香、澀藿香(玉溪)廣泛分布于金沙江、元江、怒江流域等干旱少雨、土壤貧瘠的干熱河谷區(qū)域[6-7]。巖柿受樵采等人為因素影響矮化,因其發(fā)達(dá)根系具較強(qiáng)的萌生和根孽作用而廣泛分布,為區(qū)域植被再生重建保存了有限的繁殖體[8-9]。巖柿,葉和果實(shí)可入藥食用,如新鮮或干燥葉,可用于治"咳嗽吐血、止渴生津",具有藥用價(jià)值[10]。關(guān)于巖柿育種育苗方面,目前還未見其報(bào)道。本試驗(yàn)從種子萌發(fā)條件、萌發(fā)情況入手,探討其種子萌發(fā)期對(duì)抗旱能力及環(huán)境溫度對(duì)種子萌發(fā)的影響,為其種苗規(guī)模化生產(chǎn)及在干熱河谷生態(tài)恢復(fù)和重建過程中應(yīng)用的可能性提供理論和科學(xué)依據(jù)。
試驗(yàn)用巖柿果實(shí)2021年12月采自于云南省大理州永勝縣熱河鄉(xiāng)的野生植株,母樹生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)良好,種子剝離后用水選法去除空粒和夾雜物,經(jīng)表面陰干,選取飽滿、大小均勻的種子4℃低溫保存[11]。測(cè)定種子大小、重量及活力[11],種子千粒重測(cè)定采用百粒法(167.49±0.34 g);用游標(biāo)卡尺測(cè)量120粒種子的長(zhǎng)軸和短軸,平均值分別為10.36±0.10 mm、6.06±0.05 mm;種子烘干后測(cè)得平均含水量為18.18±0.29 %;TTC法種子活力測(cè)定其平均活力為83.33±3.30 %。
1.2.1 PEG-6 000模擬干旱脅迫種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)
2022年1-3月在中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院高原林業(yè)研究所國(guó)家林草局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn),首先進(jìn)行消毒處理,用3 %的高錳酸鉀溶液浸泡巖柿種子30 min消毒,然后再用流水沖洗2小時(shí)[11]。參考陳釧等人[12-15]配置不同濃度(0%、5%、10%、15%、20%、25%)PEG-6 000溶液,對(duì)照CK為蒸餾水(0%),分別對(duì)應(yīng)不同的水勢(shì)(0 MPa、-0.58 MPa、-1.66 MPa、-3.256 MPa、-5.346 MPa、-7.490 MPa)[16-17],以此來模擬干旱脅迫,6個(gè)處理每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),每重復(fù)30粒種子。試驗(yàn)時(shí)將種子均勻鋪放在墊設(shè) 2 層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi),溫度設(shè)置為0℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃[18~22],光照條件為12 h光/12 h暗,光強(qiáng)為3 000 lx[12-15],在光照恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天稱量培養(yǎng)皿的質(zhì)量,并用蒸餾水補(bǔ)足其損失水量以保證PEG的滲透勢(shì)不變[13-16.25]。觀察并記錄種子萌發(fā)情況,將每處理中有1粒種子萌發(fā)作為該處理發(fā)芽的開始,統(tǒng)計(jì)種子的發(fā)芽數(shù),連續(xù)7 d不再有種子發(fā)芽作為發(fā)芽的結(jié)束。
1.2.2 萌發(fā)指標(biāo)的測(cè)定
發(fā)芽率/GE (%)=x/X×100%[25-28];
發(fā)芽勢(shì)/GR (%)=Y/X×100%[27-28];
發(fā)芽指數(shù) GI = ∑( Gt /Dt )[27-28];
活力指數(shù) VI = GI × S[27];
抗旱指數(shù) PI= ( PIS ) / ( PIC )[29]。
式中:x表供試種子發(fā)芽的數(shù)量,X表示供試種子的數(shù)量;Y為發(fā)芽達(dá)最高峰時(shí)的發(fā)芽數(shù)量,Gt 表示在第 t d的發(fā)芽數(shù);Dt 表示與 Gt 相對(duì)應(yīng)種子出芽經(jīng)歷時(shí)間;S 表示規(guī)定時(shí)間( 60 d) 內(nèi)單株幼苗的平均根長(zhǎng)。PIS表示干旱脅迫下種子萌發(fā)指數(shù),PIC表示對(duì)照種子萌發(fā)指數(shù),式中PIS =1.00 nd2 + 0.75 nd4 +0.5 nd6 + 0.25 nd8 ( nd2、nd4、nd6、nd8分別是每個(gè)處理萌發(fā)開始后2、4、6、8 d的種子萌發(fā)率)
1.2.3 數(shù)據(jù)分析
采用Excel 2016、SPSS22.0 等系統(tǒng)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析繪圖,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,多重比較采用 Duncan 法。
由表1可知,10℃和25% PEG條件下所有處理都不萌發(fā),隨著PEG濃度的增加,四種溫度處理下的發(fā)芽率都呈明顯的先升高后下降明顯。溫度過高和過低對(duì)發(fā)芽率均存在不同程度影響。15℃、20℃、25℃、30℃各干旱處理間發(fā)芽率平均值分別為20.74%、55.56%、82.89%、68.45%。其中,30℃和25℃的輕度干旱處理PEG濃度為5%時(shí)發(fā)芽率最大,88.89、94.44% ,其平均值為91.66%。15℃時(shí)0%、10% PEG脅迫處理下發(fā)芽率值相對(duì)較小,分別為22.22%、12.22%,其平均值為17.22%。PEG脅迫強(qiáng)度最大時(shí),15℃、20℃、25℃、30℃相比處理前發(fā)芽率分別降低了10.00%、42.48%、25.56%、47.77%。15℃在0%、5% PEG濃度時(shí),處理間差異不著,超過5%PEG處理發(fā)芽率顯著下降。20℃在0%~10%PEG處理時(shí)差異顯著,而在10% PEG濃度時(shí),發(fā)芽率就已經(jīng)顯著下降。25℃在0 %、10%PEG處理時(shí)發(fā)芽率差異顯著,而5%PEG與其他處理存在顯著差異,發(fā)芽率最大,超過10%PEG處理發(fā)芽率顯著下降。30℃在0 %~5%PEG處理時(shí)發(fā)芽率差異不顯著,超過5%發(fā)芽率顯著下降。發(fā)芽率對(duì)溫度和PEG干旱脅迫的變化響應(yīng)較為明顯。
表1 PEG干旱脅迫和不同溫度處理對(duì)巖柿種子萌發(fā)特性的影響Tab. 1 Effects of PEG drought stress and different temperature treatments on seed germination characteristics of Diospyros dumetorum
由表1 可以看出,隨著PEG濃度的逐漸增大,四種溫度下的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、明顯的先升高后下降,PEG濃度為0%~10%時(shí),四種溫度發(fā)芽勢(shì)下降趨勢(shì)皆較平緩,但當(dāng)PEG濃度增至15%時(shí)發(fā)芽勢(shì)明顯下降,尤其是15% PEG與20% PEG發(fā)芽勢(shì)迅速下降。說明PEG濃度>10%時(shí),對(duì)種子萌發(fā)造成的影響顯著增強(qiáng)。種子的發(fā)芽勢(shì)隨著PEG濃度的增加,下降較為明顯,且當(dāng)PEG濃度為10%時(shí),種子的發(fā)芽勢(shì)顯著高于15% PEG和20% PEG。15℃下的整體發(fā)芽勢(shì)要低于20℃、25℃和30℃。排序:15% <25%< 20%< 30%。說明在PEG濃度干旱脅迫強(qiáng)度較大時(shí),對(duì)四種溫度下的發(fā)芽勢(shì)影響都有著較大的影響。
當(dāng)溫度處理為15℃ 時(shí)PEG干旱脅迫對(duì)種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)影響總體較小,對(duì)20℃、25℃和30℃種子萌發(fā)影響較大。15℃、20℃、25℃和30℃種子發(fā)芽指數(shù)在5%~20% PEG濃度區(qū)間內(nèi),發(fā)芽指數(shù)下降幅度較大。說明10%~20% PEG濃度區(qū)間內(nèi),PEG干旱脅迫對(duì)種子的萌發(fā)具有明顯抑制作用。從PEG和溫度處理對(duì)巖柿種子的影響中可以看出,隨著PEG濃度的升高,四種溫度下的發(fā)芽指數(shù)均呈明顯的先升高后下降趨勢(shì),種子在15℃、20℃、25℃、30℃時(shí)5% PEG的處理下發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)達(dá)到最大值,除在15℃超過10% PEG的處理下達(dá)到最小值為外,其余三種溫度在25% PEG濃度處理下發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)達(dá)到最小值。在PEG濃度為5%、10%、20%時(shí),種間差異顯著,并發(fā)現(xiàn)在0%~20% PEG濃度時(shí),溫度在25 ℃時(shí)組間內(nèi)的各發(fā)芽指數(shù)活力指數(shù)皆高溫度在20℃和30 ℃的發(fā)芽指數(shù),發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)在15 ℃時(shí)最低,在0%~5% PEG濃度時(shí),活力指數(shù)呈現(xiàn)增加的趨勢(shì),增加趨勢(shì)較為平緩,當(dāng)PEG濃度增大至10%及20%時(shí),其活力指數(shù)顯著下降。0%~5% PEG濃度區(qū)間內(nèi),溫度在15℃時(shí)在0%~10% PEG濃度區(qū)間內(nèi)其活力指數(shù)變化幅度較小,溫度20℃、25℃、30℃時(shí)在10%~20%PEG濃度區(qū)間內(nèi),隨著PEG濃度的增加,發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)總體都呈下降趨勢(shì)。
從表1 PEG中可以得出,在15% PEG脅迫時(shí),溫度為15℃、20℃、25℃和30℃的抗旱指數(shù)均高于對(duì)照,溫度為25℃時(shí)的抗旱指數(shù)與對(duì)照相差較小,其余三種溫度下種子的抗旱指數(shù)表現(xiàn)顯著降低??购抵笖?shù)達(dá)到最大值時(shí)為1℃、20℃、25℃和30℃時(shí)5% PEG干旱脅迫處理組,其中15℃最小值10%PEG處理組,抗旱指數(shù)變化幅度較小。其他溫度下達(dá)到最小值為20% PEG的處理組。30℃抗旱指數(shù)整體上要高于15℃、20℃和25℃。巖柿的抗旱指數(shù)隨著PEG濃度逐漸增大,在5%~20% PEG濃度區(qū)間內(nèi)種間變化顯著,總體都呈下降趨勢(shì)。但在PEG濃度為15%時(shí),0%、5%、10%、20% PEG濃度時(shí)的活力指數(shù),在0%~5% PEG濃度區(qū)間內(nèi),活力指數(shù)變化幅度較小,在PEG濃度增大至10%及20%時(shí),其抗旱指數(shù)顯著下降。溫度在20℃、25℃、30℃時(shí)0%~25% PEG濃度區(qū)間內(nèi),變化較大。隨著PEG濃度的提高,各溫度處理的抗旱指數(shù)均表現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)。在25% PEG濃度脅迫下,平均抗早指數(shù)達(dá)到最低值,這表明萌發(fā)期抗旱指數(shù)對(duì)PEG模擬的干旱脅迫較為敏感。
對(duì)不同溫度下,對(duì)照組(CK)蒸餾水處理組發(fā)芽率均值進(jìn)行線性回歸分析,得出的擬合曲線圖1,二次曲線模型達(dá)到顯著水平P<0.05,決定系數(shù)R2=0.9371,其模型曲線可靠度最大且適宜,二次曲線模型y = -0.6778x2+ 34.211x—335.72為描述溫度與巖柿種子發(fā)芽率關(guān)系的最優(yōu)模型。b1的系數(shù)34.211>1,說明隨著溫度的增加,種子發(fā)芽率也逐漸增加,溫度的升高對(duì)發(fā)芽率起促進(jìn)作用,但隨著溫度的增加,b2的系數(shù)為 -0.6778< 0,說明當(dāng)溫度超過一定值時(shí),發(fā)芽率就會(huì)出現(xiàn)下降的趨勢(shì),求解得到這個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)為34.211/(2* 0.6778)=25.24,此時(shí)的值為最適宜的溫度。從圖1擬合的模型曲線中,接近峰值適宜萌發(fā)的溫度處理為20℃~30℃范圍內(nèi),可以看出四種溫度處理下,25℃更接近峰值,種子萌發(fā)率最高。
圖1 溫度與發(fā)芽率的曲線擬合Fig. 1 Curve fitting of temperature and germination rate
通過,溫度對(duì)巖柿種子萌發(fā)影響,得出四種溫度下,巖柿種子萌發(fā)率最高溫度是25 ℃。對(duì)此溫度下不同PEG干旱脅迫處理的種子發(fā)芽率進(jìn)行回歸分析擬合的曲線得如圖2所示。二次曲線模型達(dá)到顯著水平P<0.05,模型決定系數(shù)R2=0.943,可靠度值最大,二次曲線模型y = -0.2841x2+ 4.0238x +83.889為描述PEG處理濃度與巖柿種子發(fā)芽率關(guān)系的最優(yōu)模型。b1的系數(shù)4.0238>1,說明隨著PEG濃度的增加,種子發(fā)芽率也逐漸增加,PEG濃度的升高對(duì)發(fā)芽率有著引發(fā)作用,但隨著PEG濃度的增加,b2的系數(shù)為 -0.2841 < 0,說明當(dāng)PEG波動(dòng)超過一定值時(shí),發(fā)芽率就會(huì)出現(xiàn)下降的趨勢(shì),求解得到這個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)為4.0238/(2*0.2841)=7.08,超過此PEG濃度處理發(fā)芽率就會(huì)受到不同程度的抑制。從圖1擬合的模型曲線中得出,5% PEG處理更接近發(fā)芽率峰值,0%~25% PEG處理下巖柿種子能萌發(fā)。與對(duì)照相比,隨著PEG干旱脅迫的增加發(fā)芽率逐漸下降,10%~20% PEG處理萌發(fā)率下降更為明顯。
圖2 PEG干旱脅迫與發(fā)芽率的擬合曲線Fig. 2 Fitting curve of PEG drought stress and germination rate
PEG干旱脅迫與萌發(fā)指標(biāo)相關(guān)系數(shù)性差異較大(見表2),發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均與PEG濃度呈極顯著負(fù)相關(guān),說明隨著干旱脅迫的加深,發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)明顯降低。試驗(yàn)結(jié)果顯示,發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、都與PEG濃度呈負(fù)相關(guān),既當(dāng)PEG濃度增加時(shí)上述指標(biāo)值都減小。PEG濃度與發(fā)芽率呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),與發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),與抗旱指數(shù)與PEG濃度呈負(fù)相關(guān),相關(guān)性不顯著(P>0.05)。發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)有極顯著正相關(guān)(P<0.01),與抗旱指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。發(fā)芽勢(shì)與發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和抗旱指數(shù)均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。發(fā)芽指數(shù)與活力指數(shù)呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與抗旱指數(shù)相關(guān)性不顯著(P>0.05)?;盍χ笖?shù)與抗旱指數(shù)相關(guān)性不顯著(P>0.05)。
表2 PEG干旱脅迫種子萌發(fā)指標(biāo)相關(guān)性分析Tab. 2 Correlation analysis of PEG drought stress seed germination indexes
種子作為植物最重要的繁殖器官,其萌發(fā)階段的耐旱狀況可以在一定程度上反映其抗旱能力。一般情況下,耐旱植物的萌發(fā)在一定范圍的干旱程度內(nèi)是不受影響的,當(dāng)外界干旱程度超過其耐受范圍時(shí)其萌發(fā)及生長(zhǎng)狀況會(huì)受到顯著的影響[29]。巖柿種子在PEG脅迫下其發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和抗旱指數(shù)等指標(biāo)都有明顯的變化。不同的溫度處理下減小的幅度不同,不同指標(biāo)的變化也不相同,隨著PEG濃度的增加,這些指標(biāo)都顯著或明顯減小,此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與(李慧等,2022;程繼銘等,2020,楊嬌嬌等,2020)研究結(jié)果一致。
從總體上看,隨著PEG濃度的增加,各個(gè)溫度處理下巖柿種子的相對(duì)發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和相對(duì)活力指數(shù)均呈顯著下降趨勢(shì),此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果相似[25-29]。種子的相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)在PEG低濃度時(shí)都有輕微上升趨勢(shì),可能因低濃度的PEG處理對(duì)種子萌發(fā)起引發(fā)作用所致(汪桂鳳,2019;王小梅,2015;江遠(yuǎn)芳,2014)。隨著PEG濃度的增大,四種溫度處理下巖柿種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、發(fā)芽勢(shì)皆呈下降趨勢(shì)。PEG濃度為20%時(shí),對(duì)比15%PEG濃度處理,四種溫度處理下的發(fā)芽率都顯著下降,20℃、25℃、30℃分別降低了12.97%、22.78%、13.85%,說明當(dāng)PEG濃度處于15%~20%區(qū)間時(shí),PEG干旱脅迫對(duì)四種溫度處理下種子的發(fā)芽率抑制作用顯著。實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組與輕度干旱的5%、10%PEG濃度對(duì)巖柿種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)影響結(jié)果與張航等(2021)對(duì)榆樹種子的研究結(jié)果及孔佳茜等(2020)對(duì)大麻種子的研究結(jié)果一致。
結(jié)合巖柿分布區(qū)干熱河谷,氣候條件,年均溫>20℃, 日均溫>10℃且年積溫>7 000 ℃的水平(鐘祥浩, 2000; 金振洲和歐曉昆, 2000),結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果15℃~30℃巖柿種子可以萌發(fā),分布區(qū)溫度情況滿足巖柿種子萌發(fā)所需要求,這與它集中分布于干熱河谷地區(qū)相符。通過張榮祖等(1992)明確提出的干熱河谷氣候指標(biāo),最冷月平均氣溫>12℃, 最暖月平均氣溫24℃—28℃, 日均溫≥10 ℃, 年平均積溫>7 000℃,年平均降雨量600—800 mm, 年平均蒸發(fā)量達(dá)2 750—3 850 mm,結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果低溫10℃巖柿種子不萌發(fā),20℃~30℃巖柿種子萌發(fā)率較高,其最冷月巖柿種子存在不能正常萌發(fā)的現(xiàn)象,其最暖月的溫度適宜巖柿種子的萌發(fā)。干熱河谷區(qū)內(nèi)主要干流是長(zhǎng)江上游的金沙江流域,年徑流量約為5.4×1 010 m3,年降雨量約為680.7 mm,可分為干(旱)濕兩季:干(旱)季為每年 11 月至翌年 4 月,降雨約占全年總降雨量的 18%以下;濕(雨)季為每年5—10月, 降雨約占全年總降雨量的 82—92%,干旱指數(shù)大于2.5,水熱矛盾突出(鐘祥浩, 000; 李昆等, 2011)。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果,超過15% PEG干旱脅迫處理對(duì)應(yīng)的水勢(shì)(-3.256 MPa)時(shí)巖柿種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì),發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、抗旱指數(shù)受到抑制。0%、5%、10% PEG處理分別對(duì)應(yīng)的低水勢(shì)(0 MPa、-0.58 MPa、-1.66 MPa)種子發(fā)芽率高。干(旱)季的高水勢(shì)不宜巖柿種子萌發(fā),濕(雨)季低水勢(shì)則適宜巖柿種子的萌發(fā)。在相應(yīng)的季節(jié),進(jìn)行播種育苗能最大限度提高種子的發(fā)芽率。
PEG干旱脅迫處理對(duì)巖柿種子萌發(fā)期,發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、抗旱指數(shù)均有著不同程度的影響。通過PEG干旱脅迫種子萌發(fā)指標(biāo)相關(guān)性分析,得出PEG濃度對(duì)不同溫度下的萌發(fā)指標(biāo)均有著不同程度的顯著差異。通過溫度與巖柿種子發(fā)芽率回歸方程擬合曲線分析,發(fā)現(xiàn)20℃~30℃作為巖柿種子萌發(fā)期抗旱性差異的理想溫度。通過不同溫度和PEG濃度處理巖柿種子萌發(fā)特性的比較分析,隨著干旱脅迫程度的增加,15%~25%PEG濃度處理與對(duì)照組(CK)、5%、10%PEG處理相比對(duì)其萌發(fā)指標(biāo)表現(xiàn)得明顯,差異性較為顯著。從PEG干旱脅迫對(duì)巖柿種子萌發(fā)率的影響回歸方程擬合曲線中發(fā)現(xiàn),0%~25%PEG濃度可作為巖柿種子萌發(fā)期抗旱性差異的理想濃度,區(qū)分巖柿種子萌發(fā)期抗旱性差異的濃度建議選擇為10%~20%PEG干旱脅迫處理。