唐子佳 東智卓瑪 吳建軍 林適 楊彬彬 陳桐瑩 黃佳純 林燕平 黃幸儒 黃宏興*

1． 廣州中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院,廣東 廣州 510405

2． 廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510378

絞股藍皂苷(gypenoside)是葫蘆科屬草本植物絞股藍的重要生物活性成分之一[1],基于Cite Space軟件的文獻研究發(fā)現(xiàn),絞股藍皂苷類成分是國內外近年來有關絞股藍的研究熱點[2]。相關藥理學研究表明,作為絞股藍中的高營養(yǎng)成分,絞股藍皂苷具有抗炎、抗衰老、降糖調脂、護心護肝等多方面作用[3-5]。課題組的前期實驗還發(fā)現(xiàn),絞股藍皂苷不僅能促進成骨細胞的增殖分化,而且對H2O2誘導的成骨細胞氧化應激損傷具有保護作用[6-7]。然而,有關絞股藍活性成分在C2C12細胞成肌分化方面的研究相對較少;因此,本研究以小鼠C2C12細胞株為研究對象,擬探尋絞股藍皂苷對其成肌分化的影響,旨在從細胞層面豐富肌骨同治的理論內涵[8]。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

C2C12細胞購于中科院細胞庫(目錄號GNM26),它是小鼠成肌細胞株的亞克隆,在一定條件下能夠分化為可伸縮的肌管并生成特征性的肌蛋白。

1.2 實驗藥物

絞股藍皂苷購自曼斯特生物科技有限公司(成都),規(guī)格20 mg,批號MUST-21070818,純度為98.00 %。

1.3 主要儀器與試劑

徠卡倒置熒光顯微鏡SOP(型號:DMI 3000B),全波長酶標儀(型號:Multiskan GO),全能凝膠成像儀(型號:ChemiDoc MP),奧林巴斯倒置熒光顯微鏡(型號:IX73)。

DMEM培養(yǎng)基(含4.5 g/LD-葡萄糖)、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗(Gibco),Horse Serum(VivaCell),4 %多聚甲醛、PBST緩沖液(biosharp),抗體MYF5、抗體MyoD1(Affinity),Triton?X-100(biofroxx),山羊抗兔IgG H&L(Abcam),β-Actin Rabbit mAb(CST),CCK-8試劑、BSA、PVDF膜、抗熒光淬滅封片劑含DAPI(Beyotime),改進型促凝劑、快速封閉液、RIPA裂解液、彩色凝膠快速試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑盒(新賽美)。

1.4 實驗方法

1.4.1溶液配制:完全培養(yǎng)基:89 % DMEM培養(yǎng)基+10 %胎牛血清+1 %雙抗;成肌分化培養(yǎng)基:96 % DMEM培養(yǎng)基+3 % Horse Serum+1 %雙抗[9];絞股藍皂苷稀釋液:20 mg的絞股藍皂苷溶解于二甲基亞砜(DMSO)成為母液,鑒于DMSO對細胞可能的毒性作用及前期研究基礎,將上述溶液至少稀釋200倍,設置濃度梯度為160 mg/L、80 mg/L、40 mg/L、20 mg/L和10 mg/L。

1.4.2C2C12細胞培養(yǎng):將預先分裝于液氮罐儲存的C2C12細胞取出1管復蘇,培養(yǎng)皿中用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)復蘇的C2C12細胞,置于37 ℃、含5 % CO2的培養(yǎng)箱中孵育,固定倍數(shù)鏡下觀察細胞的貼壁及生長狀況,待細胞生長至覆蓋培養(yǎng)皿面積的70 %～80 %再予以傳代,每兩天換液1次。

1.4.3C2C12細胞分化:胰酶消化C2C12細胞后,以5×104/mL的密度接種于96孔板和6孔板,培養(yǎng)基以鋪滿孔底為宜,分別為100 μL/孔和1 mL/孔;隔日在顯微鏡下觀察細胞貼壁情況,再更換為含不同濃度絞股藍皂苷的分化培養(yǎng)基誘導分化,96孔板中各濃度均設置3個復孔,每兩天換液1次,5 d后觀察細胞分化形態(tài),CCK-8法檢測各濃度下細胞的分化活力。

1.4.4Western Blot檢測:顯微鏡下觀察6孔板細胞分化形態(tài)后,棄培養(yǎng)基,PBS清洗2次,加入預先配制好的裂解液后于冰上裂解,10 min后用刮板分別刮取各孔,收集蛋白于1.5 mL的EP管中,再經(jīng)超聲、離心等步驟后取上清,測定各蛋白濃度,最后使用PCR儀煮蛋白后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。通過電泳、轉膜、封閉、孵育抗體、顯影等一系列操作完成Western blot檢測。

1.4.5免疫熒光檢測:胰酶消化C2C12細胞后,以3×104/mL的密度接種于48孔板,含培養(yǎng)基量150 μL/孔;細胞貼壁后即予以含不同濃度絞股藍皂苷的分化培養(yǎng)基培養(yǎng),每兩天換液1次,待細胞分化為肌管后即行免疫熒光染色(5 d)。首先進行固定、通透、封閉等步驟,然后用一抗于4 ℃冰箱孵育過夜,PBS漂洗3次,暗環(huán)境下加入熒光二抗,室溫避光孵育1 h,最后用含DAPI的封片液染色1 min,倒置熒光顯微鏡下觀察目的蛋白的表達,Image J軟件進行熒光定量。

1.5 統(tǒng)計學處理

利用GraphPad Prism 9.0軟件進行相關統(tǒng)計,并繪制柱狀圖,各組間的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 C2C12細胞分化活力

預實驗發(fā)現(xiàn)使用160 mg/L濃度的絞股藍皂苷干預細胞時,顯微鏡下見細胞大面積死亡,故舍棄該濃度,再按濃度梯度增加5 mg/L的濃度進行后續(xù)實驗。CCK-8法檢測細胞分化活力,即在96孔板中每孔加入10 μL CCK-8溶液,37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h,最后在設置OD值為450 nm的酶標儀上檢測各孔的吸光度,按照細胞活力計算公式[10]計算各濃度的活力百分比。如圖1顯示,相較于空白對照組,80 mg/L濃度下的細胞活力偏低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖1 細胞活力(OD)Fig.1 Cell viability(OD)

2.2 C2C12細胞分化形態(tài)

用含不同濃度絞股藍皂苷的分化培養(yǎng)基誘導分化C2C12細胞,第5天可見細胞分化為辨識度較高的肌管形態(tài)[11]。鏡下見80 mg/L濃度下細胞的分化較少,形態(tài)不夠典型,其余濃度絞股藍皂苷干預下的C2C12細胞則呈現(xiàn)出較為明顯的分化。詳見圖2。

圖2 細胞分化Fig.2 Cell differentiation

2.3 Western blot檢測

由于80 mg/L濃度下的C2C12細胞活力及分化程度較低,故在后續(xù)實驗中舍棄該濃度。收集分化第5天的細胞蛋白進行Western blot檢測,選用具有代表性的成肌標志物MYF5和MyoD1作為一抗[12],β-actin為內參,全能凝膠成像儀上顯影,結果見圖3。經(jīng)Image J和GraphPad Prism軟件統(tǒng)計分析,MYF5和MyoD1相對于β-actin的蛋白表達量如圖4所示,其中10 mg/L和5 mg/L濃度下的相對表達量相較于Control組差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其余各組間的差異則無統(tǒng)計學意義。

圖3 Western Blot 結果Fig.3 The results of Western Blot

圖4 相對表達量Fig.4 Relative expression

2.4 免疫熒光染色

48孔板上用分化培養(yǎng)基誘導分化C2C12細胞,顯微鏡下見細胞分化為肌管形態(tài)即行免疫熒光染色,每個濃度設1個復孔,奧林巴斯倒置熒光顯微鏡下觀察目的蛋白MyoD1的表達及細胞核的染色情況,見圖5。計算各個濃度下的融合指數(shù)(fusion index),即位于陽性肌管內的細胞核數(shù)與總細胞核數(shù)的比值[13]。如圖6顯示,10 mg/L和5 mg/L濃度干預下的肌管融合指數(shù)均明顯高于Control組,且10 mg/L和40 mg/L濃度之間的融合指數(shù)差異也具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖6 肌管融合指數(shù)(%)Fig.6 Fusion index of myotube(%)

3 討論

研究結果表明,10 mg /L和5 mg/L濃度的絞股藍皂苷能夠明顯促進C2C12細胞的成肌分化;不僅表現(xiàn)為分化的肌管形態(tài)清晰典型、融合指數(shù)更高,而且相關成肌標志物的表達也最為顯著,差異具有統(tǒng)計學意義。此外,本研究還補充了課題組前期絞股藍作用于骨骼肌相關實驗的空白,從而在體外實驗進一步闡明了單體絞股藍皂苷對成肌成骨的分化均有一定的促進作用。

成肌細胞是骨骼肌的前體細胞,具備較強的增殖分化能力,而小鼠的C2C12細胞株經(jīng)Horse Serum誘導可分化為多核的肌管形態(tài),并表達相關的蛋白標志物;因此,C2C12細胞株是研究成肌分化的優(yōu)越模型之一[12,14]。研究發(fā)現(xiàn),肌源性調節(jié)因子(myogenic regulator factors,MRFs)在骨骼肌的增殖及分化過程中起著重要作用,它包括成肌調節(jié)因子5(myogenic factor 5,MYF5)、肌分化因子(myogenic differentiation,MyoD)和肌生成素(myogenin,MyoG)等[15]。其中MyoG一般在肌細胞的分化末期表達,而MYF5和MyoD主要參與初期分化的調控[16-17],并且MYF5表達最早,還能進一步激活MyoD的表達,從而標志著肌衛(wèi)星細胞分化周期的開始[18]。肌衛(wèi)星細胞是C2C12細胞在骨骼肌中的主要存在形式,經(jīng)過增殖分化等過程可融合為肌管,最終變?yōu)榧±w維形態(tài)[19-20]。本研究專注于表征肌細胞分化早期的MYF5和MyoD兩種因子,通過Western blot和免疫熒光檢測等手段說明了一定濃度的絞股藍皂苷能夠促進相關肌源性因子的表達,從而有利于成肌分化;尤其是MyoD代表著肌細胞分化進程的開端,在骨骼肌的分化中扮演關鍵角色[21],加用肌管融合指數(shù)等分化參數(shù)進行實驗驗證,具有較強的說服力。且有研究表明,若下調MyoD的水平會導致分化抑制[15],更加突出了MyoD的重要性。但是本研究未涉及象征分化終期MyoG因子的相關指標,后續(xù)可以進一步檢測證明。

絞股藍最早僅被作為食用,直至《本草綱目》始逐漸發(fā)現(xiàn)其藥用價值,2002年被我國收錄為藥食同源保健品后便引發(fā)諸多學者的關注與研究[22-23]。絞股藍的活性成分包括皂苷類、多糖和黃酮類等,其中尤以皂苷類成分為研究熱點之一。研究發(fā)現(xiàn),絞股藍皂苷的相關活性成分可抑制細胞生長及遷移,有一定的抗腫瘤作用[24-25];周文超[26]在絞股藍中發(fā)現(xiàn)了一種三萜皂苷類物質,并發(fā)現(xiàn)其具有抗炎活性;雷婧等[27]發(fā)現(xiàn)絞股藍皂苷能有效降低大鼠的血脂水平,萬俊陽等[28]通過對ApoE-/-小鼠的研究提出了絞股藍皂苷可以調控鐵死亡降低肝臟的脂質沉積。除此以外,還有研究發(fā)現(xiàn),絞股藍皂苷類成分可以抑制活性氧的產生及細胞凋亡標志物的表達,從而起到抗衰老作用[29];或通過調控lnc RNA/miRNA相關通路延緩骨關節(jié)炎軟骨細胞的損傷[30]。然而,目前對于絞股藍在肌肉組織方面的相關研究較少,本研究及課題組前期研究在細胞層面為單體絞股藍皂苷對成肌成骨的作用提供了一定的參考價值,但是其濃度設置仍可優(yōu)化,分子機制也有待闡明與論證。